Medicina Veterinaria y Zootecnia · 2019
Análisis molecular del gen SLA-DRB1 en una pòblación de porcinos en la sede Remanso - UDCA
Introducción: El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) juega un papel importante en la respuesta de patógenos y control de autoinmunidad. Este se divide en clase I y II y consiste en un conjunto de genes que codifican glicoproteínas de superficie de membrana llamadas antígenos leucocitario porcinos o SLA. En la clase II, el SLA-DR y SLA-DQ son funcionales y se encargan de presentar péptidos exógenos a las células T CD4+. Específicamente, el antígeno leucocitario porcino (SLA) es una molécula codificada por el gen SLA-DRB1, la cual tiene una función importante en la respuesta vacunal y en resistencia a enfermedades. En esencia, estas proteínas ayudan al sistema inmunitario a diferenciar entre sus propias células y sustancias extrañas, asegurando así, una respuesta capaz de defender al organismo. La presente investigación se enfocó en el análisis del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II), específicamente el gen DRB1 en la población de porcinos de la sede el Remanso U.D.C.A. Considerando que en esta sede la población estudio es derivada de líneas comerciales (en su mayoría SuperMom 52 (SM52)) y teniendo en cuenta que en Colombia no se han realizado estudios de tipificación de SLA DRB1 (exón II), con este trabajo se realizó una primera exploración de este gen con el fin de conocer los polimorfismos presentes en la población estudio. Materiales y métodos: Se tomó muestra de sangre venosa a 31 animales y se realizó extracción de ADN utilizando un kit comercial. Posteriormente, se amplificó un fragmento de 328 pb para el gen DRB1 usando PCR convencional. Como control interno se amplificó el gen (α-Actin) de 498 pb. Los amplicones fueron purificados y enviados a secuenciar, los resultados fueron analizados por métodos bioinformáticos. Como método adicional se realizó clonación molecular. Resultados y discusión: Se obtuvo 31 secuencias referentes a cada individuo muestreado. Los alelos encontrados fueron DRB1*10:01:01, DRB1*10:01:02, DRB1*01:01, DRB1*01:02, DRB1*02:01:01, DRB1*06:01. En los cerdos de las líneas SuperMom 52, Línea 410 PIC y Cruce SM52 x 410 PIC estudiados en este trabajo se encontró que el alelo DRB1*10:01:01 tuvo una frecuencia del 58.52% de la totalidad de los alelos encontrados, siendo así, el alelo más común en la población (24/31 animales). Además, se encontró un porcentaje alto de individuos homocigotos 67.74% (21/31 animales) frente a un porcentaje de individuos heterocigotos 32.25% (10/31 animales). Los datos anteriores arrojaron un alto grado de consanguinidad en la población, sin embargo, se requiere de un estudio genético más profundo. Conclusiones: 1. La información obtenida en este trabajo es esencial para comprender la frecuencia alélica del gen SLA-DRB1 en la población de cerdos de la sede el remanso de la U.D.C.A y, por lo tanto, será útil para profundizar en el estudio de la respuesta inmune y desarrollar vacunas alternativas para los nuevos retos epidemiológicos de la población. 2. El alelo con mayor frecuencia fue el DRB1*10:01:01 (24/31 animales), que, junto con la proporción de individuos homocigotos dan un panorama general del nivel de diversidad genética en cuanto al sistema inmune de la población estudio. 3. A pesar de que el método molecular no arrojo los resultados esperados, es el primer acercamiento a la clonación celular del gen SLA DRB1 (exón II) en la especie porcina colombiana.
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Contenido
- 1. INTRODUCCIÓNp. 6
- 2. OBJETIVOSp. 9
- Generalp. 9
- Objetivos Específicosp. 9
- 3. REVISIÓN DE LITERATURAp. 10
- 3.1. Mapa cromosómicop. 11
- 3.2. Variabilidadp. 13
- 3.3 Métodos de identificaciónp. 14
- 4. MATERIALES Y METODOSp. 19
- Lugar de estudiop. 19
- Tamaño de muestrap. 19
- Análisis de muestrasp. 19
- Toma de muestrap. 19
- Proceso de extracciónp. 21
- Tipificación de SLA-DRB1 por método de PCR convencionalp. 24
- Análisis de secuenciasp. 27
- Análisis estadísticop. 28
- Proceso de clonaciónp. 28
- 5. RESULTADOSp. 33
- ADN genómicop. 33
- Cuantificaciónp. 33
- Amplificación del SLA-DRB1 (exon II) y α Actinp. 34
- Determinación de homocigotos y heterocigotosp. 36
- Secuencia consensop. 36
- Identificación de alelosp. 38
- Análisis estadísticop. 28
- Clonación de SLA-DRB1 (exón II) en vector pELMOp. 41
- Extracción de vector pELMOp. 28
- Digestión enzimáticap. 42
- PCR convencional y purificación de vector e insertop. 43
- Transformaciónp. 30
- PCR de coloniap. 31
- Análisis de secuencias de plásmidop. 48
- 6. DISCUSIÓNp. 49
- 7. CONCLUSIONESp. 57
- 8. BIBLIOGRAFÍAp. 58
- 9. ANEXOSp. 63
- Figura 1. Cristalografía del SLA-DRp. 12
- Figura 2. PCR-SSPp. 17
- Figura 3. PCR Multiplexp. 18
- Figura 4. Toma y almacenamiento de las muestras sanguíneasp. 20
- Figura 5. Extracción y cuantificación del DNAp. 23
- Figura 6. Electroforesis en gel de agarosap. 24
- Figura 7. Estructura del Vector pELMOp. 28
- Figura 8. Fórmula para ligación enzimáticap. 30
- Figura 9. Resumen visual del proceso de clonación celularp. 32
- Figura 10. Electroforesis de ADN genómico muestras 1-13p. 34
- Figura 11. Electroforesis de ADN genómico muestras C1-C11p. 34
- Figura 12. Electroforesis de producto de PCRp. 35
- Figura 13. Producto de PCR con cebadores α actin y SLA MIXp. 36
- Figura 14. Electroferograma de las secuencias consensop. 37
- Figura 15. pELMO extraídop. 42
- Figura 16. Corte enzimático de pELMOp. 43
- Figura 17. Purificación de productos PCRp. 44
- Figura 18. Colonias recombinantesp. 45
- Figura 19. Replicación de colonias recombinantesp. 45
- Figura 20. Siembra células JM109p. 46
- Figura 21. PCR de coloniap. 46
- Figura 22. PCR de colonia con plásmido purificadop. 47
- Figura 23. Electroferograma de secuencia recombinantep. 48
- Tabla 1. Información de la población porcina sede El remansop. 21
- Tabla 2. Lista de cebadores SLA y α- actinp. 25
- Tabla 3. Cuantificación de ADNp. 33
- Tabla 4. Analogía de secuenciasp. 38
- Tabla 5 Distribución en porcentajep. 40
- Tabla 6. Distribución de los alelos en la población de la sede El Remansop. 41
- Tabla 7. Concentraciones de pELMO extraídop. 42
- Tabla 8. Cuantificación de productos purificadosp. 44
- Tabla 9. Identificación de alelos con método Haplofinderp. 55