Evaluación de la técnica de ELISA indirecta empleando un péptido híbrido derivado de la proteína TRP36 para el diagnóstico de caninos infectados con Ehrlichia canis.

Laura Marcela Perdomo Serrato

Universidad de Ciencias Ambientales y Aplicadas Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Medicina Veterinaria Bogotá, D.C., Colombia Junio, 2022

Evaluación de la técnica de ELISA indirecta empleando un péptido híbrido derivado de la proteína TRP36 para el diagnóstico de caninos infectados con Ehrlichia canis. Laura Marcela Perdomo Serrato

Trabajo presentado como requisito para optar al título de: Médico veterinario

Director (a):

Gabriel Andrés Tafur Gómez Médico Veterinario Zootecnista MSc, PhD

Codirector (a):

Fernando Borda Rojas Médico Medico Veterinario Esp, cPhD

Línea de Investigación:

Sanidad animal Grupo de Investigación:

Ciencia animal

Universidad de Ciencias Ambientales y Aplicadas Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Medicina Veterinaria Bogotá, D.C., Colombia Septiembre, 2022

Nota de aceptación:

Aprobado por el Comité de Programa en cumplimiento de los requisitos exigidos por el Acuerdo Superior N° 11 de 2017 y Acuerdo Académico N° 41 de 2017 para optar al título de (escriba el nombre del Programa)

Jurado

Jurado

Bogotá, __Día__ de _Mes__de ___Año_____

La ciencia se compone de errores, que a su vez

son los pasos hacia la verdad”

Jules Verne

AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer en primer lugar a Dios por guiarme en el camino y permitirme conseguir los objetivos que me propongo día a día. También por darme la bendición de alcanzar este logro. Expreso mis agradecimientos a quienes siempre me apoyaron, principalmente mis padres Yolanda Serrato y Medardo Perdomo, quienes, con sus palabras, consejos y ayuda, me contribuyeron para culminar esta etapa de mi crecimiento profesional; realizando mis sueños, que más que un éxito propio, es en conjunto con ustedes, ya que fueron el motor y la motivación en esta meta propuesta.

Igualmente, extiendo mi gratitud a mi tutor de proyecto Prof Gabriel A. Tafur quien fue un pilar importante en el desarrollo de esta investigación, al ser mi guía y compartir su conocimiento en cada una de las etapas de este trabajo y quién también me incentivó a desarrollar este proceso tan interesante.

A cada una de las personas que trabajan y asisten en los diferentes laboratorios de la universidad, por su disposición y paciencia, al permitirme desempeñar cada una de las actividades necesarias para el desarrollo de la investigación. Del mismo modo, agradezco a mis compañeras de estudio, quienes llevaban a cabo una investigación similar y en tal sentido, compartieron parte de sus experiencias, útiles en la gestión y desarrollo del presente estudio.

VI Resumen

RESUMEN

Ehrlichia canis es el agente causal de la ehrlichiosis monocitica canina (ECM), enfermedad que requiere de pruebas para diagnosticar con mayor capacidad discriminatoria entre otros microorganismos de la familia Anaplasmatacea, con los cuales se puede presentar coinfección y presentar reacción cruzada. Por consiguiente, el presente estudio analizó el ensayo de ELISA indirecto teniendo como antígeno un péptido híbrido derivado de las porciones repetidas en tándem de la proteína TRP-36. Para de esta manera detectar anticuerpos de caninos infectados con E. canis y contribuir a mejorar la capacidad diagnostica. Para esto, se determinaron los valores de efecto Elisa y prozona, seguido de la evaluación de la ELISA empleando muestras perros sintomáticos y asintomáticos que permitió identificar una sensibilidad (Se) de 57.1%, especificidad (Ep) 100%, TFP (43%), TFN (0%), VPP (25%), VPN (100%) y eficacia (36%) relacionados con la población de muestras analizadas. Por otro lado, se realizó la evaluación de la ELISA empleando muestras previamente diagnosticadas con la prueba de ANIGEN fundamentado en la TRP-19. Con esta evaluación, se identificó una Se de 69%, Sp de 33%, PPV de 66,7%, PPN de 35,7%, TFN de 0,310, TFP de 0,667, Rver positiva de 1,034 y negativa de 0,931. Finalmente, se realizó la prueba de campo para identificar muestras de un área endémica, demostrando una diferencia estadística significativa p >0,05 entre muestras positivas y negativas. Con el conjunto de las pruebas realizadas, se comprobó la precisión y exactitud del ensayo demostrando la capacidad discriminatoria de la prueba. De igual forma, el antígeno empleado tiene características que lo denominan especie-específico, lo cual le otorga una ventaja sobre otras pruebas que puedan presentar reacciones cruzadas con otros agentes e identificar caninos positivos.

Palabras Claves: Bacteria intracelular, infecciones caninas, prueba Elisa indirecta, proteína

TRP-36

Lista de símbolos

ABSTRACT

Ehrlichia canis is the causal agent of canine monocytic ehrlichiosis (CME), a disease that requires tests to diagnose with greater discriminatory capacity among other microorganisms of the Anaplasmatacea family, with which co-infection and cross-reaction may occur. Therefore, the present study analyzed the indirect ELISA assay having as antigen a hybrid peptide derived from the tandemly repeated portions of the TRP-36 protein. To detect antibodies from canines infected with E. canis and contribute to improving diagnostic capacity. For this, the Elisa and prozone effect values were determined, followed by the ELISA evaluation using symptomatic and asymptomatic dog samples, which allowed identifying a sensitivity (Se) of 57.1%, specificity (Ep) 100%, TFP (43%), TFN (0%), PPV (25%), NPV (100%) and efficacy (36%) related to the population of samples analyzed. On the other hand, the ELISA evaluation was carried out using samples previously diagnosed with the ANIGEN test based on TRP-19. With this evaluation, a Se of 69%, Sp of 33%, PPV of 66.7%, PPN of 35.7%, TFN of 0.310, TFP of 0.667, positive Rver of 1.034, and negative of 0.931 were identified. Finally, the field test was carried out to identify samples from an endemic area, showing a significant statistical difference of p>0.05 between positive and negative samples. With all the tests carried out, the precision and accuracy of the test were verified, demonstrating the discriminatory capacity of the test. Similarly, the antigen used has characteristics that call it species-specific, which gives it an advantage over other tests that may present cross-reactions with other agents and identify positive canines.

Keywords: Intracellular bacteria, canine infections, Elisa indirect test, TRP-36 protein.

VII

Contenido

CONTENIDO

Pág.

RESUMEN ......................................................................................................................... VI CONTENIDO .................................................................................................................... VII LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... VI LISTA DE SÍMBOLOS Y/O GLOSARIO............................................................................1

2.

OBJETIVOS ...................................................................................................................3

3.

MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................4 3.1. Muestras para la evaluación de ELISA indirecta ...........................................................4 3.2.Técnica de ELISA indirecta para determinar el Efecto Prozona y Cutt-Off...................4

3.3. Realización de la prueba ELISA para identificar verdaderos positivos y verdaderos

negativos de caninos clínicamente sintomáticos y asintomáticos ........................................5 3.4. Técnica de Elisa indirecta para verdaderos positivos (VP) y verdaderos negativos (VN) de muestras de animales previamente diagnosticados con el test rápido de Anigen ............6 3.5. Técnica de ELISA indirecta para confirmación diagnóstica en campo .........................6 3.6. Análisis estadístico de la precisión de la técnica ...........................................................7

4.

RESULTADOS ..............................................................................................................8

5.

DISCUSIÓN .................................................................................................................12

6.

CONCLUSIONES ........................................................................................................16

7.

RECOMENDACIONES ..............................................................................................17

8.

BIBLIOGRAFÍA ..........................................................................................................17

IX Contenido

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Curva ROC .......................................................................................................... 13 Figura 2. Gráfico de intervalos de densidad óptica............................................................. 14 Figura 3. Gráfico sintomáticos-asintomáticos .................................................................... 14 Figura 4. Gráfico representativo de la prueba de fuerza ..................................................... 16

LISTA DE SÍMBOLOS Y/O GLOSARIO

Ehrlichiosis Monocítica Canina (EMC).

Verdaderos Positivos (VP): Enfermos con la prueba positiva.

Falsos positivos (FP): No enfermos con la prueba positiva.

Falsos negativos (FN): Enfermos con la prueba negativa.

Verdaderos negativos (VN): No enfermos con la prueba negativa.

Sensibilidad (Se).

Especificidad (Es).

Valor predictivo positivo (VPP).

Valor predictivo negativo (VPN).

Densidad óptica (D.O).

Miligramo (µg).

Punto de corte (cutt off).

Albúmina de suero bovino (BSA)

Inmuno Fluorescencia Indirecta (IFI)

Solución salina tamponada con fosfato (PBS)

Tasa de falsos positivos ( TFN)

Tasa de falsos negativos ( TFP)

Area under the curve ( AUC)

1. INTRODUCCIÓN

La infección causada por Ehrlichia canis hace parte del complejo de infecciones trasmitidas por garrapatas, que en América del sur puede emplear como vector a Rhipicephalus sanguineus, que gracias al cambio climático y fragmentación de hábitat puede presentar un nuevo patrón de dispersión y adaptación a nuevos ecosistemas, favoreciendo la expansión de E. canis tanto a nivel mundial como en Colombia, lo cual hace que este artrópodo convierta a este patógeno en un agente emergente para nuevos lugares (Jones et al., 2008) Además, por tratarse de una garrapata trioxenica puede anidarse en entornos domiciliarios y peridomiciliarios del hombre, facilitando el riesgo de transmisión entre caninos y seres humanos (Gray et al., 2013). Lo que representa un potencial zoonótico (Bouza-Mora et al., 2017; Perez et al., 2006), y un riesgo para la salud pública. Igualmente, la propagación de E. canis a nuevos entornos puede influir en la variabilidad genética y antigénica del organismo (Cabezas-Cruz et al., 2019; Moraes-Filho et al., 2015).

Esta variabilidad puede afectar el diagnóstico de la EMC, siendo que las inmunocromatográficas fundamentadas en antígenos de subunidades pueden presentar reacción cruzada con otros patógenos del mismo género u otra familia, lo cual también se ha evidenciado con la IFA fundamentada en antígenos crudos (Franco-Zetina et al., 2019), que a pesar de ser considerada el estándar de oro tiene limitaciones, que incluyen reactividad serológica cruzada con otras especies de Ehrlichia spp además de los requisitos de costosos reactivos y laboratorio (Aguiar et al., 2007; O’connor et al., 2006). Por otro lado, la falta de evidencia en la verificación de las pruebas comerciales, que junto con las falencias en la práctica medico veterinaria sugieren un valor reducido en el diagnóstico. En relación con lo anterior, la búsqueda de nuevos antígenos de subunidades a partir de proteínas conservados que estén presentes en las bacterias circulantes en el territorio nacional o que circulen en Latinoamérica puede resultar esencial para disminuir la tasa de falsos negativos y positivos (Arroyave et al., 2020). Así, los antígenos derivados de las proteínas TRP 36 y TRP 19 pueden ser alternativas importantes generar un diagnóstico más confiable siempre y cuando se reconozcan las porciones antigénicas presentes en un escenario epidemiológico.

Previamente se identificó que los péptidos derivados de la TRP-36 pueden contribuir al diagnóstico temprano de la infección (Cárdenas et al., 2007). Igualmente, empleando los péptidos de las regiones repetidas en tándem como antígeno en ELISA, se identificaron las porciones de TRP-36 circulantes en Brasil y se propuso un diagnóstico acorde a la realidad epidemiológica (Doyle et al., 2006). Igualmente, se identificó que esta proteína TRP-36 está asociada a procesos de adhesión e internalización y evasión de la respuesta inmune por parte de la bacteria (Zweygarth et al., 2014). TRP-36 es un antígeno que puede discriminar entre los anticuerpos producidos por E. canis y E. chaffensis lo cual evitaría la reacción cruzada y representaría una ventaja sobre otras pruebas y antígenos (Cárdenas et al., 2007). Además, este antígeno puede usarse para distinguir serológicamente infecciones e identificar coinfecciones por diferente genotipo que puede ayudar a determinar la seroprevalencia de varios genotipos en el área de estudio (Aguiar et al., 2016). Por lo anterior se hace necesario estudiar la capacidad diagnóstica de TRP-36 a partir de los péptidos que circulen en la realidad epidemiológica colombiana. Por lo tanto, el presente trabajo evaluó la técnica de ELISA indirecta empleando un péptido hibrido derivado de la proteína TRP36 para el diagnóstico de EMC.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Evaluar la técnica de ELISA indirecta empleando un péptido hibrido derivado de la proteína TRP36 de para el diagnóstico de Ehrlichiosis Monocítica Canina.

2.2. Objetivos específicos

• Designar las muestras adecuadas para la evaluación de la técnica.

• Realizar la técnica de ELISA indirecta empleando el péptido híbrido.

• Realizar el análisis estadístico de la prueba Elisa

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Muestras para la evaluación de ELISA indirecta

Teniendo en cuenta que para identificar el grado de precisión de la prueba y la validación de esta es necesario contar con muestras que permitan establecer los datos de sensibilidad y especificidad. Para obtener las muestras controles, se emplearon muestras de sueros previamente diagnosticados, seleccionando la misma cantidad de muestras positivas y negativas. Por otro lado, para la obtención de los sueros problema se tomaron muestras de un área endémica.

3.2. Técnica de ELISA indirecta para determinar el Efecto Prozona y Cutt-Off

Para realizar esta prueba se empleó un péptido hibrido diseñado a partir de las regiones conservadas en tándem de la proteína TRP-36, previamente identificadas como US TEDSVSAPA (3670) (Aguiar et al., 2013), CR EASVVPAAEA (3672) (Geiger et al., 2018), este péptido se sintetizo por el sistema t-boc en la Pontificia Universidad Católica Valparaíso por la doctora Fanny Guzmán. A la llegada del laboratorio, el péptido se Re suspendió en agua MillQ al volumen de 1mL por instrucción del fabricante. Posteriormente el péptido se diluyo en las concentraciones de 0,5, 1 y 1,5 μg/ml en solución de carbonato (0,159g Na2CO3; 0,293g NaHCO3; H20 milli Q q.s.p. 100mL, pH de 9,6), en el volumen de 200 μl por pozo, los cuales se ubicaron en la placa NUNC-Maxisorb y se incubaron por 18h a 4°C. Pasado este tiempo, la placa se lavó con tampón de lavado 4 veces (9,0g de NaCl y 1000mL de H2O MilliQ) en volumen de 200 μl por pozo, para luego agregar el tampón de bloqueo (3g BSA en 100ml de PBS con pH de 7.4) para inhibir los sitios inespecíficos de unión del Ag durante 1h a 37°C. Posteriormente, se realizaron los lavados anteriormente mencionados, después se adicionaron tanto el suero control negativo como positivo en duplicado para cada una de las concentraciones del péptido (obtenidos de caninos previamente diagnosticados) en diluciones seriadas de 1:25, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:300, 1:400 y 1:600 en tampón de incubación (1g BSA en 100ml de PBS, pH de 7.4) y se mantuvieron por 2h a 37°C. Luego

se realizaron los respectivos lavados y pasado este tiempo, se adicionó el anticuerpo secundario en el volumen de 200 µl por pozo, compuesto por IgG de conejo Anti-canino conjugado con peroxidasa (Sigma A6792) en la dilución de 1:5000 con solución de incubación durante 2 h a 37°C. Así mismo, se realizaron los respectivos lavados para luego adicionar el tampón sustrato (7,19g Na2HPO4, 5,19g ácido cítrico y 1000mL de H2O milli- Q) y solución de revelado (20ml de Tampón sustrato, 4mg de O.P.D. (qfenildiaminobenzeno) y 2,5 μl de H2O2) durante 20 min/37°C. Pasado este tiempo la placa se leyó en el filtro de 495nm empleando el equipo BIO-RAD modelo 680. Posteriormente, los valores de Densidad Óptica (D.O) fueron empleados para los análisis consecutivos.

3.3. Realización de la prueba ELISA para identificar verdaderos positivos y

verdaderos negativos de caninos clínicamente sintomáticos y asintomáticos Luego de determinar el efecto prozona y el punto de corte basados en el resultado del ítem anterior, el péptido se diluyo a una concentración de 0,5 μg/ml en tampón carbonato para un volumen de 200 µl por pozo, los cuales se distribuyeron en 1 placa y se dejaron en incubación por 18h a 4°C. Pasado este tiempo, la placa se lavó con tampón de lavado y se agregó tampón de bloqueo durante 1h a 37°C. Posteriormente, se lavaron las placas y se agregaron en duplicado los sueros controles positivos y negativos (obtenidos de caninos previamente diagnosticados) y los sueros problema que se manejaron con muestras recolectadas de perros con clínica positiva y que además provenían de una zona endémica, por otro lado muestras presuntamente asintomáticos, recolectados de los canes que se encontraban en las perreras de la universidad, se manejaron los sueros de estas muestras en la dilución de 1:200 suspendidos en tampón de incubación, dejándolos durante 2h a 37°C. Pasado este tiempo, se lavaron las placas para agregar el anticuerpo secundario anti-canino en la dilución de 1:5000, durante 2h a 37°C Luego, se realizaron los lavados para incorporar en seguida la solución de revelado con tampón sustrato durante 20 min/37°C. La lectura se realizó con filtro 495nm en el equipo BIO-RAD. Con los valores de D.O se realizaron los análisis consecutivos.

3.4. Técnica de Elisa indirecta para verdaderos positivos (VP) y verdaderos

negativos (VN) de muestras de animales previamente diagnosticados con el test rápido de Anigen Teniendo en cuenta el resultado del test rápido de Anigen, se identificaron los Verdaderos Positivos (VP) y Verdaderos Negativos (VN) de muestras de animales provenientes de san Andrés. Para esta prueba se emplearon placas previamente sensibilizadas con el péptido en la concentración de 0,5 μg/μl por pozo. Las placas fueron lavadas como anteriormente se describe, para proceder a adicionar el tampón de bloqueo durante 1 hora a 37° C. Pasado ese tiempo, las placas se lavaron nuevamente y se adicionaron en duplicado 48 sueros problema, donde 44 provenían de perros de San Andrés y 4 muestra de otro laboratorio distribuidos en

2 placas que contaban cada una con misma cantidad de controles siendo 8 positivos y 8

negativos, los cuales fueron diluidos en solución de incubación a 1:200, lo anterior se dejó incubando a 2 horas en temperatura de 37°C. Una vez incubados los sueros problema, se realizaron los lavados correspondientes para luego adicionar el anticuerpo secundario en dilución 1:5000 (Sigma A6792) con solución de incubación durante 2 h a 37°C. Luego, se lavaron nuevamente las placas para finalmente adicionar la solución de revelado y continuar la incubación durante 20 minutos a 37 °C en cuarto oscuro. La absorbancia se midió en un lector de placas automático BioRad con filtro 495nm. Una vez obtenidos los valores de D.O se realizaron los análisis consecutivos.

3.5. Técnica de ELISA indirecta para confirmación diagnóstica en campo

Para esta prueba se emplearon placas previamente sensibilizadas con el péptido de elección del ítem anterior en la concentración de 0,5 μg/ml por pozo. Las placas fueron lavadas como anteriormente se describe, para proceder a adicionar tampón de bloqueo durante 1 hora a 37°

C. Pasado ese tiempo, las placas se lavaron nuevamente, consiguiente se analizaron y

agregaron en duplicado los sueros problema provenían de un área endémica (Girardot), junto con los 4 controles de cada uno positivos y negativos, estos sueros fueron diluidos en solución de incubación a 1:200, la mezcla de estos sueros se dejó incubando a 2 hora en temperatura de 37°C. Una vez incubados los sueros problema, se realizaron los lavados correspondientes para luego adicionar el anticuerpo secundario en dilución 1:5000 (Sigma A6792) con

solución de incubación durante 2 h a 37°C. Posteriormente, se lavaron nuevamente las placas para finalmente adicionar la solución de revelado durante 20 minutos a 37 °C en cuarto oscuro. La absorbancia se midió en un lector de placas automático BioRad con filtro 495nm. Una vez obtenidos los valores de D.O se realizaron los análisis consecutivos.

3.6. Análisis estadístico de la precisión de la técnica

Posterior a la lectura de cada ELISA, los valores de D.O (densidad óptica) se llevaron a tablas de Microsoft Excel. Para el cálculo del efecto prozona y Cut-Off inicial se tuvieron en cuenta los valores de D.O obtenidos por cada concentración del péptido, así como las diluciones seriadas de las muestras negativas y positivas. Con estos valores se calculó el valor medio de densidad óptica D.O para cada dilución y luego para las diluciones en serie por cada muestra, igualmente, para el valor medio de D.O por muestra se calculó el valor de la desviación estándar (D.S). El Cut-Off se calculó considerando el valor medio de D.O más dos unidades de la D.S de las muestras, en concordancia con el efecto de prozona (Frey et al., 1998) que se calculó teniendo en cuenta los valores medios de D.O por cada dilución seriada y concentración del péptido analizado por la t de student con un p˂0,05, determinando la concentración y la dilución donde no se detectaba diferencia estadística.

De la misma forma se calculó la D.S de las muestras, con el cual se calculó el Cut-Off considerando el valor medio de D.O más dos unidades de la D.S de las muestras y por otro lado la sensibilidad y la especificidad se calcularon de forma matemática y por medio de GraphPad Prism (versión 5 para Windows). Para los cálculos matemáticos se emplearon las fórmulas de Se = TP/(TP+FN) X 100 Y Sp = TN/(TN+FP) X100. Se calculó la Tasa de Falsos Negativos (TFN) con la fórmula FN/(TP+FN) × 100, la Tasa de Falsos Positivos (TFP) FP / (TN+FP) × 100. La eficiencia diagnóstica TP + TN / (TN+FP+TP+FN) × 100.

Se utilizaron las siguientes fórmulas: Valor predictivo positivo = TP / (TP + FP) × 100, Valor predictivo negativo = TN / (TN + FN) × 100, donde TN, TP, FN y FP representan verdadero negativo, verdadero positivo, falso negativo y falso positivo, respectivamente. El punto de corte se estableció mediante la curva ROC, así como la tabla de contingencia y el valor Fisher.

Finalmente se fijó una Razón de verosimilitud positiva con la fórmula Se / 1-Sp, junto a la razón de verosimilitud negativa con la fórmula 1-Se / Sp.

4. RESULTADOS

4.1. Técnica de ELISA indirecta para determinar el Efecto Prozona y Cut-Off

Teniendo en cuenta los valores de D.O que se obtuvieron por cada una de las diluciones seriadas de las muestras negativas 1:25, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:300, 1:400 y 1:600 en las distintas concentraciones del péptido 0,5, 1 y 1,5 μg/ml, presentaron diferencia estadística (p<0,0001) mediante la ANOVA de una vía. Posteriormente, al realizar la comparación múltiple de tukey se identificó que los valores de D.O obtenidos en la concentración de 0,5 con las diferentes diluciones presentaban diferencia estadística (p<0,05) con las demás concentraciones 1 y 1,5.

Posteriormente, la ANOVA entre las diferentes diluciones en la concentración de 0,5 μg/ml mostró diferencia estadística (p<0,05), siendo que la prueba de comparación múltiple de Games-Howell's identificó que no hubo diferencia estadística (p>0,05) sugiriendo que el efecto Elisa se presentaba entre las diluciones menores a 1:200 ( 1:300, 1:400, 1:600), igualmente se identificó que el efecto de prozona se presentaba en la concentración de 0,5 μg/ml del péptido en las diluciones mayores a 1:200 de los sueros control negativo (1:25, 1:50 1:100 1:150).

4.2. Prueba de ELISA para identificar caninos sintomáticos y asintomáticos

Empleando el péptido en la concentración de 0,5 μg/ml con muestras de caninos sintomáticos y asintomáticos para la Ehrlichiosis Monocítica Canina (EMC) en la dilución de 1:200, junto con los controles positivos (caninos positivos por PCR) y negativos (cachorros de un área no endémica) se obtuvieron valores de D.O que generaron un valor de Cut-Off de 0,322, lo cual permitió identificar 16 muestras verdaderas positivas (VP), 4 muestras verdaderas negativas (VN), 12 muestras fueron falso positivos (FP) y 0 muestras falso negativos (FN). Posteriormente se confirmaron los valores de Se (100%) y Sp (25%). Igualmente, se

identificaron los valores de TFP (75%), TFN (0%), VPN (100%) y VPP (57%) que están relacionados con la población de muestras analizadas. Por otro lado, con los controles negativos y positivos se realizó la curva ROC (fig. 1) que permitió identificar un valor de área under the curve (AUC) de 1, con un intervalo de confianza del 95% (IC 95%) de 1,000- 1,000, con lo que se determina que, con la evaluación de los controles negativos y positivos, la prueba es competente para discriminar entre ambas poblaciones (fig. 2). De igual forma, se realizó la prueba exacta de Fisher con los valores de VP, VN, FP y FN en una tabla de contingencia donde se organizaron las muestras de animales sintomáticos y asintomáticos y se identificó que no hubo diferencia estadística (p> 0,1012) entre los valores analizados. Del mismo modo se determinaron los valores de Rver+ (0,57), Rver- (0,43) y se calculó la eficiencia de la prueba (36%).

0

50

100

150

0

50

100

150

100% - Specificity% Sensitivity%

Figura 1. La gráfica representa un porcentaje del 100% de sensibilidad y especificidad, de acuerdo con los controles, es decir que la prueba tiene la capacidad para determinar muestras positivas y negativas, representando una gran área bajo la curva lo que determina la confiabilidad de la prueba.

Figura. 2. El gráfico de caja representa las absorbancias de las muestras control positivas y negativas en valores de densidad óptica medidos a 495nm.

Figura 3. El gráfico de barras representa los resultados que se obtuvieron con respecto a las muestras, donde se obtuvo un porcentaje de falsos positivos.

4.3. Técnica de ELISA indirecta para verdaderos positivos (VP) y verdaderos

negativos (VN) de muestras de animales previamente diagnosticados con la prueba rápida de Anigen Esta Elisa se desarrolló empleando muestras previamente diagnosticadas con el test rápido de Anigen, con lo cual se puedo comparar los resultados de esa prueba con la capacidad

diagnostica de esta Elisa con el péptido híbrido, obteniendo valores de densidad óptica con lo cual se determinó para cada una de las 2 placas un Cut off de 0,700 para la primera placa y de 0,510 para la segunda placa, permitiendo clasificar los resultados en una tabla de contingencia en función del cut off, determinando VP: 20 muestras, VN: 5, además FP:9 y FN:10, consiguiente se evaluó la sensibilidad y especificidad, establecidos con los siguientes porcentajes, Se 66.6 % y Sp 35.7%, es decir que en este caso, la prueba tiene mayor capacidad para determinar casos positivos frente a negativos, a su vez esto se refleja con un mayor porcentaje de VPP: 69%, VPN: 36%, TFN:0,310, TFP: 33%.

De igual forma se establecieron los valores de verosimilitud positiva 1,046 y negativa 0,916 y se compararon los resultados de seropositividad entre la prueba de Anigen 68% y esta ELISA realizada 45%, reconociendo que esta última represento un menor resultado. Por otro lado, se realizó una evaluación de la curva ROC, obteniendo un área bajo la curva de 1,000, con un intervalo de confianza de 95% y un p value = 0,0008, determinándola como una prueba con capacidad discriminatoria y amplia variabilidad entre positivos y negativos.

4.4. Prueba ELISA, test de fuerza, muestras Girardot

La prueba ELISA se desarrolló basado en muestras tomadas de Girardot Colombia, para establecer una evaluación de la capacidad de la prueba para discriminar muestras en campo, empleando 81 sueros problema y 4 de control positivo, 4 negativos, con los cuales se obtuvo resultados de D.O con lo que se estableció un Cut off de 0,374 para ambas placas a partir de los controles negativos, en relación con eso se determinó porcentaje de seropositivos 66,3% y seronegativos 32,5%, luego se realizó el análisis con la prueba t student de muestras independientes o no pareada, con que se compararon ambas poblaciones, estableciendo un P value <0,0001, determinando una significancia estadística entre las medias de la densidad óptica de las muestras, siendo de x̄ = 0,486 para positivos y x̄ = 0,314 negativos, con lo cual se observa la diferencia entre las poblaciones y a partir de esto se evaluó el intervalo de confianza, siendo ICP 95% = 0,3424-0,4495, ICN 95% 0,2952-0,3347, con lo que se indican los valores en que se mueven las muestras.

Figura 4. El grafico de caja representa los índices de D.O en los que se mueven las muestras positivas y negativas, con una evaluación t student con un valor de p value < 0,0001.

5. DISCUSIÓN

Partiendo de los requerimientos para la validación de métodos diagnósticos de la OIE (OIE, 2021), se inició por el cálculo de Cut off threshold que permitió identificar el efecto Elisa y el efecto Prozona, sobre los cuales se establecieron los parámetros para la reproductibilidad

de la técnica y de este modo poder realizar los ensayos de determinación de sensibilidad y especificidad de esta. Estos parámetros se tuvieron en cuenta para el análisis y la validación de la ELISA indirecta fundamentada en el péptido sintético hibrido, sobre el cual se identificaron valores de concentración de 0,5 μg/ml y una dilución de los sueros en 1:200 con base en la diferencia estadística. Estos valores presentaron concordancia con los encontrados en la ELISA indirecta fundamentada en la proteína recombinante gp36, donde se mostró un efecto ELISA con una dilución de 1:250 y concentración del antígeno de 0,3 μg/ml. La similitud encontrada entre la Elisa fundamentada en el péptido hibrido y la proteína recombinante gp36 puede deberse a que la secuencia del péptido hibrido tiene un 75% de identidad con el antígeno gp36 posterior al BLAST de Uniprot. Sin embargo, no se relaciona con los valores encontrados en la ELISA fundamentada en las proteínas recombinantes gp19, p28, gp200N y gp200C, cuyas concentraciones fueron de 1,2 μg/ml - 2.5 μg/ml y dilución similar a 1:250 (Cardenas et al., 2007). Esta diferencia del efecto Elisa y el Cut-off podría deberse a la diferencia entre los diferentes antígenos.

A partir de los resultados del ensayo de sintomáticos y asintomáticos, con muestras seleccionadas por medio de criterios clínicos y otras de perros sin sintomatología ni antecedentes de exposición al agente, se obtuvo valores de sensibilidad 100% y especificidad del 25%, de igual forma, los valores de VPP Y VPN fueron de 57% y 100%, esto indica que las muestras positivas presentaban anticuerpos que reconocían alguna de las regiones repetidas en tándem de la gp 36, sugiriendo que E. canis durante el proceso de infección pudo generar cambios en su conformación antigénica expresando los péptidos US-TEDSVAPA y CR-EASVVPAAEA durante su replicación como mecanismo de evasión de la respuesta inmune relacionado con esto, en un estudio realizado en la ciudad de Medellín con muestras caninas previamente diagnosticadas por IFA confirmaron el reconocimiento antigénico para las mismas porciones repetidas en tándem de forma individual y conjunta (Arroyave et al., 2020). No obstante, la tasa de falsos positivos del 75% en animales asintomáticos con procedencia y antecedentes desconocidos sugiere una plausible exposición previa a EMC y esto puede explicar que tuvieran anticuerpos circulantes frente a alguna de las porciones repetidas en tándem. Esto debido en parte a que la gp36 como la principal proteína inmunorreactiva durante la replicación de E. canis puede contener abundantes epítopos B

capaces de inducir tanto células B de memoria como anticuerpos (Bélanger et al., 2002; Doyle et al., 2006).

Del ensayo con muestras recolectadas de caninos de San Andrés que habían sido diagnosticadas mediante la prueba rápido de Anigen, se identificó un valor de Se 67%, Sp 36%, junto con VPP 69%, VPN 33%, LR + 1,046 y LR- 0,91, que infiere una mayor capacidad diagnostica para la ELISA con el péptido hibrido, siendo que, en relación con las muestras analizadas, en este estudio se identificó una mayor capacidad para detectar muestras positivas. Sin embargo, la ELISA de este estudio mostro una capacidad reducida para discriminar los pacientes negativos al conocer muestras falso positivo, de ahí que el test rápido de Anigen haya representado mayor porcentaje de seropositividad de un 68% frente a un 45%, lo anterior puede tener relación con el tipo de antígeno de cada prueba, ya que como se ha reportado Anigen se basa en un OVM derivado de la gp19 y presenta altos índices de sensibilidad 97.6% y especificidad 99.0% en relación al IFA (Insuvet, 2009) (Bionote, 2019), mientras que la Elisa indirecta de esta investigación está fundamentada en un péptido hibrido derivado de los genotipos CR y US de TRP36, el cual presento porcentajes de exactitud diagnóstica bajos, pero permitió reconocer la presencia de anticuerpos específicos contra

ambas proteínas y genotipos, lo que implica que los perros pueden estar coinfectados o

infectados en diferentes momentos por diferentes antígenos Ehrlichiales, del mismo modo este resultado respalda la posibilidad de que se produzca una recombinación genética entre los distintos genotipos (Aguiar et al., 2016). así mismo favorece que se posibilite la hibridación genética en la naturaleza, como se informó sobre este hallazgo en un estudio realizado por (Aguiar et al., 2013) en el que se observó una secuencia híbrida de TRP36 asociada con la región N-terminal del aislado Cba16 en la región TR del genogrupo estadounidense que contenía la secuencia N-terminal del genogrupo brasileño, de esta forma se corrobora que durante el proceso de infección de E.canis puede haber coinfección y por ende recombinacion.

El último ensayo se realizó con muestras de una población de caninos de la cuidad de Girardot, con lo cual se buscó establecer la capacidad para discriminar muestras en campo, conociendo las condiciones de hacinamiento, salud animal y la predisposición ambiental, de

acuerdo con lo anterior, los resultados fueron en relación a los porcentajes de seropositividad del 66,2 % y seronegatividad del 32,5%, lo cual representa dentro de la población de estudio un alto grado de positividad, sin embargo este porcentaje es menor al reportando en un estudio realizado por Mayra Guete y Luisa Matiz, en el que emplearon las mismas muestras que en este ensayo, pero con una Elisa indirecta basada en un antígeno peptídico sintético derivado de TRP36 del genotipo US, con el cual se identificó una seropositividad del 89.2%, lo anterior se puede deber a que el empleo del genotipo US de forma individual facilita el reconocimiento de anticuerpos, mientras que la Elisa basada en el péptido hibrido, puede ser reconocida por anticuerpos en fases más progresivas de la enfermedad, debido a que la recombinación genética entre los genotipos US Y CR puede desarrollarse por presión inmunológica, como mecansimo de evasion de la respuesta inmune, reconociendo que E.canis ha realizado procesos de evolución, que no son del todo conocidos, sin embargo esta prueba Elisa tiene la facultad para identificar muestras en campo, ya que discrimina entre ambas poblaciones, lo que puede ser de utilidad para establecer estudios de seroprevalencia, que son importantes para reconocer la distribución de E.canis sabiendo que la situación en Colombia tiene información limitada sobre esto aspectos, y que el tener pruebas confiables a partir de cepas de E.canis que se circulan en el territorio nacional, puede acercar más la realidad al evitar reacciones cruzadas a partir del antígeno especie-especifico, también en este caso el poder relacionar entornos similares en cuanto a condiciones ambientales, como lo es, la cuidad de Ibagué, el reporte de seropositividad es del 31,66%, con la utilización de un kit IFI (Salazar et al., 2014), esto permite denotar casuística o reporte de la incidencia de la enfermedad, lo cual sirva para estudios epidemiológico, ya que en Colombia hay un alto índice de diagnóstico en algunas zonas.

6. CONCLUSIONES

El péptido sintético que se empleó́ como antígeno mostro una ventaja en relación con la capacidad de reconocer de forma específica anticuerpos producidos durante la infección por E. canis, lo que le confiere ventaja para reconocer verdaderos positivos y evitar reacciones cruzadas con otras especies de Ehrlichia spp o otros patógenos, al ser reconocidos por anticuerpos especificos.

Para poder valorar la validez de una prueba diagnóstica es preciso comparar sus resultados con los de un patrón de referencia en una serie de pacientes. Este tiene que contar con una validez contrastada o al menos aceptada por consenso, ya que la utilización de un patrón de referencia defectuoso puede introducir sesgos en las estimaciones de validez de la prueba diagnóstica. Un aspecto que podría ser importante en la selección de esta prueba es que las características operativas que se determinaron para la validez del ensayo se desarrollaron bajo la selección de muestras en campo, lo que aproxima los resultados obtenidos a una realidad en la clínica diaria, por lo cual es sensato aceptar la aplicabilidad de los resultados (Harrus et al., 2002).

7. RECOMENDACIONES

Para futuras investigaciones se recomienda hacer un screening con más péptidos y considerar el diagnóstico previo de las muestras por IFA, para así corroborar la utilidad diagnóstica de la prueba, ya que de esto parte la identificación de la capacidad discriminatoria de la misma, y la validación para el desarrollo del ensayo en la clínica diaria, de igual modo en la selección de muestras de campo, es parte fundamental establecer criterios clínicos de clasificación para la selección de muestras positivas, por otro lado la confiabilidad de una prueba puede medirse con el referente de otra técnica diagnóstica que en igualdad de condiciones pueda ofrecer resultados veraces y así de formar comparativa analizar los datos de sensibilidad, especificidad, VP, VN, FP, FN y de esto modo corroborar la utilidad de la prueba. Es importante, continuar con investigaciones de este tipo que, al emplear antígenos más específicos, contribuyan a disminuir la tasa de falsos positivos y negativos, lo anterior relacionado con que, tienen características especie específicas y disminuye la reacción inespecífica de anticuerpos, además de lo importante de reconocer que sean antígenos que circulen dentro del territorio nacional.

8. BIBLIOGRAFÍA

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