Medicina Veterinaria · 2026

Estandarización de prueba molecular QPCR para el diagnóstico de distemper canino

El Distemper canino es una enfermedad viral altamente contagiosa que afecta a los perros domésticos y a otros carnívoros, cuyo diagnóstico oportuno es fundamental para el control de la enfermedad. Consecuentemente, este trabajo se planteó con el objetivo de estandarizar la qPCR absoluta para la identificación y cuantificación del virus de Distemper canino (CDV, del inglés Distemper canine virus). Inicialmente se optimizó un protocolo “in house” de extracción de ARN viral a partir de vacuna comercial, evaluando cinco variantes metodológicas que incluyeron modificaciones en el uso de columnas, adición de etanol al 100% y variación en el número de lavados. El protocolo con mejores resultados de pureza y rendimiento se eligió de acuerdo con la concentración del ARN y la presencia de disminuido ADN residual determinadas mediante fluorometría. Posteriormente, se realizó la síntesis de ADNc, producto que fue utilizado como plantilla en la estandarización de una PCR convencional para la identificación del virus a través de la amplificación de un fragmento del gen N de aproximadamente 80pb. La cuantificación absoluta se realizó por triplicado mediante qPCR utilizando una curva estándar construida con diluciones seriadas de 2 × 10⁶ hasta 2 × 10¹; se evaluaron parámetros como pendiente, eficiencia, error, coeficiente de determinación (R²), intercepto y reproducibilidad. El protocolo seleccionado incluyó el uso de dos columnas para lograr eliminar la mayor cantidad de ADN y la precipitación del ARN con metanol al 100% (en proporción 1:1) previo al paso por la segunda columna y posterior lavado y elución. La amplificación fue específica, evidenciada por la presencia de un producto de 65pb separado mediante electroforesis en gel de agarosa y de un solo pico en la curva melting por encima de 75°C. Los valores de Cq oscilaron entre 15 y 33 ciclos; la concentración 6 × 10² presentó un promedio de 17.36 ± 0.64 y la concentración de 2 × 10² de 32.62 ± 0.58, con coeficientes de variación interensayo menor al 5 %. Las curvas estándar mostraron pendiente con promedio de -3.83 ± 0.19, eficiencia 1.83 ± 0.05, error 0.34 ± 0.08, R² 1.00 ± 0 e intercepto de 41.68 ± 0.99. La qPCR estandarizada demostró desempeño acorde con criterios internacionales, siendo una herramienta confiable para diagnóstico e investigación.