CORPORACION TECNOLOGICA DE BOGOTA

MONOGRAFIA DE GRADO

MICROORGANISMOS COMO HERRAMIENTA PARA MINIMIZAR EL IMPACTO AMBIENTAL

POR DERRAME DE HIDROCARBUROS

BOGOTA, MAYO

2022

TECNOLOGIA EN QUÍMICA INDUSTRIAL

PRESENTADO POR

MARÍA FERNANDA NOVOA GARCÍA

MONOGRAFÍA PARA OPTAR AL TÍTULO DE TECNÓLOGO EN QUÍMICA INDUSTRIAL

DIRECTOR

YUVER ALEJANDRO BELTRAN

CORPORACION TECNOLOGICA DE BOGOTA

TECNOLOGIA DE QUÍMICA INDUSTRIAL

BOGOTA,

MAYO 2022

CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................................. 7

1. INTRODUCCION .................................................................................................................. 10

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................. 12

3. JUSTIFICACION ................................................................................................................... 14

4. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 15

4.1 Objetivo general ............................................................................................................... 15 4.2 Objetivos específicos ....................................................................................................... 15

5. ANTECEDENTES ................................................................................................................. 16

6. MARCO REFRENCIAL ......................................................................................................... 20

7. METODOLOGIA ................................................................................................................... 24

8. GENERALIDADES DEL SUELO Y LOS HIDROCARBUROS .............................................. 25

8.1 El suelo ............................................................................................................................ 25 8.2 Hidrocarburos .................................................................................................................. 28 8.2.1 Estructura orgánica de los hidrocarburos ...................................................................... 28 8.2.2 Tipos de hidrocarburos ................................................................................................. 29 8.2.3 Propiedades físicas de los hidrocarburos ...................................................................... 31 8.2.4 Propiedades químicas de los hidrocarburos .................................................................. 31 8.2.5 Impacto ambiental de los hidrocarburos en el suelo y el agua ...................................... 32

9. GENERALIDADES DE LOS MICROORGANISMOS ............................................................ 34

9.1 La biorremediación .......................................................................................................... 36 9.1.1 Técnicas de Biorremediación con Microorganismos ..................................................... 38 9.2 Microorganismos degradadores de hidrocarburos ........................................................... 43 9.2.1 Bacterias ....................................................................................................................... 45 9.2.2 Hongos ......................................................................................................................... 52 9.2.3 Algas y Protozoos ......................................................................................................... 53 9.3 Factores que influyen en la degradación de hidrocarburos .............................................. 53

10. RUTAS METABÓLICAS ..................................................................................................... 55

10.1 Degradación anaeróbica ................................................................................................ 56 10.2 Degradación aerobia ...................................................................................................... 57 10.3 Degradación de hidrocarburos alifáticos en presencia de oxígeno ................................. 58 10.4 Degradación de alcanos de cadena ramificada .............................................................. 61 10.5 Rutas de degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) .......................... 61

10.6 Reducción de hidrocarburos aromáticos ........................................................................ 63 10.7 Reducción de hidrocarburos alifáticos ............................................................................ 64 10.8 Rutas de degradación de las Pseudomonas .................................................................. 65  Degradación (C6 a C12 n- alcanos) ................................................................................ 66  Degradación tolueno ....................................................................................................... 67

11. EFICIENCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN DEGRADACION DE HIDROCARBUROS

.................................................................................................................................................. 69

12. CONCLUSIONES................................................................................................................ 78

13. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 80

LISTADO DE FIGURAS

Figura 1. Estructura del suelo .................................................................................................... 26 Figura 2. Estructura de los hidrocarburos .................................................................................. 29 Figura 3. Las cianobacterias fijan el CO2 ambiental y liberan oxígeno ...................................... 35 Figura 4: Microorganismos degradadores de hidrocarburos derivados del petróleo .................. 36 Figura 5. Ilustración proceso biorremediación. ......................................................................... 37 Figura 6. Esquema Landfarming ............................................................................................... 42 Figura 7. Clasificación de las bacterias ..................................................................................... 46 Figura 8. Pseudomona aureginosa en agar bajo luz UV ............................................................ 48 Figura 9. Estructura general de los ramnolipidos ....................................................................... 49 Figura 10. Degradación anaeróbica de los hidrocarburos: ........................................................ 57 Figura 11: Degradación de la aeróbica de los hidrocarburos ..................................................... 58 Figura 14. Rutas de degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) .................... 62 Figura 15. Reducción de hidrocarburos aromáticos ................................................................... 64 Figura 16. Reducción de hidrocarburos alifáticos ...................................................................... 65 Figura 17. Degradación de alcanos ........................................................................................... 66 Figura 18. Degradación del Tolueno.......................................................................................... 67 Figura 19. Grupos bacterianos seleccionados para biorremediación ......................................... 71 Figura 20. Porcentaje de remoción del hidrocarburo del petróleo .............................................. 72 Figura 21. Pictograma del Diesel ............................................................................................... 76 Figura 22. Espectrofotograma de la Gasolina ............................................................................ 76

LISTADO DE TABLAS

Tabla 1. Composición química del petróleo. .............................................................................. 30 Tabla 2. Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación In situ y Ex situ ................. 38 Tabla 3. Microorganismos degradadores de hidrocarburos ....................................................... 44 Tabla 4. Enzimas degradadores de hidrocarburos .................................................................... 55 Tabla 5. Eficiencias del Hongo Penicillium janthinellum en la degradación de hidrocarburos .... 74

RESUMEN

En sus procesos metabólicos los microorganismos transforman los nutrientes que obtienen del ambiente en sustancias más simples, y en este proceso obtienen alimento y energía que utilizan para su subsistencia. Existen microorganismos capaces de nutrirse a partir de hidrocarburos, detergentes o bifenilos policlorados, de manera que su metabolismo los convierte en productos inocuos para el medio ambiente, este proceso natural que realizan ciertos microorganismos al degradar compuestos que provocan desequilibrio en el medio ambiente, bien sea en suelo, sedimento o agua, es lo que se conoce como biodegradación. La gran diversidad de organismos existentes y sus interacciones microbianas generan una gran

variedad de estrategias de descontaminación, microorganismos como las bacterias y hongos

son un factor importante en este proceso, estos son los encargados de reducir las cadenas largas que componen los hidrocarburos y hacerlas más simples para que su descomposición sea más rápida y efectiva. (Braibant, 2014).

En este sentido, se analizan cuáles son los tipos de microorganismos con mayor eficiencia en el proceso de remediación de hidrocarburos, entre ellos están organismos como las Pseudomonas, Rhodococcus, hongos, pues al igual que las bacterias, algunos de ellos tienen gran capacidad de degradación, entre los más utilizados en la remediación están: Aspergillus, Amorphoteca, Neosartoria, Paecilomyces, Penicillium entre otros. . (Torres, 2003). Por otra parte, se destacan las rutas metabólicas, que ponen en contexto el proceso químico originado al momento de la degradación, entender estos procesos metabólicos es de gran importancia pues es la razón principal por la que los microorganismos son degradadores, este paso a paso para la degradación de un contaminante requiere que se utilicen diferentes especies de enzimas como las peroxidasas, oxidasas, reductasas, hidroxilasas y deshidrogenasas.

Es importante destacar que las rutas de biodegradación de los contaminantes orgánicos cambian de acuerdo con la estructura química del compuesto y de las especies microbianas degradadoras, por lo que existan multitud de vías metabólicas para la degradación de los hidrocarburos. (Sanabria, 2018)

Por último, se aborda la eficiencia de los de microorganismos en la recuperación de sitios contaminados con diferentes clases de hidrocarburos, esto se hace mediante la revisión de diferentes artículos de investigación y estudios de caso de EE.UU, Perú, Ecuador y en Colombia un estudio de laboratorio de la Universidad libre, donde se demuestra cuantitativamente los resultados obtenidos.

ABSTRACT

In their metabolic processes, microorganisms transform the nutrients they obtain from the environment into simpler substances, and in this process they obtain food and energy that they use for their subsistence. There are microorganisms capable of nourishing themselves from hydrocarbons, detergents or polychlorinated biphenyls, so that their metabolism converts them into harmless products for the environment, this natural process carried out by certain microorganisms when degrading compounds that cause imbalance in the environment, either in soil, sediment or water, is what is known as biodegradation. The great diversity of existing organisms and their microbial interactions generate a great variety of decontamination strategies, microorganisms such as bacteria and fungi are an important factor in this process, they are responsible for reducing the long chains that make up hydrocarbons and making them simpler. so that its decomposition is faster and more effective. (Braibant, 2014). In this sense, the types of microorganisms with greater efficiency in the hydrocarbon remediation process are analyzed, among them are organisms such as Pseudomonas, Rhodococcus, fungi, because, like bacteria, some of them have a great capacity for degradation. , among the most used in remediation are: Aspergillus, Amorphoteca, Neosartoria, Paecilomyces, Penicillium among others. . (Towers, 2003).

On the other hand, the metabolic routes are highlighted, which put in context the chemical process originated at the time of degradation, understanding these metabolic processes is of great importance since it is the main reason why microorganisms are degraders, this step by step to the degradation of a contaminant requires the use of different species of enzymes such as peroxidases, oxidases, reductases, hydroxylases and dehydrogenases. It is important to note that the biodegradation routes of organic pollutants change according to the chemical structure of the compound and the degrading microbial species, so there are many metabolic pathways for the degradation of hydrocarbons. (Sanabria, 2018) Finally, the efficiency of microorganisms in the recovery of sites contaminated with different types of hydrocarbons is addressed, this is done through the review of different research articles and case studies from the USA, Peru, Ecuador and Colombia. laboratory study of the free University, where the results obtained are quantitatively demonstrated.

1. INTRODUCCION

Es innegable que la industria de los hidrocarburos en el último siglo ha evolucionado de manera vertiginosa y significativa, impulsando con ella el desarrollo industrial, económico y científico en el mundo. Sin embargo, los hidrocarburos y en especial el petróleo se han convertido en las principales fuentes de contaminación, generando problemas de alto impacto en el medio ambiente.

Es por esto que esta monografía busca recopilar información de diferentes fuentes bibliográficas, a cerca de la importancia de los de los microorganismos en el proceso de recuperación ambiental por derrames de hidrocarburos. Para ello se identifican cuáles son esos microorganismos que se destacan por su capacidad degradativa, cuáles y como son sus rutas metabólicas, al igual se analizó, desde diferentes fuentes bibliográficas, la eficiencia microorganismos como bacterias y hongos seleccionados para la investigación de dicha eficiencia en los diferentes procesos de biorremediación, ya sean inoculados o autóctonos para degradar los contaminantes en suelo y/o agua.

Saber que existen métodos naturales para remediar los daños ambientales ocasionados por diferentes causas como: derrames de hidrocarburos durante el transporte, ruptura de tuberías, accidentes en refinerías, liberación irresponsable en el medio ambiente y hasta ataques terroristas como sucede en nuestro país, son de gran motivación para dar a conocer a fondo esta metodología. Estos sistemas de descontaminación se basan en la absorción de las sustancias orgánicas por parte de ciertos microorganismos, para ser utilizadas por estos como fuente de carbono necesaria para su subsistencia. (Torres, R.D. 2003) De acuerdo con EPA (2004) citado en Petro (2014) “Este bioproceso de remediación surge como una tecnología prometedora, se basa en la premisa de que un gran porcentaje de los componentes del petróleo son biodegradables en la naturaleza, además de presentar varias ventajas potenciales sobre las tecnologías convencionales, como menor costo, son menos intrusivos en el sitio contaminado, más respetuosas con el medio ambiente en términos de sus productos finales y requieren de un mínimo o ningún tratamiento posterior” En este sentido este documento tiene como objetivo, mediante el análisis de fuentes bibliográficas establecer: los microorganismos más empleados en remediación, sus rutas

metabólicas y la eficiencia o resultados obtenidos durante la aplicación de microorganismos para la degradación de hidrocarburos.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los hidrocarburos han estado presentes en la vida del hombre desde hace millones de años, se habla de su existencia en Roma siglos antes de Cristo, en América concretamente en EEUU, se presume que la primera explotación de petróleo se hizo en Pensilvania hacia el año 1859, dando inicio así a la era del recordado “Oro Negro”, desde entonces la evolución tanto en la forma y métodos de extracción, como en los productos obtenidos en los diferentes procesos de producción ha sido vertiginosa. (Zobel, 1946). El petróleo y sus derivados se han convertido en base fundamental para una gran cantidad de industrias, pasando por los medios de transporte, combustibles, la industria de los plásticos, solventes, fertilizantes, y hasta la industria cosmética, en la que hasta hace muy poco fue prohibida su utilización como materia prima. (Narváez- Flórez, Gómez, & Martinéz, 2008).

Lo anterior es una pequeña reseña para entender que la industria de los hidrocarburos es vital y fundamental en la vida del hombre, tanto en su subsistencia básica mediante el uso del combustible, como en la economía a través de las grandes industrias fuentes de trabajo, y hasta la política internacional gira en torno a esta gran industria, es innegable que sin ellos la subsistencia del humano estaría en riesgo.

En contraposición a los beneficios de los hidrocarburos, tenemos aquí el impacto negativo y la amenaza que también representan para el medio ambiente, y en general para la salud del hombre. Los Hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmosfera afectado las propiedades fisicoquímicas del suelo, como el pH, la permeabilidad, evaporación y perdida de capa vegetal, generando cambios en el habitad de la fauna y en general en los entornos ambientales (Siva S, 2004).

Por ello se hace necesario conocer desde la profesión de la Química Industrial, qué nuevas propuestas y diferentes planteamientos hay para mitigar los impactos ambientales ocasionados por derrames de hidrocarburos; tal es el caso de la biorremediación por microorganismos que degradan los hidrocarburos, opción biológica y saludable que permite potencializar el recurso que nos brindan los microorganismos a través de su metabolismo.

Queda entonces preguntarse: ¿Son los microorganismos una alternativa para minimizar el impacto ambiental producido por derrames de hidrocarburos?

3. JUSTIFICACION

Mediante esta monografía se busca conocer la importancia de los microorganismos como degradadores de hidrocarburos y su impacto en el medio ambiente, pretende no solo analizar lo descrito sobre clases, técnica, eficiencia, si no que busca indagar cómo se desarrollan estos interesantes procesos naturales, que son aprovechados por la humanidad en pro de ayudar a la compleja problemática de la contaminación ambiental.

Es fundamental profundizar en las soluciones biológicas que ofrece la naturaleza para minimizar el impacto ambiental producido por los derrames de hidrocarburos, especialmente en nuestro país. Es entonces que desde la academia se da la oportunidad de analizar este tema tan relevante y de interés para los futuros profesionales ya que no debe ser ajena, desde ningún punto de vista, la problemática ambiental generada en este caso por derrames de hidrocarburos.

Estas consideraciones fundamentan este escrito, y es por ello que mediante la recopilación bibliográfica se examina y resalta la importancia de los microorganismos en los procesos de remedición de hidrocarburos. Los procesos de biorremediación ofrecen una gran variedad de opciones para ser analizadas, no solo por la gran cantidad de organismos y sus diferentes propiedades, sino por todas las variables existentes como la composición del suelo, el agua, los mismos contaminantes presentes en los hidrocarburos. Entender y conocer todas estas variables permite dimensionar la función que cumplen los microorganismos, disminuir el daño ambiental por derrame de hidrocarburos generando un menor impacto al medio ambiente, al hombre y las comunidades en general, permite ver de manera diferente el comportamiento de los microorganismos.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Analizar mediante la consulta y selección de fuentes bibliográficas, el uso y la eficiencia de microorganismos como herramienta para disminuir el impacto ambiental producido por el derrame de hidrocarburos.

4.2 Objetivos específicos

• Identificar mediante la consulta de diferentes fuentes bibliográficas, los tipos de microorganismos aptos para el proceso de degradación de hidrocarburos.

• Recopilar información a partir de fuentes bibliográficas, sobre las rutas metabólicas existentes usadas por los algunos microorganismos que permiten la degradación de ciertos hidrocarburos.

• Dar a conocer resultados reportados en diferentes fuentes bibliográficas, sobre la eficiencia de los microorganismos en derrames de petróleo y la reducción del impacto ambiental cuando se emplean este tipo de agentes biológicos.

5. ANTECEDENTES

(García 2019) Desarrolló la investigación “Biorremediación de hidrocarburos en aguas residuales con cultivo mixto de microorganismos: caso Lubricadora Puyango” el objetivo fue evaluar el proceso de biorremediación de hidrocarburos totales en las aguas residuales de Putumayo. Se realizó una caracterización de las aguas residuales, adicional a esto se determinó el contenido de hidrocarburos totales de petróleo y el caudal durante siete días, se aplicó un tratamiento consistente en una mezcla de bacterias: Acinetobacter sp., Pseudomona sp., y Mycobacter sp en forma sólida (tableta de 80 g) con una concentración mínima de 4 x 108 UFC/ml soluble en agua, utilizando dos tabletas por cada 30 días. Se determinó la concentración de los hidrocarburos totales cada semana haciendo la cuantificación en porcentaje de remoción. Los resultados mostraron que la técnica de bioaumentación efectiva en la remoción de hidrocarburos totales bajo ciertas condiciones estuvo por encima del 86 %. El tiempo de mayor remoción de los hidrocarburos totales se obtuvo a la tercera semana con un

92 %.

Ordoñez (2018) Desarrolló la investigación “Biodegradación de hidrocarburos alifáticos saturados por microorganismos aislados de suelo contaminados con derivados de petróleo” El propósito u objetivo fue determinar la capacidad de los microorganismos propios del suelo que ha sido contaminado por derrames de petróleo para degradar el queroseno. Se seleccionaron dos cepas de microorganismos previamente aisladas de un suelo expuesto a derivados del petróleo, donde se evidenció resistencia o tolerancia al contaminante. Se realizaron pruebas de concentración mínima inhibidora (CMI), para la remoción de hidrocarburos alifáticos saturados. La cepas seleccionadas e identificadas fueron Candida metapsilosis SH1 y Burkholderia cepacia SH3, que presentaron tolerancia a concentraciones superiores al 10 % del queroseno, se analizaron los resultados mediante un cromatógrafo acoplado a un detector de masas y se analizó comparando abundancias relativas, demostrando así la capacidad de los microorganismos en la biodegradación selectiva de hidrocarburos de cadena larga. Díaz (2020) Desarrolló la investigación “Técnicas de biorremediación de suelos contaminados con petróleo usando microorganismos” El objetivo fue recopilar información acerca de las técnicas de biorremediación de suelos contaminados con petróleo usando microorganismos. La metodología de esta investigación se realizó mediante la recopilación de 12 artículos

previamente leídos los cuales cumplieron con las características requeridas para el desarrollo de la investigación del autor. La recolección de datos se llevó a cabo con palabras claves, para lo cual se definieron criterios para la búsqueda mediante bases de datos como Scopus, ScienceDirect, SciELO, BASE. Los resultados obtenidos después de la revisión y comparación de los artículos que los porcentajes de degradación de las bacterias son altos posiblemente debido al número de microorganismos utilizados sin embargo alguno de los autores mencionó es sus estudios las desventajas de usar consorcios bacterianos por lo complicado de formarlos y evitar que compitan ente si por un lugar y sustrato. Para culminar se concluyó que la técnica más efectiva reportada es la bioestimulación y usando un solo microorganismo como la Pseudomona aeruginosa, mostrando degradaciones superiores al 75 % en 60 minutos. López (2006) Desarrolló la investigación “Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos derivados del petróleo” El objetivo de la revisión fue analizar la biorremediación como una alternativa “saludable” frente al deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente por el derrame de crudo, ya que esta problemática genera una amenaza real a la salud pública, así como la extinción de gran cantidad de especies vegetales y animales. Para el desarrollo del documento se reunió información a partir de fuentes bibliográficas, llegando a la conclusión que los microorganismos más eficientes para degradar los derrames de petróleo son las Comamonas acidovorans, Acinetobacter calcoaceticus, Achromobacter sp. Pseudomonas sp. Flavobacterium devorans, Bacillus lentus, Bacillus mascerans y Bacillus thuringensis. ha sido aplicada con buenos resultados.

Torres (2003) Desarrolló la investigación “El papel de los microorganismos en la biorremediación de los compuestos tóxicos” El objetivo fue estudiar el papel de los microorganismos en la degradación de compuestos xenobióticos. Su importancia desde el punto de vista ambiental, y estudiar los factores y mecanismos que afectan el proceso de degradación, así como las técnicas de biorrecuperación más comunes que se emplean en la actualidad. La investigación se realizó través de la revisión de artículos donde se explican y se analizan los experimentos realizados con las diferentes técnicas de biorremediación. En conclusión, en la contaminación de los suelos por presencia de los agentes tóxicos como los hidrocarburos, el uso de microorganismos constituye a una estrategia potencialmente viable, es así como el desarrollo de nuevas tecnologías está dirigido a aumentar la degradación de compuestos tóxicos, y el mejoramiento genético de los microorganismos para que se adapten a

lugares extremos, al igual que el desarrollo de diferentes técnicas biocorrectivas para la recuperación de suelos afectados por hidrocarburos.

Vilasó (2017) Desarrolló la investigación “Extracción de petróleo en el suelo contaminado empleando ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa. Se realizó un estudio de estabilidad de ramnolípidos considerando los factores de temperatura, pH y fuerza iónica. Los ramnilípidos fueron estables en las condiciones ensayadas, para esto se usó un diseño Box- Behnken para evaluar la influencia de las variables mencionadas y el tiempo de contacto en la remoción de petróleo de suelo contaminado, los tres factores influyeron incrementado la extracción al aumentar la temperatura y el tiempo de contacto, y disminuir el pH. La máxima extracción alcanzada fue de un 75 % Cando (2011) Desarrolló la investigación “Determinación y análisis de un proceso de biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos” El objetivo de la tesis fue analizar y determinar la factibilidad de un proceso biorremediación de hidrocarburos presentes en una matriz contaminada. Para esto se emplearon microorganismos nativos como los son las bacterias presentes en un matriz contaminada (lodos con crudo residual). Se comenzó con un diagnóstico, para esto se realizaron pruebas de actividad biológica y bioensayos, considerando tres tratamientos: terreno mineral y el microorganismo Streptomyces spp., Caldo nutritivo Tripticasa soya y el microorganismo Streptomyces spp., Consorcio microbiano no definido Streptomyces spp., y un bacilo gran positivo en caldo. Como conclusión general de esta investigación se pudo establecer que el mejor tratamiento en la biodegradación de hidrocarburos es tercer tratamiento con el consorcio microbiano.

(Xue, y otros, 2020) Desarrolló la investigación “Responses of seawater bacteria in the bioremediation process of petroleum contamination by immobilized bacteria” El objetivo de este artículo es poner a prueba la bacteria específica por medio de un alga, la bacteria usada fue Enteromorpha biochar, para el desarrollo de la metodología se inmovilizó esta bacteria y los nutrientes exógenos se usaron como biorremediación, pretendiendo tener una tasa de degradación del 97,3 % después de 30 días, la conclusión obtenida en este estudio es que este nuevo hallazgo podría servir como una nueva evidencia para aclarar la sucesión de la comunidad microbiana.

Lo anterior ha permitido enfocar y estructurar el planteamiento del problema así como los objetivos, y establecer el enfoque de la monografía hacia la eficiencia de los microorganismos como degradadores de hidrocarburos y su aporte a esta problemática ambiental.

6. MARCO REFRENCIAL

➢ Hidrocarburos: los hidrocarburos son compuestos orgánicos formados solo por átomos de carbono y átomos de hidrógeno. Las estructuras moleculares incluyen átomos de carbono en los que se adjunta un átomo de hidrógeno. Los hidrocarburos son compuestos básicos de la química orgánica. (De Lourdes, 2017).

➢ Petróleo: el petróleo es una sustancia viscosa, negra e inflamable que es líquida a temperatura y presión ambiente. Se forma a partir de la descomposición de la materia orgánica producida por la acción de los microorganismos, principalmente por el aumento de la temperatura, el enterramiento y el tiempo (millones de años). (Levorsen, 1980).

➢ Contaminación: la contaminación es la presencia de sustancias o elementos dañinos para la salud humana y el ecosistema. Esto puede afectar el agua, el suelo, el aire y otras partes del entorno donde viven las personas y otras organizaciones. Los agentes contaminantes comunes y cotidianos son los desechos sólidos domésticos e industriales, exceso de fertilizante y productos químicos, los desagües de aguas negras al mar o ríos, el monóxido de carbono de los vehículos. (Roldan, 2017) ➢ Biorremediación: es una rama de la biotecnología que aplica el uso de diferentes clases de microorganismos para eliminar contaminantes y toxinas tanto del suelo como el del agua. Está técnica permite limpiar ambientes contaminados con derrames de petróleo u otras clases de hidrocarburos (darwinbioprospecting, 2020) Los procesos de tratamiento biológico normalmente implican reacciones redox en olas que los contaminantes reducidos se oxidan y los contaminantes oxidados se reducen. Mediante esta técnica se pueden eliminar diferentes tipos de contaminantes: Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) petróleo, pesticidas, clorofenoles, metales pesados, colorantes, sulfatos, etc. (darwinbioprospecting, 2020).

➢ Biorremediación In Situ: este tipo de tratamiento normalmente es la opción más adecuada para la recuperación de suelos, ya que no es necesaria la preparación y excavación del material contaminado. Su ventaja es que tiene menores costos y a su vez genera menor generación de residuos en la superficie (Torres K, 2009) (Katerin & Tatiana, 2009)

➢ Biorremediación Ex Situ: es un método donde se excava el suelo, separando la porción contaminada y trasladándola a un reactor para ser tratada. Existen dos tratamientos diferentes cuando el procedimiento se realiza afuera del sitio de contaminación, tratamiento por vía sólida y tratamiento por vía en suspensión. La biorrecuperación vía sólida se puede realizar por dos métodos: tratamiento en lechos y tratamiento por compostaje. (Petro and Mercado,2014)

➢ Suelo: es un sistema estructurado y biológicamente activo que tiende a emerger en superficies influenciadas por el clima y los organismos vivos. Se trata de la inclusión de minerales, componentes orgánicos como: humus y sus derivados, biomasa viva y muerta, gas, partículas absorbentes de agua y espacio capilar. (Petro and Mercado, 2014). El suelo es la interfaz entre la tierra, el aire y el agua, lo que permite realizar funciones naturales. Proporciona nutrientes y tiene la capacidad de retención de agua. (Petro and Mercado, 2014)

➢ Impacto ambiental: el impacto ambiental es la alteración del medio ambiente, provocada directa o indirectamente por un proyecto o actividad en un área determinada, en términos simples. El impacto ambiental es la modificación del ambiente ocasionada por la acción del hombre o de la naturaleza, éste puede ser: positivo o negativo, directo o indirecto, residual, temporal, reversible o irreversible y sinérgico. ( Gestión en Recursos Naturales, 2018).

➢ Microorganismos: son pequeños seres vivos unicelulares, imperceptibles al ojo humano y requieren microscopios para visualizarlos y estudiarlos. La estructura del

microorganismo es una cosa muy simple y básica. Se trata de formas de vida mucho más simples que las plantas y los animales, que presentan características individuales y una organización biológica elemental. (Rico, 2009) ➢ Bacterias: son microorganismos unicelulares, por lo general su tamaño es de algunos micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 µm) y se presentan de diversas formas: esferas (cocos), barras (bacilos) y hélices (espirales), etc. Además, son muy abundantes en el planeta y pueden vivir en condiciones ambientales muy extremas. Son células procariotas con una estructura sencilla, no presentan núcleo y en general carecen de orgánulos membranosos internos. Suelen tener pared celular compuesta por peptidoglicano y algunas también presentan flagelos, u otros componentes que guardan similitud con este, que les permiten moverse. (Rico, 2009).

➢ Hongos: son organismos que tienen células con núcleo (eucariontes) y que requieren de otros seres vivos para obtener su alimento (son heterótrofos). Sus células poseen una pared gruesa de un compuesto (polisacárido) llamado quitina, el cual les provee rigidez y resistencia. La quitina también es el principal constituyente del exoesqueleto de los artrópodos. La mayoría de los hongos son pluricelulares y sus cuerpos están constituidos por filamentos tubulares microscópicos, denominados hifas, que se ramifican y entrecruzan. Un conjunto de hifas se conoce como micelio. (Guzmán, 1995).

➢ Metabolismo: reacciones químicas que producen células u organismos, se dan por una serie de reacciones que son catalizadas de manera enzimática constituyendo así las rutas metabólicas, cada uno de estos pasos que tienen como fin la ruta metabólica ocasiona un pequeño cambio específico, normalmente la eliminación, transferencia o adición de un átomo o un grupo funcional determinado. (“Metabolismo microbiano, 2011”).

➢ Degradar: se denomina degradar a la transformación de sustancias orgánicas que puedan existir en el menos ambiente por variedad de reacciones ya sean químicas, por redox, hidrólisis, por luz directa o bioquímicas. Cualquiera de las mencionadas anteriormente tiene la habilidad de transformar biológicamente las moléculas y cambiar

las condiciones fisicoquímicas del ambiente en el que se desarrollen, generando la biodegradación para llevar a cabo la eliminación completa de las sustancias que no pertenecen al medio ambiente. (Marketing online, 2021).

➢ Consorcio bacteriano: es una asociación natural de dos o más poblaciones microbiana de diferentes especies que actúan conjuntamente en un sistema complejo donde todos se benefician de las actividades de los demás.

➢ Aeróbico: representa un ambiente en el cual la vida (por ejemplo las bacterias) se sostiene en la existencia de oxigeno libre.

➢ Anaeróbico: ambiente donde el oxígeno es prácticamente inexistente, es también conocido como ambiente anóxico.

7. METODOLOGIA

Mediante una investigación básica y un enfoque cualitativo se señala la importancia y eficiencia de los microorganismos para minimizar el impacto ambiental por derrames de hidrocarburos, recopilando artículos científicos, artículos de investigación, libros y trabajos de grado, dónde se describen las rutas metabólicas, investigaciones experimentales, permitiendo identificar qué microorganismos lograron mayor eficiencia en la degradación de los hidrocarburos. Se realizaron búsquedas en distintas bases de datos como Scielo Brazil, Mexico, Esbcohost en inglés y español, ScienceDirect, Scopus y google académico usando palabras claves como: hidrocarburos, microorganismos, bacterias, Bioremediación, Derrames de petróleo, degradación de hidrocarburos, rutas metabólicas.

Se consultaron más de 40 fuentes bibliográficas, para su selección se tuvo en cuenta criterios como el idioma, ya que se recopiló información en inglés y español, se hizo una selección general haciendo énfasis en los resultados obtenidos; se seleccionaron artículos con información histórica donde se dio a conocer la evolución del uso de los hidrocarburos, se escogieron libros para dar conceptos y definiciones confiables. Posterior a esto, analizaron las fuentes bibliográficas y se extractó y clasificó la información que brindó mayor aporte científico para la monografía.

8. GENERALIDADES DEL SUELO Y LOS HIDROCARBUROS

8.1 El suelo: es la capa superficial que cubre la corteza terrestre, es la interfaz entre la tierra, el aire y el agua, lo que permite realizar funciones naturales, proporcionan nutrientes y tiene la capacidad de retención de agua. (Petro and Mercado, 2014). Ubicada en la superficie de la litosfera es una mezcla de minerales, material orgánico y una solución acuosa que son primordiales para el desarrollo de los organismos vivos. La disolución acuosa hace referencia a una capa que protege las partículas edáficas que juegan un papel fundamental en el desarrollo de los procesos químicos, ya que hacen de intermediarios entre la litosfera y los organismos vivos como las plantas que al tomar el agua con minerales en su descomposición liberan colides orgánicos al suelo. (Domènech, 1995) El suelo se divide en horizontes que son las distintas capas según su profundidad y a este conjunto de horizontes se denomina perfil que es una estructura global del suelo, En él se diferencian tres tipos de horizontes que tienen propiedades físicas y químicas diferentes dependiendo de su profundidad, estas son:

• Horizonte A: siendo el menos profundo es un sector donde se producen muchos lixiviados de sales de hierro, aluminio y manganeso, para compensar la acumulación de materia orgánica producida por los organismos vivos. Aquí predominan los llamados materiales silícicos.

• Horizonte B: aquí llegan los lixiviados provenientes del horizonte A. En esta zona del suelo se genera la oxidación de la materia orgánica y tiene una coloración entre naranja y café debido a la presencia de hierro III.

• Horizonte C: al ser el más profundo de los horizontes la ausencia de material particulado es notoria, la lixiviación es mínima.

Figura 1. Estructura del suelo

Fuente. Tomado de Ttito (2019) Dados los procesos de oxidación de la materia orgánica y producción de óxidos, existe un gran consumo de oxígeno edáfico que acarrea una baja de este gas con la profundidad y hay un incremento de CO2 la disminución de materia orgánica es directamente proporcional al aumentar la profundidad. (Domènech, 1995) La siguiente en la composición volumétrica del suelo:

50 % de materia solida: 45 % mineral y 5 % orgánica

20 % - 30 % disolución acuosa

20 % - 30 % aire

Con la profundidad de los horizontes también se ve afectado el aire edáfico donde la presión atmosférica también es un factor importante a la hora de generación p producción de gases reductores como lo son el metano, nitrógeno, hidrogeno, sulfuro de hidrógeno entre otros. (Domènech, 1995)

Cationes:

Intercambiables: Ca2+, Mg2+, K+, Na+, NH4+, Al3+ Metálicos de transición: Mn2+, Cu2+, Al3+, Fe3+, Zn2+, Ti4+ Tóxicos: Al3+, Cd2+, Pb2+, Hg2+, Be2+ Aniones:

Solubles: Cl-, SO42-, HCO3-, NO3- Poco soluble: H3SiO4-, H2PO4-, H2BO3-, MoO42- Tóxicos: AsO43-, CrO42- Fuente: (Domènech, 1995)

En el caso de los cationes, interactúan con las partículas de materia orgánica presente en el suelo lo que hace que haya un intercambio iónico entre lo minerales presentes en el suelo y la materia orgánica ya existente. Los cationes, como el potasio son mucho más fertilizantes a comparación del nitrógeno y es fósforo.

Los iones metálicos tienen presencia en los horizontes intermedios, en el caso de los iones de cobre y zinc que son solubles en la mayoría de suelos forman complejos de maría orgánica. (Domènech, 1995) Las rocas, fundamentales para hablar de la composición del suelo compuestas principalmente por material inorgánico atraen los demás componentes para la formación del suelo, la carga mineral del suelo es importante ya gracias a esta se fertiliza es suelo. Los tres tipos de rocas que hacen parte de la composición del suelo son:

Rocas Ígneas: la base de la formación de las rocas ígneas es el silicio, está presenta en un 50 % de la roca que empieza su elaboración a partir del enfriamiento de la lava, otros óxidos presentes en la roca ígnea, pero en menor proporción son: el óxido de aluminio (Al2O3), óxido de calcio (CaO), óxido de hierro (FeO), óxido de hierro (III) (Fe2O3), óxido de magnesio (MgO) entre otros. (Domènech, 1995)

Rocas sedimentarias: estas rocas empiezan su formación a partir de los residuos de agua, viento, hielo que quedan junto con sales de hierro, aluminio, óxido de silicio y carbonato de calcio. (Domènech, 1995) Rocas metamórficas: se forman a partir de la recristalización de los tipos de rocas mencionados anteriormente debido a la presión y temperatura dada a la profundidad de ellas, las más comunes son las denominadas mármol y pizarras. (Domènech, 1995).

8.2 Hidrocarburos: son moléculas compuestas por átomos de carbono e hidrógeno que de

acuerdo al tipo de hidrocarburo se unen o forman estructuras diferentes. La mayor parte de estas estructuras provienen del petróleo es aquí donde intervienen las grandes industrias ya que gran parte de los combustibles provienen de los hidrocarburos. (Uriarte., 2021). Como se ha mencionado desde el inicio, los hidrocarburos son una fuente de energía importante para industria y por ende para la subsistencia humana, sin embargo, no solo son combustibles, sino también procesos más avanzados, sus elementos separados y su uso que se han logrado en toda la industria petroquímica. (De Lourdes, 2017).

8.2.1 Estructura orgánica de los hidrocarburos: se denominan estructuras orgánicas a las

moléculas cuya estructura principal son átomos de carbono (enlace carbono-carbono) e hidrógeno (enlaces carbono-hidrógeno), no obstante, también pueden tener compuesto como azufre, nitrógeno y oxígeno. (Uriarte., 2021)

Figura 2. Estructura de los hidrocarburos

Fuente: Extraído y adaptado de Microbial Enhanced Oil Recovery, Chapter 1 (Speight & ElGendy, 2018)

8.2.2 Tipos de hidrocarburos

• Aromáticos: los hidrocarburos aromáticos forman un círculo debido a los enlaces de carbono que pueden ser dobles o simples. (Uriarte., 2021) • Alifáticos: formados por anillos dobles intercambiados, no son aromáticos y están divididos en cadenas abiertas o cerradas. (Uriarte., 2021)

-

Alcanos: formula general CnH2n-2 tienen enlaces simples entre los átomos de carbono.

-

Alquenos: formula general CnH2n. mínimo un enlace entre los átomos debe ser doble.

-

Alquinos: fórmula general CnH2n-2. Donde al menos un enlace entre los átomos es tripe • Hidrocarburos alifáticos de cadena cerrada: son cadenas que carbonos que se unen formando ciclos como en el caso de los aromáticos, sin embargo, los alifáticos no tienen enlaces dobles alternados por esto se denominan cicloalcanos. (Uriarte., 2021) • Hidrocarburos aromáticos policíclicos HAP: al igual que los mencionados anteriormente, esta clase de hidrocarburos también están formados por cadenas de carbonos con hidrógenos, agrupado en anillos con cinco o seis átomos de carbono. Se encuentran como petróleo, carbón, alquitrán y como productos de uso de los combustibles. Al igual que todos los derivados del petróleo son altamente contaminantes y cancerígenos si no se hace una correcta degradación del mismo. (Agudo, 2010). El más importante es el petróleo, liquido negro y heterogéneo; es considerado uno de los más contaminantes por su abundancia y persistencia en ambiente. Los principales componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: i) fracción saturada (nalcanos, alcanos ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas), ii) fracción aromática (monoaromáticos, diaromáticos e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), iii) fracción de resinas y iv) fracción de asfaltenos que son menos abundantes y consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular (Speight,

1991).

Tabla 2. Composición química del petróleo.

COMPUESTO

PORCENTAJE %

Carbono

84-87 %

Hidrogeno

11-14 %

Azufre

0.06-2 %

Nitrógeno

0.1-2 %

Oxigeno

0,1-2 %

Fuente: Tomado de Arzata (2012)

8.2.3 Propiedades físicas de los hidrocarburos

• Punto de ebullición: el aumento del punto de ebullición es directamente proporcional al tamaño del hidrocarburo en el caso de cadenas lineales no ramificadas, es decir al tamaño o largo de la cadena de carbonos, aunque también influyen las fuerzas intermoleculares que son mayores cuando la molécula es más grande. Un ejemplo es el butano (C4H10), que tiene un punto de ebullición de 0°C mientras de que la del nonano (C9H20) es de 150,8 °C (Uriarte., 2021).

• Densidad: al igual que el punto de ebullición, este también aumenta si la molécula es más grande. (Uriarte., 2021)

• Solubilidad: ya que son sustancias apolares, es decir que sus cargas al ser distintas se anulan, el agua es una sustancia polar lo que impide la solubilidad de los hidrocarburos en gua. (Uriarte., 2021)

8.2.4 Propiedades químicas de los hidrocarburos:

• Combustión: la oxidación de los hidrocarburos puede ser completa o incompleta, este proceso empieza cuando hay una fuente de oxígeno o de calor, del proceso de la combustión completa la sustancia resultante es el dióxido de carbono, y de la combustión incompleta es el monóxido de carbono. Por esta razón los hidrocarburos son catalogados como sustancias contaminantes al desempeñarse como combustibles. (Uriarte., 2021)

Fuente: Tomado de Uriarte (2021)

• Pirólisis: es el estado de descomposición de los compuestos orgánicos cuando son sometidos a altas temperaturas sin presencia de oxígenos. Si los alcanos se exponen a una temperatura cercana a los 800 °C estos de descompondrán en alqueno y alcanos más pequeños. (Uriarte., 2021)

Fuente: Tomado de Uriarte (2021)

• Halogenación: la presencia de esto compuestos se da bajo la luz ultravioleta la cual produce compuesto derivados de los halógenos. (Uriarte., 2021)

Fuente: Tomado de Uriarte (2021)

8.2.5 Impacto ambiental de los hidrocarburos en el suelo y el agua:

Respecto al derrame de hidrocarburos en el suelo, los daños ocasionados pueden clasificarse en tres tipos: i) humanos, que afectan directamente a la salud pública, ii) patrimoniales, que afectan el patrimonio o terrenos públicos y privados y iii) ecológicos, que implican el deterioro en el suelo, cultivos, agua, flora y fauna. (Diaz, 2019) Los estudios realizados por Yu et al (2012) y Serranto et al (2013), señalan que conforme a la composición del suelo y la cantidad de materia orgánica existente se puede determinar el impacto de los hidrocarburos del petróleo y la extensión del daño en el ecosistema además de esto señalan que la contaminación por hidrocarburos de petróleo ejerce efectos adversos sobre

las plantas indirectamente, generando minerales tóxicos en el suelo disponible para ser absorbidos, además, conduce a un deterioro de la estructura del suelo; pérdida del contenido de materia orgánica y pérdida de nutrientes minerales del suelo, tales como potasio, sodio, sulfato, fosfato y nitrato de igual forma el suelo se expone a la lixiviación y erosión. La interacción de los hidrocarburos con el suelo tiene graves consecuencias como lo son la pérdida de fertilidad en el suelo lo que hace que las cosechas sean menos productivas o en caso extremo que el suelo no permita la cosecha y posibles afectaciones a los humanos. (Diaz,

2019).

La contaminación de las aguas por hidrocarburos en los sistemas de almacenamiento, en las fuentes de abastecimientos subterráneos y superficiales, así como en otros cuerpos de agua es un hecho que ocurre con relativa frecuencia. Este tipo de contaminación produce un cambio en las características organolépticas del agua que induce al rechazo de los consumidores y su ingestión representa un riesgo para la salud (Prieto & Martínez, 1999). La contaminación puede ser puntual y sistemática; la primera se puede dar de manera fortuita en los cuerpos de agua donde generalmente no hay presencia de hidrocarburos. La segunda se da de manera habitual y es propia de aquellas aguas que son contaminadas por la actividad antrópica que en ellas se realiza. Por otro lado, las fuentes de la contaminación pueden ser simples o múltiples, y verter al medio uno o varios componentes del petróleo. (Prieto & Martínez, 1999).

Algunas de las fuentes de contaminación en cuerpos de aguas por hidrocarburos son aguas residuales industriales, a través de la atmósfera, fluviales urbanos y derrames de petróleo. Los efectos en el ambiente dependen del tipo de hidrocarburo y los componentes de origen, por ejemplo, la gasolina y el diésel poseen una alta velocidad de evaporación lo que no permite su manejo, por el contrario, los crudos permanecen más tiempo en la zona de afectación (Nodal,

2014).

9. GENERALIDADES DE LOS MICROORGANISMOS

El primero en descubrir vida microbiana fue Antonie van Leewenhoek en el siglo XVIII, a través de aparatos de su propio diseño; al mismo tiempo que Robert Hooke lo hacía y anotaba sus apuntes en Micrographia, su libro sobre la vida microbiana. Estos pequeños seres vivos unicelulares, imperceptibles al ojo humano posee una estructura muy simple y básica, sin embargo, sus características los hacen seres muy versátiles. (Uriarte, 2020)

-

Su tamaño es reducido

-

Sus reacciones metabólicas son muy rápidas.

-

La relación que mantienen con el medio es intensa.

-

Necesitan agua para llevar a cabo sus procesos metabólicos.

-

Desarrollan mecanismos de dispersión y de resistencia.

-

Tienen la capacidad de alterar el medio en el cual se encuentran.

-

Se reproducen a una gran velocidad.

-

Su actividad es indispensable para la vida en el planeta.

-

Forman parte de los ciclos bio-geoquímicos que se llevan a cabo en la naturaleza.

-

Son muy livianos, por lo que se transportan en el aire. (Uriarte, 2020) Los microorganismos pueden ser cultivados en laboratorio mediante dos formas de cultivo y de esta madera aprovechar sus cualidades biológicas en diferentes campos de la ciencia ellas son: • Aerobia. es la técnica más simple, que supone emplear las condiciones atmosféricas ordinarias. sin embargo, con este sistema únicamente crecerán las especies de microbios que conviven con un medio rico en oxígeno. (Uriarte, 2020) • Anaerobia. es la técnica especializada para microorganismos anaeróbicos, es decir, que no precisan de oxígeno. Consiste en reemplazar este gas por nitrógeno, para reproducir las condiciones en que muchas especies crecen en contextos volcánicos, subterráneos o incluso intestinales. (Uriarte, 2020).

Otro de los aspectos que nos interesa tratar en este estudio es su forma de nutrición, al igual que su forma de cultivo, también existen dos tipos de sistemas de alimentación que utilizan a saber:

Heterótrofos: aquellos que absorben sus nutrientes del medio circundante, ya sea dejando pasar a su interior porciones de nutrientes dispersos, o alimentándose de otros microorganismos (o incluso introduciéndose en ellos, como los virus). Así obtienen la energía para mantener sus ciclos vitales andando. (Uriarte, 2020) Autótrofos: aquellos que son capaces de aprovechar fuentes energéticas del medio ambiente, como la luz solar (fotosíntesis) o el calor volcánico (quimiosíntesis) para emprender procesos químicos que les brindan energía aprovechable. (Uriarte, 2020).

Figura 3. Las cianobacterias fijan el CO2 ambiental y liberan oxígeno.

"Microorganismos". Autor: Julia Máxima Uriarte. Para: Caracteristicas.co. Última edición: 9 de marzo de

2020. Disponible en: https://www.caracteristicas.co/microorganismos/

Y es precisamente este proceso de nutrición que llevan a cabo los microorganismos, que se aprovecha para la degradación de los hidrocarburos. Los microorganismos capaces de

metabolizar hidrocarburos, están ampliamente distribuidos en el medio ambiente principalmente por bacterias, levaduras y hongos. La eficiencia de biodegradación reportada oscila entre 6 % al

82 % para bacterias en el suelo, 0.13 % a 50 % para hongos en el suelo y 0.003 % hasta un

100 % para bacterias oceánicas. (Das & Chandran, 2010)

Figura 4: Microorganismos degradadores de hidrocarburos derivados del petróleo

Fuente: https://www.diariojornada.com.ar/194497/sociedad/usan_bacterias_para_remover_petroleo_

9.1 La biorremediación: el uso intencional de las capacidades metabólicas microbianas, así como su estimulación se conoce como biorremediación. Esta estrategia es una tecnología emergente que utiliza organismos vivos (plantas, algas, hongos y bacterias) para absorber, degradar o transformar los contaminantes y retirarlos, inactivarlos o atenuar su efecto en suelo, agua y aire. Se trata de un proceso no-invasivo y económicamente eficiente, que además juega un papel fundamental en el tratamiento de ecosistemas afectados por gran variedad de sustancias contaminantes. (Rodriguez & Hernández, 2017) La biorremediación consiste en la aceleración de los procesos naturales de biodegradación mediante bacterias u otros microorganismos como plantas, algas, cianobacterias, actinomicetes y hongos, que alteran, convierten y metabolizan aeróbicamente los hidrocarburos y las moléculas orgánicas en otras sustancias, como CO2, agua, metano y fuentes de alimento para sustentar su crecimiento y reproducción, es decir la biodegradación ocurre naturalmente. Esta atenuación natural transforma el contaminante en una forma menos tóxica. (Ñústez, Cuervo, &

Cubillos, 2014) De esta manera, esta tecnología se convierte en una gran alternativa para la limpieza de zonas contaminadas por derrames de hidrocarburos.

Figura 5. Ilustración proceso biorremediación.

Fuente: (Cando Rodríguez, 2011)

La biorremediación puede emplear organismos propios del sitio contaminado (autóctonos) o de otros sitios (exógenos), puede realizarse in situ o ex situ, en condiciones aerobias (en presencia de oxígeno) o anaerobias (sin oxígeno) (Eweis et al. 1998). Aunque no todos los compuestos orgánicos son susceptibles a la biodegradación, los procesos de biorremediación se han usado con éxito para tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos del petróleo (HTP), solventes (benceno y tolueno), explosivos (TNT), clorofenoles (PCP), pesticidas (2,4-D), conservadores de madera (creosota) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) (Van Deuren et al. 1997, Semple et al. 2001).

Dependiendo del lugar de realización del proceso de remediación, se distinguen dos tipos de estrategia:

- In situ. son las aplicaciones en las que el suelo contaminado es tratado, o bien, los

contaminantes son removidos del suelo contaminado, sin necesidad de excavar el sitio. Es decir, se realizan en el mismo sito en donde se encuentra la contaminación.

- Ex situ. la realización de este tipo de tecnologías, requiere de excavación, dragado o cualquier

otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de él (off site (Volque & Velasco, 2002)

Tabla 3. Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación In situ y Ex situ

IN SITU

EX SITU

VENTAJAS

- Permiten tratar el suelo

sin necesidad de excavar ni transportar

- Potencial disminución

en costos

- Menor tiempo de

tratamiento

- Más seguros en

cuanto a uniformidad:

es posible homogeneizar y muestrear periódicamente

DESVENTAJAS

- Mayores tiempos de

tratamiento

- Pueden ser inseguros

en cuanto a uniformidad:

heterogeneidad en las características del suelo

- Dificultad para verificar

la eficacia del proceso

- Aumento en costos

e ingeniería para equipos

- Debe considerarse

la manipulación del material y la posible exposición al contaminante

Fuente: http://ambienteyconservacion.blogspot.com/2010/02/tecnologias-de-remediacion-biologicas.

9.1.1 Técnicas de Biorremediación con Microorganismos

Las técnicas in situ buscan estimular y crear un ambiente favorable para el crecimiento microbiano a partir de los contaminantes. Este objetivo generalmente puede lograrse con el suministro de aire u oxígeno (bioventeo), nutrientes (bioestimulación), microorganismos (bioaumentación) y/o humedad, además del control de temperatura y pH (EPA 2001). Dentro de las más comunes y utilizadas están:

➢ Bioventeo: es una tecnología, cuyo objetivo es estimular la biodegradación natural de cualquier compuesto biodegradable en condiciones aerobias. El aire se suministra en el sitio contaminado a través de pozos de extracción, por movimiento forzado (extracción o inyección), con bajas velocidades de flujo, con el fin de proveer solamente el oxígeno necesario para sostener la actividad de los microorganismos degradadores (Van Deuren et al. 1997). Aplicaciones. Se utiliza para tratar compuestos orgánicos biodegradables semivolátiles (COS) o no volátiles. Además de favorecer la degradación de contaminantes adsorbidos, pueden degradarse COV, por medio de su movimiento a través del suelo biológicamente activo (Eweis et al. 1998). Se ha utilizado con éxito para remediar suelos contaminados con HTP, solventes no clorados, pesticidas y conservadores de la madera, entre algunos otros químicos. (Volque & Velasco, 2002)

➢ La Bioestimulación: se define como la estimulación de los microorganismos nativos, para activar y acelerar la degradación de contaminantes, se puede llevar a cabo con la adición de agua, oxigeno, nutrientes, aceptor de electrones, entre otros parámetros que permitan el buen desarrollo de los microorganismos. Dentro de los nutrientes se encuentran principalmente el nitrógeno y fósforo; el nitrógeno proporciona el elemento necesario para la producción de aminoácidos y enzimas, y la fuente de fósforo interviene en la formación de compuestos energéticos dentro de la célula que se utilizan en los procesos de reproducción y degradación. Estos fertilizantes pueden ser de uso agrícola o de origen orgánico como estiércol, también se puede llevar a cabo una estimulación con adición de agua y oxígeno, si el área contaminada ya cuenta con buena presencia de nutrientes. (Tocaria, 2011)

➢ Bioaumentación: esta tecnología se utiliza cuando se requiere el tratamiento inmediato de un sitio contaminado, o cuando la microflora autóctona es insuficiente en número o

capacidad degradadora. Consiste en la adición de microorganismos vivos, que tengan la capacidad para degradar el contaminante en cuestión, para promover su biodegradación o su biotransformación. El tamaño del inoculo a utilizar, depende del tamaño de la zona contaminada, de la dispersión de los contaminantes y de la velocidad de crecimiento de los microorganismos degradadores (Riser-Roberts 1998). Se ha usado para tratar suelos contaminados con herbicidas (2,4-D, clorofam), insecticidas (lindano, clordano, paratión), clorofenoles (PCP) y nitrofenoles, BPC, HTP y HAP (Alexander, 1994).

➢ Biolabranza: durante el proceso de biolabranza, la superficie del suelo contaminado es tratado en el mismo sitio por medio del arado. El suelo contaminado se mezcla con agentes de volumen y nutrientes, y se remueve periódicamente para favorecer su aireación. Las condiciones del suelo (pH, temperatura, aireación) se controlan para optimizar la velocidad de degradación y generalmente se incorporan cubiertas u otros métodos para el control de lixiviados (Riser-Roberts 1998). La diferencia entra la biolabranza y el composteo, es que en la biolabranza, se mezcla el suelo contaminado con suelo limpio, mientras que el composteo generalmente se realiza sobre el suelo (Van Deuren et al. 1997). Los contaminantes tratados por biolabranza, incluyen diesel, gasolinas, lodos aceitosos, PCP, creosota y coque, además de algunos pesticidas y HTP (Alexander 1994). La biolabranza debe manejarse con cuidado para prevenir la contaminación de acuíferos, superficies de agua, aire o en la cadena alimenticia. El mayor problema es la posibilidad de lixiviados de los contaminantes hacia el suelo y el agua (Reiser-Roberts 1998).

➢ La fitorremediación: es una estrategia que se define como el uso de las plantas y sus raíces, asociadas con las bacterias para eliminar, transformar, o asimilar los productos contaminantes ubicados en el suelo, en sedimentos, agua subterránea, aguas superficiales, e incluso la atmósfera, al mismo tiempo, la fitorremediación tiene un enfoque de tratamiento de profundidad, que según las características del sitio contaminado, las siembras de plantas puede ser la única intervención a bajo precio y eficiente. (Zhou Q, 2009)

La rizodegradación se lleva a cabo en el suelo que rodea a las raíces. Las sustancias excretadas naturalmente por éstas, suministran nutrientes para los microorganismos,

mejorando así su actividad biológica. Durante la fitoextracción, los contaminantes son captados por las raíces (fitoacumulación), y posteriormente éstos son traslocados y/o acumulados hacia los tallos y hojas (fitoextracción). En la fitoestabilización, las plantas limitan la movilidad e indisponibilidad de los contaminantes en el suelo, debido a la producción en las raíces de compuestos químicos que pueden adsorber y/o formar complejos con los contaminantes, inmovilizándolos así en la internase raíces-suelo (Sellers 1999). La fitodegradación consiste en el metabolismo de contaminantes dentro de los tejidos de la planta, a través de enzimas que catalizan su degradación. Puede aplicarse eficientemente en suelos contaminados con compuestos orgánicos como benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (BTEX); solventes clorados; HAP; desechos de nitrotolueno; agroquímicos clorados y organofosforados; además de compuestos inorgánicos como Cd, Cr (VI), Co, Cu, Pb, Ni, Se y Zn (Sellers 1999). Se ha demostrado también su eficiencia en la remoción de metales radioactivos y tóxicos de suelos y agua (Volque & Velasco, 2002).

Los procesos de biorremediación ex situ, incluyen tratamientos que se distinguen cuando el procedimiento se realiza fuera del lugar donde está la contaminación: tratamiento por vía sólida y tratamiento por vía en suspensión. La biorrecuperación vía sólida se puede realizar por dos métodos: tratamiento en lechos y tratamiento por compostaje. En el tratamiento vía suspensión se excava el material contaminado y se traslada a un reactor. La característica de este método es la suspensión en un medio acuoso del suelo contaminado, es decir, el tratamiento se lleva a cabo bajo condiciones de saturación de agua. La ventaja de estos procedimientos radica en la posibilidad de optimizar los parámetros microbiológicos, así como el control del proceso; a cambio, lógicamente, de un mayor costo. (Prieto & Mercado, 2014) ➢ Landfarming: esta es la técnica más usada para la biorremediación de los lodos contaminados con hidrocarburos y de otros desechos de la industria petrolera. Esta técnica consiste en excavar los suelos contaminados, extenderlos sobre un área suficientemente

amplia y estimular las variables de incidencia en el proceso para promover la actividad de los microorganismos encargados de degradar los hidrocarburos. Antes de extender el suelo contaminado se deben adecuar las condiciones de la superficie para controlar los lixiviados y las aguas lluvias. (Suarez, 2013)

Figura 6. Esquema Landfarming

Tomado de http://learnbioremediation.weebly.com/uploads/9/0/6/9/9069787/7552412_orig.gif?510

➢ El composteo: es un proceso biológico controlado, por el cual pueden tratar suelos y sedimentos contaminados con compuestos orgánicos biodegradables para obtener subproductos inocuos estables. El material contaminado se mezcla con agentes de volumen (paja, aserrín, estiércol, desechos agrícolas), que son sustancias orgánicas sólidas biodegradables, adicionadas para mejorar el balance de nutrientes, así como para asegurar una mejor aireación y la generación del calor durante el proceso. Los sistemas de composteo incluyen tambores rotatorios, tanques circulares, recipientes abiertos y biopilas. Las pilas estáticas (biopilas) son una forma de composteo en el cual, además de agentes de volumen, el sistema se adiciona con agua y nutrientes, y se coloca en áreas de tratamiento (que incluyen alguna forma de aireación y sistemas para colectar lixiviados). Las pilas de suelo generalmente se cubren con plástico para controlar los lixiviados, la evaporación y la

volatilización de contaminantes, además de favorecer su calentamiento. La aplicación de compostaje como una estrategia de biorremediación tiene dos objetivos: (1) maximizar la eliminación del contaminante y (2) producir un compuesto maduro que podría ser utilizado en la restauración de la tierra para uso industrial. (Volque & Velasco, 2002)

Se han examinado hasta aquí las tecnologías de biorremediación, la elección de la estrategia a utilizar para la remedición de suelos con características particulares, contaminado con uno o más contaminantes en particular, básicamente depende de los siguientes criterios:

• Características ambientales, geográficas, demográficas, hidrológicas y ecológicas del sitio • Tipo de contaminante (orgánico o inorgánico), concentración y características fisicoquímicas • Propiedades fisicoquímicas y tipo de suelo a tratar. Costo de las posibles tecnologías a aplicar. (Volque & Velasco, 2002)

9.2 Microorganismos degradadores de hidrocarburos

Generalmente casi todos son eubacterias, en algunos casos se encontraron arqueobacterias y eucariotas. Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que permiten la oxidación más o menos específica de algunas fracciones de hidrocarburos. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversión a bióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a la mineralización, sino que basta una oxidación para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad. (Sanchéz & Hernandéz,

2018)

Los microorganismos hacen parte fundamental de los procesos de biorremediación, las bacterias desempeñan el papel de mayor importancia en la biodegradación de contaminantes orgánicos en suelos; los hongos también metabolizan compuestos orgánicos, pero en menor proporción que las bacterias. De todos los organismos vivos que se utilizan en las tecnologías de biorremediación, las bacterias heterótrofas aerobias han sido las más estudiadas. Los

microorganismos anaerobios por su parte son menos flexibles a adaptarse a la disponibilidad de sustratos y son menos tolerantes a la presencia de metales pesados, por lo que su papel en la biodegradación se encuentra limitado. Las bacterias constituyen un grupo microbiano de gran importancia debido a la extensa variedad de géneros y especies, y a la versatilidad metabólica que poseen. Un gran número de bacterias metabolizan compuestos xenobióticos como fuente de carbono. (Valderrama, 2012) En ecosistemas en donde las poblaciones microbiológicas degradadoras no son significativas, se ha utilizado la bioaumentación con el propósito de incrementar la tasa de biodegradación de los contaminantes. Se prefiere la bioaumentación empleando microorganismos nativos, ya que otros microorganismos pueden presentan problemas de adaptación. Recientemente se ha considerado el uso de microorganismos genéticamente manipulados para la biorremediación de sitios contaminados. (Ñustez, 2012)

Tabla 4. Microorganismos degradadores de hidrocarburos

COMPUESTO

DERIVADO DEL

PETROLEO

MICROORGANISMO

Alifáticos Acinetobacter sp.

Alcanivorax sp .Azoarcus sp. Baccillus sp.

Brevibacterium Desulfosarcina sp.

Desulfococcus sp.

Marinobacter sp.

Micrococcus sp.

Ochrobactrum sp.

Oleispira sp.

Pseudomonas sp.

Fuente: Adaptado de (Varjani, 2017)

9.2.1 Bacterias

La diversidad metabólica de los microorganismos suele formularse en términos de su capacidad para utilizar compuestos orgánicos complejos. Desde este punto de vista, la diversidad metabólica parece haber florecido principalmente en las bacterias. Por su diversidad, las bacterias se encuentran regularmente en comunidades heterogéneas; algunas especies son Rhodococcus sp.

Stenotrophomonas sp.

Thalassolituus sp.

Aspergillus sp. Candida sp.

Penicillium sp.

Pseudozyma sp.

Monoaromáticos Acinetobacter sp.

Archaeoglobus fulgidus Aromatoleum aromaticum Bacillus sp. Halomonas sp.

Pseudomonas sp.

Rhodococcus sp.

Sphingobacterium sp.

Poliaromáticos Achromobacter insolitus Bacillus sp.

Cycloclasticus sp.

Phanaerochaete chrysporium Pseudomonas sp.

Vibrio sp.

Penicillium janthinellum Resinas Pseudomonas sp.

Algunos miembros de las familias: Vibrionaceae, Enterobacteriaceae, Moraxella sp.

degradadores primarios, es decir, ellas inician la degradación de la materia orgánica en el suelo; otras crecen en compuestos resultantes de la degradación parcial de complejos orgánicos o productos residuales de degradadores. El uso y tolerancia al oxígeno es uno de los métodos de clasificación más generales. Los aerobios estrictos son bacterias que requieren oxígeno como aceptor final de electrones y crecen solamente en presencia del mismo. Las aerobias facultativas son bacterias que pueden utilizar aceptores de electrones terminales alternativos y crecer en presencia o ausencia de oxígeno. Las bacterias también se pueden clasificar como estrofas, las cuales crecen en presencia de altas concentraciones de sustratos, y oligotrofas, las cuales crecen con concentraciones trazas. (Varjani, 2017) Los actinomicetos son un grupo intermedio entre las bacterias procariotas más primitivas y los hongos eucariotas; éstos están presentes en un gran número de suelos. Toleran un intervalo amplio de pH y temperatura, crecen bajo condiciones limitadas de nutrientes y son resistentes a sequías. Aunque su tasa de crecimiento es más baja que la de las bacterias, la habilidad de los actinomicetos para crecer en condiciones adversas permite a estos predominar cuando las condiciones del medio son difíciles. (Varjani, 2017) Especies bacterianas de los géneros Archromobacter, Acidetobacter, Arthrobacter, Azoarcus, Brevibacterium, Acinetobacter, Cellulomonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Marinobacter, Micrococcus, Nocardia, Ochrobactum, Pseudomonas, Stenotrophomaonas y Vibrio se han reportado como degradadoras de hidrocarburos. (Varjani, 2017) Las bacterias constituyen un grupo microbiano de gran importancia debido a la extensa variedad de géneros y especies, y a la versatilidad metabólica que poseen. (Ábalos, A 2014). Su clasificación se presenta a continuación:

Figura 7. Clasificación de las bacterias

Fuente: (Bettie J. Graham, 2019)

Teniendo en cuenta que actualmente son varios los géneros degradadores de hidrocarburos, abordamos los que de acuerdo con las diferentes consultas bibliográficas son los más usados por su eficiencia: (Varjani, 2017) • Pseudomonas: las bacterias de este género poseen la habilidad para utilizar diversos substratos, incluyendo aquellos creados por el petróleo. Las Pseudomonas son bacterias Gram negativas, ubicuas, que pertenecen a la subclase gamma de las Proteobacterias. Las Pseudomonas son productoras de biosurfactantes. Algunos microorganismos productores de biosurfactantes extracelulares solubilizan y facilitan la penetración de los hidrocarburos a través de la pared celular hidrofílica; contienen además enzimas degradadoras de hidrocarburos en la membrana citoplasmática. Estudios con relación al desempeño metabólico de esta Pseudomona ha permitido identificarla como degradadora de gran cantidad de sustratos como el n-hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos. (Nelson K, 2002)

Figura 8. Pseudomona aureginosa en agar bajo luz UV

Fuente: Foto María Fernanda Novoa

En la limpieza del petróleo y sus derivados, la P. aeruginosa ha demostrado ser uno de los

métodos más ecológicos, convierte a los hidrocarburos en subproductos inocuos como el dióxido de carbono y el agua (Prakash & Irfam, 2011). Utiliza y degrada n-alcanos entre 11 y 40 átomos de carbono llegando a un 60% de efectividad usando C20 como substrato (Salgado et al., 2008). Es eficiente en la remoción de hidrocarburos del petróleo en suelo contaminado, registrándose 90% para C10 y 69% para C20+ (Safdari et al., 2017). En la bioremediación de contaminantes del petróleo en zonas costeras, presenta un 100% de índice de emulsificación frente al petróleo crudo con reducción de la tensión superficial a 26,5 mN/m (Cheng et al., 2017). También, en la contaminación de suelos con petróleo crudo puro, es bastante efectiva como bioestimulante mucho mejor que con petróleo crudo tratado (Ojewumi et al., 2018). Además, en la bioremediación de suelo salino contaminado con petróleo se logra un porcentaje de reducción hasta un 30% comparado con el suelo no tratado (Ebadi et al., 2017). Actualmente los ramnolípidos producidos por P. aeruginosa con potencial de bioremediación son una interesante área de estudio (Chong & Li, 2017). Esta produce dos formas de ramnolípidos en cultivo líquido; los que presentan una sola molécula de azúcar se definen como mono-ramnolípidos, mientras que los que tienen dos son los di-ramnolípidos (Maier & Soberón- Chavez, 2000; Kaskatepe & Yildiz, 2016, Shao et al., 2017). Los factores reguladores de estos incluyen sistemas de proteínas de percepción de cuórum (quorum sensing) y respuesta

medioambiental, así como, sistemas reguladores globales dentro de la fisiología bacteriana basal, que actúan tanto a nivel transcripcional o postranscripcional (Reis et al., 2011). Numerosos estudios han confirmado que los ramnolípidos pueden afectar la biodegradación de hidrocarburos, tanto alifáticos como aromáticos. Además, se ha demostrado que su adición a cultivos puros de P. aeruginosa mejora la biodegradación de hexadecano, octadecano, nparafinas y fenantreno (Rikalović et al., 2015). Siendo que, en condiciones de laboratorio el petróleo ha sido removido entre un 58 a 95% (Zhang et al, 2005; Ma et al, 2016; He et al., 2017). Estos ramnolípidos han mostrado que tienen una gran afinidad por una variedad de iones metálicos específicos, facilitando la remoción de metales pesados, tales como el plomo o el cadmio, presentes como contaminantes en suelos y aguas (Giraldo et al., 2014). Su aplicación en la remoción de estos metales pesados en suelos contaminados ha sido determinada, indicándose la remoción de cobre hasta en un 74% (Venkatesh & Vedaraman, 2012), niquel en un 56% (Elouzi et al., 2012), cromo en un 70% (Avramović et al., 2013) y hierro en un 60% (Akintunde et al., 2015).

Figura 9. Estructura general de los ramnolipidos

Fuente:( Luján-Roca, 2019).

La Pseudomona putida: es un saprofito del suelo, oportunista, cosmopolita, metabólicamente versátil, por poseer una dioxigenasa inicial, un tolueno desoxigenada, aunque no presenta la dioxigenasa específica para los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) por lo cual es una buena candidata para las aplicaciones biotecnológicas, tales como agricultura, biocatálisis,

biorremediación, biocontrol en protección de las plantas y producción de bioplásticos. La P. putida posee la capacidad de colonizar la rizosfera de plantas de cosecha y una gran capacidad metabólica que facilita el desarrollo de biopesticidas y promotores de crecimiento de la planta. La degradación de los alcanos por Pseudomona putida se ha estudiado por secuenciación en el plásmido OCT que codifica una enzima dioxigenasa que convierte alcanos a aldehídos a través del hidroperoxidasa del n-alkyl sin un intermediario del alcohol, conocido como la vía de Finnerty; un proceso similar lo presentan los géneros Acinetobacter sp y Nocardiodes sp. Aunque ellos no poseen este plásmido. (Sanchéz & Hernandéz, 2018) La Pseudomonas fluorescens: es degradadora de naftaleno y fenantreno, ventaja que tiene frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan naftaleno y asfaltenos. Estudios realizados demuestran que Flavobacterium y Pseudomonas son los microorganismos más aislados en la fase de degradación de los TPH (Hidrocarburos Totales). (Sanchéz & Hernandéz,

2018)

La Pseudomona stuzeris: se encuentra en una amplia variedad de hábitats, también es una especie metabólicamente muy diversa son degradadoras de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs).

Se ha observado una amplia variedad de metabolismos en cepas ligadas filogenéticamente a la especie. Algunas cepas pueden usar tiosulfato como fuente de energía, produciendo H 2 SO 4 . Dichas cepas son técnicamente quimiolitoautotróficas, ya que utilizan un compuesto inorgánico como fuente de energía y electrones. (Sanchéz & Hernandéz, 2018) Se ha demostrado que otros fijan nitrógeno en ambientes como las raíces del arroz. De hecho, incluso se ha demostrado que algunas cepas crecen diazotróficamente (en ausencia de cualquier fuente de nitrógeno que no sea gas N2). (Sanchéz & Hernandéz, 2018) Otro de los géneros de microorganismos degradadores que se encuentran en la naturaleza es: • Rhodococcus: es uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos noconvencionales, este grupo único consiste en microorganismos que presentan una gran diversidad metabólica, particularmente hacia la utilización de compuestos hidrofóbicos tales como hidrocarburos, fenoles clorados, esteroides, lignina, carbón y petróleo. Algunas cepas de Rhodococcus han sido utilizadas en aplicaciones industriales y ambientales, incluyendo la producción de ácido acrílico y acrilamida, conversiones de

esteroides y bioremediación de hidrocarburos clorados y fenoles.

Estos microorganismos presentan una notable capacidad de degradar hidrocarburos alifáticos halogenados y numerosos compuestos aromáticos, incluyendo algunos sustituidos por halógenos, así como hidrocarburos policíclicos aromáticos.

Las bacterias del género Rhododoccus poseen una gran variedad de vías metabólicas para la degradación y modificación de compuestos aromáticos, incluyendo las actividades de dioxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos, así como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aislados presentan también la vía del 3-oxoadipato. La tolerancia de estas bacterias a la falta de nutrientes, su carencia de un sistema de represión catabólica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas para los tratamientos de bioremediación. Algunas cepas producen poli-3-hidroxialcanoatos, otras acumulan metales pesados y otras son fuente de enzimas útiles como la fenilalanina deshidrogenasa y endoglucosidasas. Otras aplicaciones potenciales de los Rhodococos incluyen la biodesulfuración de combustibles, la deshalogenación de emisiones gaseosas y la construcción de biosensores. El Rhodococcus sp. utiliza el dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de azufre, el dibenzotiofeno (DBT) y sus derivados son los organoazufrados más abundantes en el Diesel primario. (Sanchéz & Hernandéz, 2018) • Burkholderia: es otro género bacteriano utilizado para biorremediación de herbicidas y pesticidas recalcitrantes y también es usado para proteger cultivos contra hongos. Debido a su genoma extremadamente flexible, Burkholderiacepacia, bacilo Gram negativo no fermentador, productora de pigmento amarillo tiene una gran capacidad mutagénica y adaptativa, ha sido recuperada a partir de agua y superficies húmedas, es resistente a múltiples antibióticos esta capacidad es altamente transmisible entre especies. Por todas estas razones, la selección de cepas seguras para su uso ambiental no es posible por el momento y su uso en la agricultura también debe ser cauteloso, Aunque es una excelente degradadora de los hidrocarburos aromáticos. (Katerin & Tatiana, 2009) • El Acinetobacter sp: es un bacilo Gram negativo, es productor de ácido a partir de la glucosa, se desarrolla a 41 y 44ºC, produce a-xilosa y utiliza el malato. Dentro de las especies de importancia ambiental se destacan: A. baumanii, Acinetobacter calcoaceticus carente del ciclo metílico. Las cepas de Acinetobacter baumanii son eficientes en la degradación de fracciones de alcanos.

• Mycobacterium austroafricanum: los productos de petróleo ampliamente usados como gasolina, keroseno y Diesel son contaminantes comunes del ambiente, se ha observado que la biodegradación de gasolina por microflora de suelo y agua de sitios contaminados es eficiente; compuestos como el benceno, tolueno, etilbenceno, y n-alcanos son realmente, han sido degradados por esta bacteria. (Varjani, 2017) • Sphingomonas: bacilos no fermentadores y dentro de estos la Sphingomona wittichi es un microorganismo capaz de degradar en condiciones anaerobias el 2,7diclorobenceno, produciendo el metabolito 4 clorocatenol y el 1,2,3,4 tetraclorodibenceno, y cepas como Sphingomonas yanoikuyae, y Sphingomonas paucimobilis como degradadoras de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) utilizándolos como única fuente de energía, tienen actividad Catecol 2,3- dioxigenasa, fenantreno y antraceno. (Varjani, 2017)

9.2.2 Hongos:

Se sabe que varias especies de hongos tienen la propiedad de degradar contaminantes persistentes. Hongos de los géneros Aspergillus, Amorphoteca, Fusarium, Graphium, Neosartoria, Paecilomyces, Penicillium, Sporobolomyces, Talaromyces y levaduras de los géneros Candida, Pichia, Pseudozyma Rhodotorula y Yarrowia juegan un papel fundamental en la degradación de hidrocarburos. Aunque generalmente la tasa de degradación de hidrocarburos es menor e ineficiente en comparación con las bacterias, estos organismos presentan algunas ventajas sobre las ellas dada su capacidad para crecer sobre un amplio espectro de sustancias y, al mismo tiempo, producir enzimas hidrolíticas extracelulares, capaces de penetrar suelos contaminados y remover los hidrocarburos en niveles más profundos. (Varjani, 2017) Los hongos son altamente protistas, no tienen movimiento y emplean materia orgánica como fuente de carbono y energía. Algunos de los hongos mejor conocidos son mohos, levaduras y setas. En comparación con las bacterias, los hongos son menos numerosos y crecen a velocidades considerablemente bajas; además, los procesos metabólicos de estos son menos diversos. Como grupo, los hongos tienden a ser más tolerantes a los ácidos que las bacterias (muchas especies crecen a un pH óptimo de 5 o menos) y son más sensibles a la variación en la humedad. La variedad de hongos encontrados en los suelos es muy grande, sin embargo, existe un hongo que tiene un considerable potencial en el tratamiento de compuestos orgánicos peligroso, denominado Phanerochaetechysosporium, hongo de la podredumbre blanca. Se ha

encontrado que este organismo degrada una gran variedad de compuestos altamente clorados y recalcitrantes, incluyendo dioxinas. El uso de este hongo está limitado a suelos con carencia de nitrógeno, ya que este elemento en exceso impide la formación de peroxidasa. (Varjani,

2017)

9.2.3 Algas y Protozoos: son miembros importantes de la comunidad microbiana, tanto en

ecosistemas terrestres como acuáticos, los reportes respecto a su participación en la degradación de hidrocarburos son escasos. Uno de los organismos aislados que presentan esta capacidad es un alga conocida como Prototheca zopfii, capaz de utilizar sustratos en el crudo y medios de hidrocarburos mixtos y exhibe una degradación extensiva de alcanos, isoalcanos e hidrocarburos aromáticos. Sin embargo se encuentran poca información de su aprovechamiento como degradadores.

9.3 Factores que influyen en la degradación de hidrocarburos

• La temperatura: es indispensable en la biodegradacion de cualquier compuesto, pues afecta tanto a la sustancia a degradar como al microorganismo que se alimenta de ella. La temperatura afecta los hidrocarburos, disminuyendo su viscosidad y permitiendo una mayor solubilización. Como por naturaleza los hidrocarburos no son bien solubles en sustancias polares, la tasa de biodegradación generalmente disminuye si la temperatura también lo hace y viceversa. (Nilanjana, 2011)

• Los nutrientes: son ingredientes muy importantes para la biodegradación exitosa de los contaminantes de hidrocarburos, especialmente el nitrógeno, el fósforo y, en algunos casos, el hierro. Algunos de estos nutrientes podrían convertirse en factor limitante afectando los procesos de biodegradación. Por lo tanto, se hace necesaria la adición de nitrógeno y fosforo para promover la degradación. Por otro lado, las concentraciones excesivas de nutrientes también pueden inhibir la actividad de biodegradación. (Nilanjana,2011)

• Propiedades del sustrato: la biodegradación de cualquier sustancia depende de también depende de la sustancia a degradar, generalmente, la tasa de biodegradación

incrementa con un menor peso molecular y una estructura química menos compleja por parte del sustrato. La concentración del contaminante a degradar también incide de forma importante en el proceso de degradación, concentraciones demasiado bajas no estimularan el crecimiento microbiano, mientras que concentraciones extremadamente altas pueden ser letales para dicho compuesto. (Nilanjana,2011)

10. RUTAS METABÓLICAS

Se habla de dos rutas metabólicas para la degradación de hidrocarburos la anaerobia y aerobia, sin embargo, hay una gran variedad de vías metabólicas microbianas referentes a la degradación de hidrocarburos ya que estas dependen del tipo de suelo, de la clase de bacteria que allí esté, el tipo de hidrocarburo, y las condiciones fisicoquímicas del ambiente. Es importante destacar que los procesos de degradación se realizan en pasos en los que intervienen enzimas como peroxidasas oxigenasas, hidroxilasas reductasas, y deshidrogenasas. (Varjani,2017) Tabla 5. Enzimas degradadores de hidrocarburos

ENZIMA

COMPUESTO

DERIVADO DEL

PETROLEO

MICROORGANISMO

Metano monooxigenasas (solubles o particuladas) Alcanos C1-C8 M Alcanos halogenados C1-C5 Alcanos Cicloalcanos

Methylocystis Methylomonas Methylocella Methylobacter, Methylococcus Geobacillus hermodenitrificans Methylomirabilis oxyfera Pseudomonas, Burkholderia Rhodococcus, Mycobacterium AlkB Alcano Hidroxilasa Alcanos C5-C16 Alquilbencenos Cicloalcanos acidos grasos Pseudomonas Burkholderia Rhodococcus Mycobacterium P450 Eukariota Alcanos C10-C16 Candida maltose

(CYP52

Candida maltose Candida tropicalis Yarrowia lipolytica Sistema de oxigenasa bacteriano P450 (CY153) Alcanos C5-C16 cicloalcanos Acinetobacter Caulobacter Dioxigenasas Alcanos C10-C30 Acinetobacter sp.

Fuente: Adaptado de Nilanjana, 2011

10.1 Degradación anaeróbica: Villareal et al (2014) en su artículo señala qué degradación

anaerobia es un proceso alternativo y efectivo para el tratamiento de diferentes residuos orgánicos, incluyendo los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Este proceso se lleva a cabo específicamente por consorcios bacterianos formados por bacterias fermentativas (acidogénicas y acetogénicas), sulfato reductoras (BSR), desnitrificantes y metanogénicas, (Morlett y col., 2008b; Foght, 2008; Annweiler y col., 2002; Heider y Fuchs, 1997; Harwood y Gibson, 1997). En estudios previos, Musat y col., (2009); Selesi y col., (2010) y Mathava y col., (2011) reportaron la biodegradación del naftaleno, 2-metilnaftaleno y fluoreno mediada por bacterias sulfato reductoras; además, a partir de diferentes consorcios especializados se han aislado e identificado bacterias sulfato reductoras presentes en los mismos, como Desulfosporosinus meridiei (Robertson y col., 2001) y Desulfovibrio carbonoliphilus (Allen y col., 2008). Recientemente, Guan y col. (2012) aislaron, a partir de sedimentos contaminados con petróleo, bacterias identificadas como Desulfotomaculum sp., Desulfomicrobium sp., Desulfobacter sp. y Desulfobulbus sp.

La biodegradación anaerobia de HA es un proceso que implica varios pasos, el cual empieza con la activación inicial, esta activación se lleva a cabo mediante algunas de las siguientes reacciones (Fogth, 2008): 1. Adición de fumarato al compuesto aromático, mediante enzimas para producir un aromático sustituido con succinatos. 2. Metilación de los compuestos aromáticos. 3. Hidroxilación de un sustituyente alquilo a través de una deshidrogenasa en el compuesto aromático. 4. Carboxilación directa del compuesto aromático, que puede representar en realidad una combinación de la metilación seguida de una hidroxilación. Después de la activación inicial de los HMA y HPA son reducidos, mediante dos vías: a) vía del fumarato y b) vía del Benzoil CoA (Morlett y col., 2008b; Foght, 2008; Selesi y col., 2010)

Figura 10. Degradación anaeróbica de los hidrocarburos:

Fuente: Morlett et, al (2008)

10.2 Degradación aerobia: en la descomposición aerobia se produce la oxidación completa del material descompuesto, quedando este transformado en materia inorgánica, cuyo contenido energético es escaso.

(Romero A. R., 2013) Señala en su tesis que Atlas (1981) Dentro de los compuestos alifáticos, los n-alcanos son los que se degradan más rápidamente en una mezcla de hidrocarburos. Los alcanos son moléculas altamente con un elevado contenido de carbono y energía, por lo tanto, constituyen un buen sustrato para los microorganismos (bacterias, hongos filamentosos y levaduras) (van Beilen et al, 2003; Wentzel et al, 2007). Gracias a su propiedad hidrofóbica favorecen la acumulación en la membrana citoplasmática del microorganismo, lo que indica que cualquier hidrocarburo debe ser activado antes de si degradación. (Romero A. R., 2013)

Los compuesto BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos, orgánicos volátiles (VOC) que se encuentran en el petróleo y en productos derivados del petróleo como la gasolina) son los que presentan es te tipo de degradación aerobia dado a su anillo aromático que facilita la oxidación del compuesto para una degradación satisfactoria.

Figura 11: Degradación de la aeróbica de los hidrocarburos

Fuente: Romero (2013)

10.3 Degradación de hidrocarburos alifáticos en presencia de oxígeno: los hidrocarburos

derivados del petróleo alifáticos los podemos clasificar en alcanos, alquenos y alquinos dependiendo de lo saturados que estén sus enlaces. En general también la presencia de ramificaciones reduce la tasa de biodegradación porque los átomos de carbono terciario y cuaternario interfieren con los mecanismos de degradación o lo bloquean totalmente. (Díaz,

2019)

Los microorganismos que utilizan hidrocarburos como sustrato deben de tener enzimas denominada monooxigenasas que son dependientes de oxígeno. La mayoría de los microorganismos en teoría si son capaces de sobrevivir en ese ambiente pueden degradar sin más problemas hidrocarburos de cadena larga, para que sea de fácil comprensión y sin entrar en demasiados detalles metabólicos podemos decir que para que los microorganismos puedan degradar alcanos primero deben de oxidar con oxigeno el último carbono de la molécula gracias al complejo multienzimático que no hacen más que incorporar esta molécula de oxígeno. Así se obtiene un hidrocarburo con un grupo alcohol siendo así una molécula más reactiva. (Díaz,

2019)

Mediante otras enzimas este grupo alcohol se oxida más hasta grupo aldehído y finalmente carboxílico. Así se obtiene una molécula similar a un ácido graso y puede ser degradado a acetil-CoA por b-oxidación. Este proceso de oxidación también puede darse en carbonos no terminales dando lugar a dos ácidos grasos que se procesarán por b-oxidación. (Díaz, 2019) La mayoría de microorganismos en teoría sean capaces de utilizar este mecanismo pocos pueden vivir en esas condiciones. Para hacerlo deben ser capaces de vivir en un medio muy hidrófobo como es el petróleo. Por lo tanto, para colonizar las interfases petróleo-agua tienen que variar sustentablemente la membrana. Además, para introducir los hidrocarburos en la célula lo hacen vía vesícula. Por lo tanto, si hablamos de requerimientos genéticos no solo es necesario el sistema monooxigenasa sino otros genes que permitan variar la envoltura y formación de esas vesículas. Por esta razón son pocos las especias que puedan realizar esta biodegradación. Sin duda la especie con más posibilidades y la más estudiada en el campo es Pseudomonas. (Díaz, 2019)

Figura 12. Degradación de hidrocarburos alifáticos en presencia de oxígeno

Fuente: Díaz (2019)

10.4 Degradación de alcanos de cadena ramificada: (Romero A. R., 2013) Señala en su tesis

doctoral que (Watkinson & Morgan, 1990). Como ya se ha comentado, la degradación de alcanos de cadena ramificada es más difícil que la de n-alcanos lineales. A pesar de esto, existen varias cepas bacterianas que pueden degradar alcanos ramificados simples como el isooctano (Solano-Serena et al., 2004), o compuestos mucho más complejos como el pristano. (Romero A. R., 2013) Señala en su tesis doctoral que (Hara et al., 2003). Los alcanos ramificados tales como pristano y fitano, una propiedad que parece proporcionarles una ventaja competitiva en el agua de mar contaminada con Petróleo. Las vías metabólicas responsables para la asimilación de alcanos ramificados están menos caracterizadas que las de n-alcanos, y pueden implicar una ω- o β-oxidación de la molécula de hidrocarburo (Watkinson y Morgan, 1990). En nuestro laboratorio se dispone de una cepa de Gordonia amicalis degradadora de alcanos de cadena larga (resultados no publicados) y otra de Mycobacterium gilvum degradadora de pireno (Vila et al., 2001) que degradan tanto pristano como fitano y que fueron aisladas de arena de playa.

10.5 Rutas de degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)

Debido a su elevada estabilidad química, la activación del anillo aromático es esencial para que se pueda producir su ruptura en fragmentos que sean más fácilmente metabolizables. Como se ha mencionado, las mono y dioxigenasas (dioxigenasas hidroxilantes de anillo, RHDs) catalizan reacciones de hidroxilación que activan el anillo aromático mediante la adición de átomos de oxígeno molecular a uno o más átomos de carbono del substrato.

Figura 14. Rutas de degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)

Fuente: Díaz (2019)

La figura 14 nos nuestra las estructuras químicas de hidrocarburos aromáticos representativos y de sus productos intermediarios de degradación. (a) Ejemplos de hidrocarburos aromáticos que son sustratos de reacciones catalizadas por mono y dioxigenasas. I. Hidrocarburos aromáticos mono- y bicíclicos, R = H, benceno; CH3, tolueno; C6H5, bifenilo. II. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), naftaleno y pireno. (b) Sustratos comunes para la ruptura de anillos resultado de su hidroxilación por mono- y dioxigenasas. R1 = H, catecol; CH3, 3-metil catecol; C6H5, bifenilo 2,3-dihidroxi. R2 =: CH3,

4-metil catecol; COO-, protocatecuato. (c) Intermediarios comunes de la ruptura de anillo extradiólica (meta) e intradiólica (orto) catalizadas por dioxigenasas. R1 = H, 2-hidroxi-6oxo-hexa-2,4-dienoato de etilo; CH3, 2- hidroxi-6-oxo-hepta-2,4-dienoato de etilo; C6H5, 2hidroxi-6-oxo-6-fenilhexa-2,4-dienoato de etilo. R2 = CH3, 2-hidroxi-4-metil-6-oxo-hexa-2,4dienoato de etilo; COO-, 2-hidroxi-4- carboxi-6-oxohexa-2,4-dienoato de etilo. R3 =H, cis, cis-muconato. R4 = COO-, 3-carboxi-cis, cis-muconato. (Izquierdo, 2013). Tras esta hidroxilación inicial, los compuestos resultantes, que contienen dos sustituyentes hidroxilo en posiciones vecinales, sirven de sustrato para el ataque de dioxigenasas de ruptura de anillo, que producen una ruptura del enlace C-C, ya sea entre los carbonos hidroxilados (ruptura orto) o entre un carbono hidroxilado y uno no hidroxilado (ruptura meta). Las rutas para la degradación de una gran variedad de compuestos aromáticos convergen mediante la canalización de los productos resultantes hacia la producción de unos pocos intermediarios monoaromáticos, sobre todo catecoles y protocatecuato (o sus derivados metilados), que son subsequentemente degradados a intermediarios del metabolismo central que entran en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o se utilizan para la biosíntesis (Fuchs, 1999).

10.6 Reducción de hidrocarburos aromáticos:

Los hidrocarburos aromáticos se degradan por acción de ciertas bacterias reductoras, ya sea de nitrato, hierro férrico o sulfato. Sin embargo, existen otras bacterias; fotótrofas o fermentadoras que son capaces de realizar metabolismo anóxico a ciertos hidrocarburos aromáticos. A diferencia del metabolismo aerobio que comienza a ocurrir por la oxidación del anillo aromático, en el metabolismo anóxico comienza con la reducción del anillo. Por ejemplo: para el catabolismo del tolueno, se añade fumarato, el cual adicionará el oxígeno necesario para iniciar el proceso. Posteriormente se formará benzilsuccinato y se darán paso a una serie de reacciones, que llevaran a la formación de benzoíl-CoA, el cual se terminará degradando por la reducción total del anillo.

Para aquellos hidrocarburos con varios anillos, como: naftaleno, la oxigenación ocurre con la adición de dióxido de carbono (no de fumarato), con esto un átomo de oxígeno pasa a formar parte del hidrocarburo, se forma ácido carboxílico y facilita el comienzo del metabolismo degradador por medio de bacterias reductoras desnitrificantes o sulfato.

(Diaz, 2019).

Figura 15. Reducción de hidrocarburos aromáticos

Fuente: Brock, biología de los microorganismos (Madigan et al., 2015)

10.7 Reducción de hidrocarburos alifáticos:

El metabolismo más estudiado en este caso es el del hexano, que realizan las bacterias desnitrificantes, estas son las que utilizan el nitrato como aceptor de electrones. El metabolismo anóxico del hexano ocurre con la adición de fumarato, este se une en el átomo de carbono 2 y adiciona el oxígeno necesario para que se forme un ácido graso, el cual será oxidado mediante la 𝛽-oxidación, de la misma forma como se describe en la

Figura . se terminará originando acetil-CoA el cual podrá ser oxidado por medio del ciclo del ácido cítrico. (Diaz, 2019)

Figura 16. Reducción de hidrocarburos alifáticos

Fuente: Brock, biología de los microorganismos (Madigan et al., 2015)

10.8 Rutas de degradación de las Pseudomonas

Como ya se ha mencionado y según las aclaraciones que hace (Alanís, 2004) las Pseudomonas tienen una alta capacidad de adaptación para lograr la descomposición química y física de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) tales como el naftaleno, hidrocarburos aromáticos como el tolueno e hidrocarburos alifáticos como los n- alcanos. Por esta razón, se habla de las rutas de biodegradación que realizan estos microorganismos que se relacionan con plásmidos catabólicos de las Pseudomonas (estos plásmidos pueden ser OCT,

NAH y TOL; que son los representativos de las bacterias gram negativas). Por esta razón las rutas de degradación de las Pseudomonas se clasifican en tres: • Degradación (C6 a C12 n- alcanos): este grupo de hidrocarburos alifáticos son el grupo más exuberante de las cadenas encontradas en el petróleo. Estos grupos de hidrocarburos suelen tener una fácil biodegradación si se realiza de forma anaeróbica por diferentes rutas como se observa en la figura 23, en la que lleva a cabo la degradación de n- alcanos por Pseudomonas putidas (identificadas con el plásmido OCT), esta cadenas de hidrocarburos inicia por un alcano hidroxilasa. En esta figura , los círculos rojos representan tres reacciones que ocurren durante la ruta de degradación de la siguiente manera: 1) Se genera un hidroxilización por medio de la catalización formada por el mismo grupo de enzimas bacterianas, en este caso las Pseudomonas putidas 2) da paso a la formación de alcohol deshidrogenasas, el cual es una enzima bacteriana presente en el metabolismo de la Pseudomna putida 3) se inicia la formación de aldehído deshidrogenasas, el cual es una enzima que se encuentra en la vegetación o es residuos de animales, en este punto es donde se inicia la interacción de las bacterias con la naturaleza para realizar el proceso de limpieza total. (Arenas, 2018)

Figura 17. Degradación de alcanos

Fuente: Alanís (2004)

• Degradación tolueno: para la degradación de estos hidrocarburos se siguen cinco rutas de las cuales cuatro se realizan gracias a las Pseudomonas como se muestra en la figura, el proceso se inicia por medio del plásmido TOL, el tolueno es degradado consecutivamente en alcohol bencílico, benzoato y catecol (los dos últimos son producto de la formación del alcohol bencílico). La primera atapa de la degradación la realiza la Pseumdomona putida F1 que deja como resultado la formación de cis- tolueno dihidrodiol que a su vez es transformado en 3- metilcatecol. La segunda etapa de degradación la realiza la Pseudomona mendocina KR1, que se encarga de transformar el tolueno a p- cresol producto de la acción del tolueno-4-monoxigenasa, formando a su vez p- hidroxibenzoato gracias a la oxidación del metilo. La última etapa es realizada por las Pseudomona pickettii PKO1, genera oxidación en el tolueno por medio de la acción del tolueno-3 – monoxigenasa a m- cresol, el cual se continúa oxidando dando paso a la formación del 3- metilcatecol. (Arenas, 2018)

Figura 18. Degradación del Tolueno

Fuente: Alanís (2004)

• Degradación (naftaleno): este grupo de hidrocarburos aromáticos policíclicos son altamente tóxicos, mutagénicos y cancerígenos. El naftaleno se forma por lo general por la mala combustión de la materia orgánica (por ejemplo la combustión de gasolina, el diésel o el cigarrillo). Estos son degradados completamente en condiciones aeróbicas, que se inicia por la acción de la dihidroxilación de uno de los anillos aromáticos polinucleares y posteriormente se genera la división del anillo dihidroxilado. Generalmente, esta degradación se realiza gracias a las Pseudomonas fluorescens. (Alanís, 2004).

11. EFICIENCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN DEGRADACION DE HIDROCARBUROS

Luego de analizar las diferentes fuentes bibliográficas en las que se describen los resultados, no solo de estudios en laboratorio, sino también de resultados en luego de la aplicación de algunos microorganismos en suelo y agua, en derrame de distintos hidrocarburos, es evidente la eficiencia de éstos en el proceso de remediación, a continuación, se referencian algunos de estos casos:

➢ Derrame petróleo Golfo de México: este caso se presentó el 20 de Abril del año 2010 a inmediaciones de las costas del Golfo de México (Mississippi), en la plataforma marina conocida como horizonte profundo encarga de la perforación del pozo exploratorio Macondo, en el cual se llevaba una profundidad perforada de 5.000 ft (1525 metros aproximadamente), este pozo estaba cargo de la operadora British Petroleum quienes al tomar una muy mala decisión al no invertir el dinero y equipo suficiente para realizar las pruebas de la fase de cementación provoco una de las tragedias ambientales más grandes de los Estados Unidos. (Arenas, 2018)

El derrame alcanzo varias costas (como Luisiana, Alabama y Florida) y fue tan extenso que alcanzo a afectar zonas de la ciudad de Panamá, el área impactada se detectó por medio de registros satelitales que identificaron el rumbo de las corriente que estaban transportando rápidamente le petróleo por las costas, una de las imágenes que se logró se puede ver en la figura 30, donde se observa la emulsión entre agua y petróleo que se generó por la turbulencia del agua de mar. (Arenas, 2018)

Según Lu (2016), el 15 de Julio de 2010, cuando se finalizó el sellado de la cabeza de pozo, se inició la aplicación de dispersantes químicos, específicamente COREXIT EC9500A y COREXIT EC9527A cuando se detectó una capa de petróleo a una profundidad de 1000 metros, la cual un tiempo después desapareció ya que los dispersantes activaron la actividad microbiana y dio inicio a la biodegradación. El proceso de preparación de microrganismos en este derrame en especial, se llevó a cabo el siguiente proceso: (Arenas,

2018)

1. Se tomaron muestras de agua contaminada a varias profundidades en las zonas más

críticas, con el fin de identificar las propiedades físico-químicas del petróleo y del agua como: oxígeno disuelto, cantidad de partículas de crudo presentes, temperatura del agua (en zonas contaminadas y no contaminadas), cantidad de nitrógeno amoniacal total, cantidad de nitrito total y cantidades de ortofosfato. (Arenas, 2018)

2. En el laboratorio se realizó un análisis de los grupos bacterianos que se lograron

extraer, se realizó la incubación a una temperatura de 42ºC con 40% de formamida en un periodo de 16 horas aproximadamente. (Arenas, 2018)

3. Posteriormente, se escaneó cada célula detectada para definir cuantas clases de

microrganismos habían (o resonancia magnética), para identificar picos altos y bajos que determinarían el índice de diversidad microbiana, tasa de posible crecimiento, composición y estructura de la cepa microbiana y el análisis de correspondencia canónica (CCA) para poder decidir si se pueden vincular al proceso bacterias comerciales (no nativas). (Arenas, 2018)

4. En una última selección de bacterias se identificaron las cepas con mayor capacidad

de adaptación para la zona, dentro de las cuales se encontraron dos cepas de Pseudomonas, como se nuestra en la figura 19.

A pesar de todos los estudios realizados, la cantidad del petróleo derramado de pozo Macondo dejo un impacto grave a grandes profundidades por presencia de petróleo liviano y gas metano. La actividad bacteriana implantada en las zonas mediante tapetes microbianos no alcanza a llegar a zonas tan profundas y según las investigaciones realizadas en casos de derrames de petróleo anteriormente, la única forma en que se logre biodegradar el petróleo a grandes profundidades es la actividad y capacidad que tengan las bacterias indígenas presentes en ese entorno ya que son microorganismos que son altamente capaces de sobrevivir en lugares donde el oxígeno es muy escaso, estos son proceso que la tecnología actual no ha logrado descifrar. (Arenas, 2018)

Figura 19. Grupos bacterianos seleccionados para biorremediación

Fuente. (LU, 2012)

➢ Lubricadora Puyango, Ecuador: Uno de los problemas ambientales más serios del Ecuador es precisamente la utilización de los causes, estuarios y lagos como receptores de descargas de aguas residuales (municipales, domésticos e industriales) sin tratamiento previo alguno. El proceso de los desechos líquidos urbanos e industriales es casi inexistente, apenas un 7 % y las que hay se ubican en el Austro del país (CEPAL, 2012). (García, Peñafiel, & Rpdríguez, 2019)

Las muestras de estudio pertenecen a las aguas residuales de la Lavadora y Lubricadora Puyango, de la cuidad de Santo Domingo, tomadas en el punto de descarga al alcantarillado público. Se realizó una caracterización inicial evaluando parámetros físicos y químicos característicos de estas aguas residuales. En el caso de Hidrocarburos Totales de Petróleo (TPH, por su sigla en inglés) se tomaron muestras puntuales durante siete días y se graficó la variación temporal de este indicador. El resto de los contaminantes se analizaron a una sola muestra compuesta. (García, Peñafiel, & Rpdríguez, 2019)

Se utilizó en el tratamiento biológico una mezcla de bacterias encargadas de la degradación de varios tipos de hidrocarburos: Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. y Mycobacterium sp. Según García y Aguirre (2014), cuando se intenta hacer simulaciones de degradación del petróleo se utilizan mezclas de bacterias, no una sola. La mezcla de bacterias se aplicó en forma sólida, tableta de 80 g, con una concentración mínima de 4 x 108 UFC/ml de microorganismos, fácilmente soluble en agua. Reyes at al, (2018) inoculó con células del consorcio bacteriano hasta alcanzar una concentración de 1 × 108 UFC/ml para la inmovilización de bacterias en capsulas de alginato de sodio en su estudio de biodegradación de hidrocarburos. Se utilizaron dos tabletas de microorganismos, la primera se desgastó en un tiempo de 15 días y se volvió a colocar otra tableta, para completar un tiempo total de 30 días de aplicación del tratamiento. (García, Peñafiel, & Rpdríguez, 2019)

Figura 20. Porcentaje de remoción del hidrocarburo del petróleo

Fuente: (Garcia 2019) La aplicación de la bioaumentación mediante un cultivo mixto de Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. y Mycobacterium sp para la biorremediación de las aguas residuales de la Lubricadora Puyango resultó eficiente (p=0.003) obteniéndose porcentajes de remoción del

Hidrocarburo Total de Petróleo por encima del 86 % Los mejores resultados de remoción del TPH se obtuvieron a la tercera semana de aplicado los microorganismos con un 92 %. (García, Peñafiel, & Rpdríguez, 2019) Además, los microorganismos removieron (40 %), aceites y grasas (50 %), tensoactivos (43 %), permitiendo cumplir con la normativa vigente de descarga al alcantarillado público de todos los parámetros exceptuando los tensoactivos, lo que evidencia que es una alternativa técnicamente factible, viable y de bajo costo. (García, Peñafiel, & Rpdríguez, 2019) ➢ Investigación Universidad Científica del Perú: la mayor parte de las actividades petrolíferas se encuentran en las zonas del zócalo oceánico, costa y amazonia, las cuales poseen reservas con un total de más de 741 millones de barriles de petróleo (MINEM, 2013). Desde 1978 hasta la actualidad se registran 5000 derrames y fugas de petróleo. Esto conlleva a buscar soluciones biológicas que ayuden a reducir el impacto ambiental es este sentido los hongos, son buenos en la degradación de hidrocarburos ya que poseen una enzima eficiente (Munnecke et al, 1998). En diferentes estudios indican que los hongos son buenos degradadores de hidrocarburos en diferentes sitios contaminados, en la investigación de Lemos et al, 2002 indicaron distintos géneros de hongos que son aisladas en distintos ecosistemas, el Thichoderma y Mortierella mayormente son aisladas desde suelos contaminados con hidrocarburos, a diferencia de los géneros Aspergillus y Penicillium que mayormente se aíslan en ambientes marinos y terrestres con hidrocarburos. Sin embargo, los hongos degradan a los hidrocarburos en mucho más tiempo, esto se demuestra en el estudio de Contreras (2017), en el cual utilizó a los hongos del género Aspergillus sp. para la degradación de hidrocarburos, dando como resultado una degradación de 73 % a los 90 días. Esto se comprueba en el estudio de Chaineau et al.,1999 en el cual utilizó al Penicillium brevicompactum para la degradación de hidrocarburos, donde se obtuvo como resultado un 23% en un periodo de 30 días. (Ramón

2019),

En el estudio de Cerna, 2018 se evaluó la degradación de hidrocarburo por el hongo Penicillium janthinellum en distintas concentraciones y tiempo, en el cual se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 6. Eficiencias del Hongo Penicillium janthinellum en la degradación de hidrocarburos

TRATAMIENTO

TIEMPO

DIA

0

DIA 12

DIA 24

DIA 36

CONTRACION DE

HIDROCARBURO (MG/KG)

T1 40 %

HONGO

1000 9071,11 8361,11 7487,77

T2 20 %

HONGO

1000 9394,44

8566,6 7644,44

T3 10 %

HONGO

1000

9500 8944,44

8100

Fuente: Ramón, 2018

Como se observa en el cuadro el hongo Penicillium janthinellum degrado al hidrocarburo en un mayor tiempo y en una mayor concentración. En la investigación de Ferreira et al.,2013 realizaron la biorremediación para un suelo contaminado por hidrocarburo (diésel), en donde evaluaron la eficiencia de la Thichoderma en la degradación de estos, en una misma concentración de hidrocarburo, pero en diferentes tiempos, los resultados que presentaron fueron al 30% y 70% de degradación en 30 y 60 días respectivamente. Esto se comprueba en la investigación de Diaz, 2011 en donde evaluó la eficiencia de la Thichoderma en la degradación de hidrocarburo (diésel), donde se obtuvieron como resultados un porcentaje de 35% y 75% de degradación en 30 y 90 días respectivamente. (Ramón, 2018)

➢ Investigación Universidad Libre. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos mediante utilización de diferentes cepas bacterianas a escala laboratorio. (Pinto & Sánchez, 2018)

Se diseñó un experimento que contó con seis terrarios de experimentación, los cuales tuvieron su debida bacteria y su contaminante (Gasolina o Diésel). Los terrarios 5 y 6 no contaron con cepa bacteriana con la finalidad de evaluar la posible degradación natural de los hidrocarburos. Cada terrario contuvo 3 kg de suelo. Se contó con sus respectivas réplicas para un total de 18 terrarios para muestreo y análisis. Se incluye un análisis del suelo. Se utilizaron dos cepas bacterianas, Pseudomona putida y Acinetobacter baumannii las cuales fueron inoculadas mediante estriado simple en agar sangre selectivo por un periodo de 24-36 horas a una temperatura de 35 °C. (Pinto & Sánchez, 2018) El suelo se contaminó en los laboratorios de la Universidad Libre con Diésel o Gasolina según correspondía, en una proporción de 150 mL de contaminante por 42 cada terrario de experimentación, es decir que por cada 1 kilogramo de suelo se usaron 50 mL del hidrocarburo. Dentro de resultados encontrados están:

En el pictograma figura 19, se evidencia en la región de los -3200 a -2600 cm-1, una condición inicial del suelo contaminado con Diésel, una biorremediación natural, la degradación de las bacterias utilizadas y el suelo sin contamina. Se pudo observar una baja biodegradación del diésel debido a su baja tasa de evaporación con relación a la gasolina, viéndose una degradación natural del 24,68% del diésel en el suelo. La bacteria que logró un mayor porcentaje de degradación fue la Acinetobacter baumannii con un 57,14% de 57 reducción, mientras que la Pseudomona putida presentó un porcentaje de reducción del 51,94%.

Figura 21. Pictograma del Diesel

Fuente: (Pinto, 2018)

Figura 22. Espectrofotograma de la Gasolina

Fuente: (Pinto, 2018)

De acuerdo con (Pinto, 2018) en el espectrofotograma se puede observar, la degradación tanto natural como por acción de las bacterias utilizadas, se refleja las condiciones iniciales de los terrarios de experimentación contaminados con gasolina, una biorremediación natural debido a que la gasolina puede mediante otros procesos físico-químicos adicionales, evaporarse de manera que disminuya su concentración (Franzmann et al., 2002), la bacteria Acinetobacter baumannii presentó mayor porcentaje de degradación a comparación de la Bacteria Pseudomona putida, y está a su vez mostró un mayor porcentaje de degradación que la biorremediación natural. Se encuentra un estado inicial del suelo sin contaminar, que es el punto de comparación o el punto al cual se espera llegar llevando a cabo el proceso de biorremediación. En el suelo contaminado con Gasolina y que presentaba la bacteria Pseudomona putida se logró una biorremediación del 63,27% en 60 días de experimentación. En el suelo contaminado con Gasolina y que presentaba la Acinetobacter baumannii presentó una biorremediación del 69,38% en 60 días de experimentación, en cuanto a la biorremediación natural del suelo con la gasolina este fue de tan solo 51,02%

12. CONCLUSIONES

Es invaluable el papel de los microorganismos en la remediación de suelo contaminados por derrame de hidrocarburos, su metabolismo aunque básico, es único y funcional para los procesos de transformación de contaminantes en materia inocua que no afecta el medio ambiente.

Las investigaciones sobre microorganismos, llevadas a cabo desde diferentes enfoques científicos como el de biología, microbiología, química, bioquímica, han permitido conocer el metabolismo de los microorganismos y con ello potenciar su capacidad degradativa a través de la manipulación genética, lo que ha llevado a mejorar su eficiencia. Es así como hoy se conocen un grupo de empresas que se encargan de patentar comercialización de los llamados macroorganismos genéticamente modificados.

Por otra parte, durante este análisis bibliográfico se estableció que hay millones de microorganismos en la naturaleza, sin embargo, hasta el momento y según información de varios autores, se ha estudiado cerca de menos del 3.5% de la población microbiana. La reflexión aquí es: si con este reducido porcentaje se han logrado los avances que hasta hoy se conocen, el estudio y conocimiento de nuevos microorganismos permitiría un avance significativo en la biorremediación y por ende en las soluciones ambientales para derrames de hidrocarburos. Aquí la química es fundamental para indagar sobre el conocimiento de nuevas rutas metabólicas y de esta manera potenciar la modificación genética de los microorganismos para logar optimizar sus capacidades degradativas.

Está entonces demostrada la eficiencia de los diferentes microorganismos degradadores, pues los resultados tanto en investigaciones de laboratorio como aplicación en campo, apuntan a porcentajes satisfactorios de degradación para derrame de hidrocarburos, sin embargo es importante resaltar que la mayor eficiencia se logra con consorcios mixtos más que con una sola cepa de microorganismos. Como se ha mencionado al largo de este documento las Pseudomonas se les conoce por su poder degradativo sobre naftaleno y asfaltenos (Rockne et al., 2000). Además, resultan tener altas tasas degradativas, tal como documentan Obi et al. (2016) y Bracho et al. (2004) con valores de hasta alrededor del 79% de hidrocarburos degradados. Pérez et al. (2008) reporta un 57% de degradación por parte de Pseudomona

aeruginosa. Bacterias como, Acinetobacter y Alcaligenes odorans, demostraron su capacidad degradativa para dos tipos de petróleo. Acinetobacter mostró tasas degradativas de 29% a 50% (dependiendo del tipo de crudo examinado). Esta bacteria mayormente cataboliza las fracciones de alcanos y en menor medida las fracciones de aromáticos. Mientras que Alcaligenes odorans, muestra tasas de degradación entre 37% a 45%. Además, logró degradar por igual fracciones de alcanos y aromáticos. (Varjani 2017) Con todo lo anterior se ratifica que los microorganismos son una excelente herramienta para la minimizar la contaminación por derrames de hidrocarburos. Como lo describió uno de los autores consultados no cabe duda que los microorganismos son “los pequeños grandes gigantes” de la naturaleza.

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