EVALUACIÓN DEL EFECTO DE DIFERENTES FUENTES DE NITRÓGENO
SOBRE EL DESARROLLO DE Fusarium oxysporum EN CONDICIONES DE
LABORATORIO
CARLOS ANDRÉS GAMBOA BELTRÁN
ZULMA ROCÍO JIMÉNEZ TORRES
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES - U.D.C.A
FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
BOGOTÁ, D.C
2017
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE DIFERENTES FUENTES DE NITRÓGENO
SOBRE EL DESARROLLO DE Fusarium oxysporum EN CONDICIONES DE
LABORATORIO
CARLOS ANDRÉS GAMBOA BELTRÁN
ZULMA ROCÍO JIMÉNEZ TORRES
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
INGENIERO AGRÓNOMO
DIRECTOR
JOHN JAIRO GÓMEZ PIEDRAS
CODIRECTOR:
FERNANDO PEÑA BARACALDO
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES - U.D.C.A
FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
BOGOTÁ, D.C
2017
NOTAS DE ACEPTACIÓN
____________________________ Director I.A. John Jairo Gómez Piedras
____________________________
Codirector I.A. Fernando Peña Baracaldo
____________________________ Jurado I.A. Msc. Mario Alejandro Cano Torres
____________________________ Jurado I.A. Danny Sanjuanelo
Bogotá, Noviembre 2017
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado primeramente a Dios que nos dio fortaleza, sabiduría y paciencia en su realización.
De igual manera dedicamos esta tesis a nuestras familias ya que ellos son el pilar principal de nuestras vidas y que con amor sentaron en nosotros las bases de responsabilidad y deseos de superación personal y profesional, finalmente a todas las personas que nos han apoyado en nuestra carrera universitaria para la conclusión satisfactoria de este trabajo.
AGRADECIMIENTOS
Damos gracias a Dios y a nuestras familias, por su constante apoyo, amor incondicional y que con sus consejos hicieron de nosotros personas de bien con sabiduría para sortear los caminos de la vida.
Damos un agradecimiento especial al profesor John Jairo Gómez Piedras, quien con su paciencia, experiencia y amabilidad contribuyo en el desarrollo de nuestras capacidades profesionales para la consecución y conclusión de este trabajo.
Al docente Fernando Peña, compañeros y amigos que nos han brindado su sapiencia y acompañamiento a lo largo de nuestra carrera universitaria.
Tabla de Contenido
1.
INTRODUCCIÓN................................................................................................................... 10
2.
OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................... 12
2.1.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 12
3.
MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 12
3.1.
Dinámica e importancia del nitrógeno en las plantas ........................................................ 12
3.2.
Influencia de la nutrición mineral en las plantas y su efecto en el desarrollo de enfermedades ................................................................................................................................. 13
3.3.
Generalidades de los marchitamientos vasculares ........................................................... 15
3.4.
Generalidades del genero Fusarium .................................................................................. 15
4.
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................... 17
4.1.
Ubicación del ensayo ........................................................................................................ 17
4.2.
Aislamiento de Fusarium oxysporum ............................................................................... 18
4.3.
Verificación microscópica de Fusarium Oxysporum ........................................................ 19
4.4.
Multiplicación de Fusarium Oxysporum ........................................................................... 19
4.5.
Variables evaluadas ........................................................................................................... 21
4.6.
Diseño experimental .......................................................................................................... 21
5.
Análisis de resultados y discusión .......................................................................................... 22
5.1.
Descripción del ensayo ...................................................................................................... 22
5.2.
Efecto de la fuente para la fecha uno ................................................................................ 23
5.3.
Efecto de la fuente para la fecha dos ................................................................................. 24
5.4.
Efecto de la dosis para la fecha dos ................................................................................... 25
5.5.
Efecto de la fuente para la fecha tres ................................................................................. 26
6.
CONCLUSIONES ................................................................................................................... 28
7.
RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 28 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................. 29
Anexos .............................................................................................................................................. 31
1.1.
Análisis descriptivo para crecimiento de Fusarium Oxysporum a diferentes fuentes de nitrógeno en la fecha 1 ................................................................................................................. 31
1.2.
Prueba de normalidad para la fecha 1 ............................................................................... 31
1.3.
Prueba de homocedasticidad para la fecha 1 ..................................................................... 31
1.4.
ANAVA para crecimiento de Fusarium Oxysporum para la fecha 1 ................................ 31
1.5.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 1 ............................................................... 31
1.6.
Análisis descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes dosis de nitrógeno para la fecha 1 ............................................................................................................... 32
1.7.
Prueba de comparación múltiple para fecha 1 ................................................................... 32
1.8.
Análisis descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes fuentes de nitrógeno en la fecha 2 ................................................................................................................. 32
1.9.
Prueba de Normalidad para la fecha 2 ............................................................................... 32
1.10.
Prueba de Homocedasticidad para la fecha 2 ................................................................ 32
1.11.
ANAVA para la fecha 2 ................................................................................................ 32
1.12.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 2 ........................................................... 33
1.13.
Análisis Descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes dosis de nitrógeno en la fecha 2 ................................................................................................................. 33
1.14.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 2 ........................................................... 33
1.15.
Análisis descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes fuentes de
nitrógeno en la fecha 3 ................................................................................................................. 33
1.16.
Prueba de Normalidad para la fecha 3 ........................................................................... 33
1.17.
Homocedasticidad para la fecha 3 ................................................................................. 34
1.18.
ANAVA para la fecha 3 ................................................................................................ 34
1.19.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 3 ........................................................... 34
1.20.
Análisis Descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes dosis de nitrógeno en la fecha 3 ................................................................................................................. 34
1.21.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 3 ........................................................... 34
Índice de graficas Grafica 1. Crecimiento de Fusarium Oxysporum enriquecido con diferentes fuentes de nitrógeno cada una de estas a tres dosis diferentes. ........................................................................................... 23 Grafica 2. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes dosis en condiciones de laboratorio en la fecha 1 ........................ 24 Grafica 3. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes dosis en condiciones de laboratorio en la fecha 2. ....................... 25 Grafica 4. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes dosis de nitrógeno en condiciones de laboratorio en la fecha 2 ........................................................ 26 Grafica 5. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes dosis en condiciones de laboratorio en la fecha 3. ....................... 27
Índice de ilustraciones Ilustración 1.Aislamiento de Fusarium Oxysporum proveniente de proteas .................................... 19 Ilustración 2. Montaje de Fusarium Oxysporum para observación en microscopio ......................... 19
Índice de tablas Tabla 1 Tratamientos aplicados en el ensayo uno ............................................................................. 20
RESUMEN
La fuente o forma de nitrógeno aplicada a los cultivos puede aumentar el desarrollo de patógenos, por lo que las plantas fertilizadas con nitrógeno son susceptibles al ataque de estos. El aumento de nitrógeno en tejidos de la planta la hacen más suculenta facilitando la colonización del patógeno, por lo que la presente investigación evaluó el efecto de la aplicación de tres fuentes diferentes de nitrógeno en el desarrollo de Fusarium oxysporum en condiciones de laboratorio en la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. El aislamiento de F. oxysporum se realizó a partir de material vegetal de proteas del genero Leucadendron sp. para después hacer multiplicación del patógeno en medios de cultivo con PDA enriquecido con UREA, Nitrato de amonio y Sulfato de amonio a diferentes dosis; luego de incubación a una temperatura constante de 25°C se evaluó su crecimiento mediante fotografías que posteriormente se procesaron digitalmente, encontrando que el sulfato de amonio es la fuente que presenta mayor inhibición de crecimiento.
Palabras clave: nitrógeno, inhibición de crecimiento, Fusarium oxysporum.
1. INTRODUCCIÓN
El hongo Fusarium oxysporum es una de las enfermedades vasculares de gran trascendencia en diversos agrosistemas. Este hongo patógeno representa una gran amenaza para todas las etapas de desarrollo de numerosas especies vegetales (Barnard y Blakeslee
2006).
Se ha evidenciado que el estado nutricional de los huéspedes favorece la aparición de este patógeno, (Vivas & Vrhovnik, 2009) siendo su comportamiento más agresivo en condiciones de alta o excesiva fertilización (Barnard y Blakeslee 2006). Vivas & Vrhovnik (2009) consideran de forma general que el nitrógeno en exceso podría llegar a inhibir las defensas de las plantas para responder frente a episodios severos del patógeno, dicho elemento también tiende a incrementar la aparición de enfermedades, pero a pesar de todo los efectos, dependen de la interacción con otros elementos como el fosforo y el potasio, la dosis de aplicación, el momento de aplicación, la forma del nutriente utilizado y de las interacciones del complejo suelo planta ambiente.
Las limitaciones fitosanitarias para algunos cultivos, como por ejemplo proteas, produce la denominada marchitez vascular ocasionada por Fusarium oxysporum y se empieza a
evidenciar al poco tiempo del establecimiento del cultivo, afectando de manera importante
la producción, ya que en plantas jóvenes al inicio de las hojas y brotes laterales se presenta
necrosamiento y muerte de la planta, lo que ocasiona una reducción severa en el número
de flores producidas por planta. (Martínez et al, 2014). En el cultivo de tomate la marchitez vascular es una de las enfermedades de mayor relevancia, ya que ocasiona pérdidas hasta
del 60% de los rendimientos, afectando también la calidad del producto (Amaral et al.,
2008).
El nitrógeno encontrado en la naturaleza está en forma no disponible para el desarrollo
y crecimiento de las plantas, por lo que la producción de cultivos con altos rendimientos, se asocia a la incorporación de grandes cantidades de fertilizantes nitrogenados, de manera que los cultivos solo son capaces de utilizar entre el 40-50% del nitrógeno aplicado (Cerón & Aristizabal, 2012).
Los factores más importantes que inciden sobre la respuesta entre patógenos y hospederos influenciados por el nitrógeno son: la fuente o forma de nitrógeno utilizada, la dosis y tiempo de aplicación del fertilizante nitrogenado (Baker, 1980). Vivas & Vrhovnik, (2009) encontraron que árboles de pino fertilizados con nitrógeno son más susceptibles, por lo que el aumento de nitrógeno en los tejidos de la planta la hace más suculenta, asegurando el éxito de la colonización del patógeno demostrando que la alta mortalidad en plantas atacadas por Fusarium oxysporum se debe al incremento del nitrógeno en la fertilización. Por lo anterior, se hace importante realizar una evaluación del efecto que pueda presentar diferentes fuentes de nitrógeno en el crecimiento de Fusarium oxysporum, puesto que la aplicación de fertilizantes incide positivamente en la productividad de los cultivos, es posible que tenga efectos negativos en tanto que puede aumentar el desarrollo de enfermedades y de patógenos asociados, por esta razón la respuesta obtenida a partir de la relación fertilizante nitrogenado y Fusarium oxysporum, pueda dar pautas para determinar el tipo de fuente nitrogenada que influya en la dinámica de enfermedades vasculares
causadas por este patógeno, que ha sido considerado uno de los más agresivos (Ares et al
2008).
2. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la aplicación de tres fuentes diferentes de nitrógeno en el desarrollo de Fusarium Oxysporum, en condiciones de laboratorio.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar el efecto in vitro de la aplicación de diferentes fuentes de nitrógeno en el crecimiento de colonias de Fusarium Oxysporum en condiciones de laboratorio. Evaluar el efecto in vitro de las dosis empleadas para cada fuente en el crecimiento de colonias de Fusarium Oxysporum en condiciones de laboratorio.
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Dinámica e importancia del nitrógeno en las plantas
El nitrógeno es un elemento cuya disponibilidad es limitada y su funcionalidad radica no solo en la nutrición de cultivos en general, sino también como constituyente esencial en compuestos vitales como aminoácidos, proteínas, enzimas, nucleoproteínas, ácidos nucleicos, también hace parte fundamental de las paredes celulares y de la clorofila. Por ello la dinámica de los ecosistemas y la productividad están altamente influenciadas por los contenidos disponibles de este macro elemento en la rizosfera, que entra en actividad con los microorganismos presentes en el suelo (Vega, 2015).
La importancia fisiológica del nitrógeno en las plantas está notoriamente enmarcada por su efecto en el proceso de crecimiento y desarrollo vegetal, debido a que el estado nutricional de la planta define la resistencia o susceptibilidad de diversos cultivos a ciertos patógenos, las plantas toman el nitrógeno en forma de nitrato para el desarrollo en el periodo juvenil y
amonio para el desarrollo en el periodo de alta producción y senescencia (Rodriguez, 1998), por ello las condiciones de excesiva fertilización estimulan la producción de gran cantidad de exudados radiculares permitiendo el debilitamiento de las paredes celulares lo que describe una mayor facilidad para que la las esporas del patógeno germinen, las hifas se adhieran a la raíz y penetren en ella, convirtiéndose en un exitoso mecanismo de infección (Segorbe, 2014).
3.2. Influencia de la nutrición mineral en las plantas y su efecto en el desarrollo de
enfermedades Debe haber un balance nutricional equilibrado combinando condiciones edafoclimáticas y prácticas culturales adecuadas para que el cultivo alcance el máximo potencial de crecimiento y desarrollo (Palti, 1981). Un factor determinante para que la planta sea susceptible, resistente o tolerante es la nutrición, ya que las diferencias en la estructura química y en su metabolismo, están directamente relacionadas con su comportamiento hacia los patógenos (Boning, 1976). Sin embargo Jarvis y Thorpe (1980) indican un marcado aumento sobre la severidad de las enfermedades en las plantas a causa de los fertilizantes. A través de los cambios introducidos en la fisiología de la planta hospedante se considera que las condiciones del suelo y la nutrición mineral tienen efecto en las enfermedades vasculares debido a que estos patógenos habitan en el suelo y el proceso infectivo inicia a través de las raíces (Garret, 1977).
Los requerimientos nutricionales del patógeno, están suplidos por los nutrientes disponibles en el suelo que afectan la supervivencia y virulencia de dicho patógeno; también influyen en el vigor y la resistencia de las plantas, es decir, estimulando los mecanismos de control biológico (Huber, 1981). Dentro del manejo de diversas
enfermedades en plantas, se hace uso de estrategias como la aplicación de fertilizantes, mediante la modificación del suelo. Aunque sólo muy pocas enfermedades pueden ser controladas totalmente por un régimen de fertilización, la severidad de muchas de ellas puede reducirse de una manera importante por la nutrición y con el uso integrado de otras medidas de control genético, biológico, químico y cultural (Huber, 1989). Las enfermedades vasculares causadas por el hongo Fusarium oxysporum han aumentado en gran número ya que se ha observado que los niveles altos de nitrógeno tienen un efecto positivo en su crecimiento; pero a la vez, vigorizan las plantas, incrementando la producción y estimulando la microflora del suelo (Enhelhard, 1989). Con altos niveles de nitrógeno en el suelo (150-200 mglg de suelo) Gasiorkiewicz, (1960) observó un aumento en la severidad de la enfermedad ocasionada por F. oxysporum. Enhelhard (1979) observó que las enfermedades ocasionadas por F. oxysporum en diversos tipos de plantas se redujo al aplicar el nitrógeno en forma de nitratos, pero aumentó al aplicar nitrógeno amoniacal. El uso de urea como fuente de nitrógeno reporto una alta incidencia de síntomas relacionados a enfermedades causadas por Fusarium según Ebben, (1977) mientras que Corden y Edgington (1960) observaron que al fertilizar suelos de pH alto con Ca(NO3)2, baja la incidencia de la enfermedad. Estudios posteriores revelaron que la resistencia de las paredes celulares se ve afectada por el nitrógeno, ya que varía el contenido de celulosa haciendo que la planta sea más susceptible a la enfermedad (Boning, 1976). Otra respuesta que presenta el Fusarium ante la aplicación de nitrógeno es el efecto de la fuente o forma utilizada sobre el pH del suelo ya que, debido a competencia por micronutrientes, altos valores de pH benefician el crecimiento de poblaciones bacterianas y
actinomicetos, inhibiendo la germinación de esporas y el desarrollo del hongo (Woltz y Jones, 1973).
3.3. Generalidades de los marchitamientos vasculares
El marchitamiento vascular es una enfermedad que se encuentra en todas las etapas de desarrollo de numerosas especies agrícolas de importancia económica, siendo altamente destructivas y manifestando similar sintomatología en todos sus huéspedes, van desde pérdida de la turgencia, debilitamiento de la planta, clorosis y finalmente la necrosis del tejido vegetal. Esta enfermedad es causada por diferentes tipos de patógenos, a pesar de que presentan similitudes en su sintomatología, proceso infectivo y hábitats estos atacan diferentes especies. Existen tres géneros de hongos que la producen: Ceratocystis, Fusarium y Verticillium (Agrios, 2005) .
Para identificar y comprobar que tipo organismo ocasionaba la marchitez en flores se realizaron continuos aislamientos de distintas partes de la planta generando los primeros
reportes de Fusarium oxysporum, confirmando su alta patogenicidad (Swart et al., 2001).
3.4. Generalidades del genero Fusarium
Fusarium es un patógeno necrotrófico que habita en el suelo e infecta a las plantas a través de las raíces, es muy efectivo y altamente invasivo haciendo que su control sea muy complicado y excesivamente costoso, estudios realizados muestran que Fusarium oxysporum es el principal causante de marchitez en varios cultivos, mientras que la pudrición en tallos y raíces es ocasionada por Fusarium solani, las condiciones ambientales
en climas cálidos y los suelos cálidos de los invernaderos son predilectos para la
proliferación de este patógeno, de acuerdo con los hospederos que infecta Fusarium
oxysporum presenta más de 120 formas especiales, se subdivide en razas fisiológicas mostrando sintomatología característica de patogenicidad en diferentes variedades de su huésped (Agrios, 2005).
A continuación se presenta la clasificación taxonómica de Fusarium oxysporum Reino: Fungi Phylum: Ascomycota Clase: Deuteromycete Orden: Hypocreales Familia: Hypocrea ceae Género: Fusarium Especies: oxysporum Fuente: (Valencia, 2009) De acuerdo con Carrillo (2003), la forma y tamaño de las esporas es la característica principal para el reconocimiento de Fusarium, dichas esporas están dispersas en el micelio aéreo. Los macroconidios son curvados, pluriseptados, con una célula apical más o menos puntiaguda y en muchas especies con una célula basal en forma de pie. Los microconidios son comúnmente unicelulares y elipsoidales, similares en ancho a los macroconidios, con una base redondeada y no siempre son producidos ambos tipos de esporas. Algunas especies presentan clamidosporas terminales, laterales o intercalares, a veces formando cadenas. Las células conidiales ocasionalmente se transforman en clamidosporas, dichas estructuras le permiten sobrevivir al patógeno en ambientes desfavorables, convirtiéndolo en un saprofito de vida libre en el suelo en ausencia de planta hospedante (Garcés et al, 2001). Algunas especies forman esclerocios irregulares, de color beige, ocre, pardo o gris oscuro. (Carrillo 2003).
Las diferentes colonias de Fusarium crecen moderada a profusamente. Tienen diversos
colores: Blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, púrpura, celeste, verde aceituna o pardo).
También hay Fusarium de color anaranjado. Los pigmentos que difunden en el agar suelen variar de color o tono con el pH. Algunas especies presentan zonas concéntricas de distinta morfología macroscópica debido a la secuencia luz - oscuridad (Carrillo, 2003). Una sola espora del hongo es suficiente para causar daño en una planta, posteriormente la planta infectada será capaz de dispersar y propagar la enfermedad en el ambiente (Agrios, 2005) ya que el patógeno entra en la región apical de la raíz donde la endodermis no está completamente diferenciada porque el hongo puede crecer a través protoxilema, de acuerdo a su hospedero este puede hallarse penetrando el ápice o la zona de elongación radicular. La colonización del sistema vascular es rápida además es facilitada por la formación de microconidias que son transportadas por el flujo de la savia vía xilema, donde tubos germinativos penetran, formando hifas, conidióforos y conidias. Finalmente el desarrollo de la enfermedad es causado por una combinación de acciones del patógeno que incluyen la acumulación de masa micelial en el xilema, la producción de toxinas, respuestas de defensa del hospedero, incluyendo la producción de gomas o resinas, la destrucción de vasos por la proliferación de células de parénquima adyacentes y síntomas de marchitamiento que parecen ser el resultado de estrés severo por déficit de agua, principalmente debido a la oclusión de vasos del xilema, siendo la necrosis vascular el síntoma principal (Martínez et al., 2014).
4. MATERIALES Y METODOS
4.1. Ubicación del ensayo
El montaje de esta investigación se realizó en las instalaciones del campus sur en el laboratorio de sanidad vegetal, ubicado en la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (U.D.C.A) Calle 222 No. 55-37, Bogotá, Cundinamarca, Colombia localizada
a 4° 47’ 57” Norte y 74°02’40” Oeste, a 2.560 msnm, temperatura media 14,5°C, con una precipitación media anual en régimen bimodal de 860 mm.
En el ejercicio de esta investigación se consideraron nueve tratamientos con tres fuentes diferentes de nitrógeno como se observa en la tabla 1. Donde se evaluó la actividad del nitrógeno en el crecimiento de las colonias de Fusarium oxysporum. A continuación se describe de manera detallada la metodología del presente ensayo.
4.2. Aislamiento de Fusarium oxysporum
Para el aislamiento de F. oxysporum se recolectó material vegetal de proteas del genero Leucadendron sp. de un ensayo previamente establecido en la sede experimental el remanso. A partir de tallos de protea del género Leucadendron sp. que presentaron lesiones características de MARCHITEZ, se tomaron fragmentos de tejido enfermo, de aproximadamente 5 x 5 mm, tratando de involucrar tejido infectado y sano, con la ayuda de un bisturí estéril. Dichos fragmentos pasaron en inmersión por agua destilada estéril durante 30 segundos, un minuto en alcohol etílico al 70%, dos minutos en hipoclorito de sodio al 1% y se lavaron en agua destilada estéril por 30 segundos. Posteriormente en la cámara de flujo laminar, se prepararon cinco medios de cultivo en cajas de petri con PDA marca Merck, con el fin de purificar y multiplicar el patógeno. Finalmente con ayuda de un asa esterilizada se tomaron cinco fragmentos del micelio del hongo y se multiplicaron para cada una de las cinco cajas, dichos medios inoculados se incubaron, durante 8 días a una temperatura constante de 25 °C.
4.3. Verificación microscópica de Fusarium Oxysporum
Para la verificación de las características del fitopatógeno, se realizaron observaciones microscópicas al finalizar ese tiempo, donde se efectuaron montajes en porta objetos, con tinción de lactofenol, al microscopio óptico de luz (NIKON ECLIPSE E 100) en 40X y 100X.
4.4. Multiplicación de Fusarium Oxysporum
Luego de confirmar que los aislamientos obtenidos, corresponden a F. oxysporum, por medio de observaciones microscópicas, se realizaron cultivos puros para cada uno de los Ilustración 1.Aislamiento de Fusarium Oxysporum proveniente de proteas Fuente: Autores Ilustración 2. Montaje de Fusarium Oxysporum para observación en microscopio Fuente: Autores
tratamientos del presente ensayo. Con un sacabocados de 5 mm de diámetro se cortaron discos de medio de cultivo que contiene micelio de F. oxysporum y con un asa estéril se tomó un disco de cada uno de los aislamientos, se sembraron en las cajas petri con PDA enriquecido con UREA, Nitrato de amonio y Sulfato de amonio, se incubaron a una temperatura constante de 25°C para la obtención de datos.
La preparación de los tratamientos se realizó ocho días después de que el micelio del hongo completara el área de la caja de petri, para su multiplicación y posterior inoculación a los medios de cultivo del ensayo.
Tabla 1 Tratamientos aplicados en el ensayo uno Tratamiento Dosis Fuente
TTO 1
1g
UREA
TTO 2
2g
UREA
TTO 3
3g
UREA
TTO 4
1 g
2SO4 (NH4)
TTO 5
2 g
2SO4 (NH4)
TTO 6
3 g
2SO4 (NH4)
TTO 7
1 mL
NO3 (NH4)
TTO 8
2 mL
NO3 (NH4)
TTO 9
3 mL
NO3 (NH4)
4.5. Variables evaluadas
Para la obtención de datos a partir del primer día después de la siembra y durante tres días a un intervalo de día de por medio se midió el área de la colonia del hongo para cada uno de los tratamientos, la lectura se realizó hasta el momento en que todo el medio de cultivo fue cubierto por el micelio del hongo. Para la obtención de los datos del área micelial, se utilizó el programa Image J con el cual se determinó el área de las colonias de Fusarium oxysporum, a partir de imágenes tomadas para la documentación del ensayo durante su ejecución. A partir del programa se obtuvo el área de crecimiento en cm2, se debe precisar el uso de los datos a escala real para este fin.
4.6. Diseño experimental
Para el presente ensayo se usó un diseño completamente aleatorizado con 5 repeticiones y estructura de tratamientos factorial 3 x 3 (ecuación 1), con los factores correspondientes a Fuente de Nitrógeno y Dosis (Tabla 1).
Ecuación 1 Con i=1,2,3 ; j=1,2,3 y k=1,2,3,4,5 Dónde:
es la respuesta del i-ésimo nivel de dosis, en el j-ésimo nivel de la fuente, en la k-ésima repetición es el promedio de la respuesta es el efecto de la i-ésima dosis es el efecto de la j-ésima fuente es el efecto de la interacción de la iésima dosis en la j-esima fuente es el error experimental En este caso se realizó un análisis descriptivo de los datos y la verificación del cumplimiento de supuestos para análisis paramétricos, particularmente evaluando
normalidad de los errores y homocedasticidad para los niveles del factor considerado (ver anexos).Para este fin se eliminaron algunos datos considerados atípicos y que afectaban el cumplimiento de supuestos. Posteriormente se efectuó análisis de varianza de acuerdo a los modelos de los diseños propuestos, en donde se halló evidencia de diferencias significativas se realizó la prueba de comparación múltiple de Tukey HSD. Los análisis, así como los gráficos, se realizaron usando el lenguaje de programación R en su versión 3.4.2.
5. Análisis de resultados y discusión
Tal como se comentó en el aparte anterior los resultados obtenidos en la presente investigación fueron sometidos a análisis de varianza y prueba de medias de Tukey. A continuación se presentan los resultados obtenidos para cada variable evaluada, las salidas para cada análisis pueden ser verificadas en los anexos.
5.1. Descripción del ensayo
La grafica muestra la interacción dosis por fuente expresada en el crecimiento del hongo Fusarium oxysporum a través del tiempo evidenciando un marcado crecimiento en la colonias enriquecidas con fertilizantes agrícolas comerciales como la urea y el nitrato de amonio obteniendo como mejor respuesta para retrasar el crecimiento fue el sulfato de amonio (Gráfico 1).
Grafica 1. Crecimiento de Fusarium Oxysporum enriquecido con diferentes fuentes de nitrógeno cada una de estas a tres dosis diferentes.
5.2. Efecto de la fuente para la fecha uno
Para el análisis estadístico de la variable fuente se tuvieron en cuenta 42 mediciones realizadas durante el ensayo. El análisis de varianza para la variable de crecimiento de colonias del hongo F. Oxysporum muestra diferencias altamente significativas (P≤0,001) entre los tratamientos de nitrato de amonio, urea con respecto al que contenía sulfato de amonio. El agrupamiento de medias de Tukey muestra comportamientos similares en el crecimiento del hongo que fue tratado con urea y nitrato de amonio, agrupándolos con una misma letra (grafica 2). Estos dos tratamientos obtuvieron los mayores promedios de crecimiento durante todo el ensayo, lo que sugiere un efecto marcado sobre el crecimiento de F. oxysporum en estos debido a que el contenido de nitrógeno total de ambos compuestos es igual. Con un promedio menor, lo sigue de cerca el tratamiento con sulfato de amonio, lo que sugiere un marcado retraso en el crecimiento del hongo con respecto a los otros tratamientos.
Grafica 2. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes dosis en condiciones de laboratorio en la fecha 1 *Promedios seguidos de la misma letra no presentan evidencia de diferencias estadísticamente significativas por la prueba de Tukey HSD con una confianza del 95%.
5.3. Efecto de la fuente para la fecha dos
Para el análisis estadístico de la variable fuente se tuvieron en cuenta 42 mediciones realizadas durante el ensayo. El análisis de varianza para la variable de crecimiento de
colonias del hongo F. Oxysporum muestra diferencias altamente significativas (P≤0,001)
entre los tratamientos de nitrato de amonio, urea con respecto al que contenía sulfato de amonio. El agrupamiento de medias de Tukey muestra comportamientos similares en el crecimiento del hongo que fue tratado con urea y nitrato de amonio, agrupándolos con una misma letra (gráfica 2). Estos dos tratamientos obtuvieron los mayores promedios de crecimiento durante todo el ensayo, lo que sugiere un efecto marcado sobre el crecimiento de F. oxysporum en estos debido a que el contenido de nitrógeno total de ambos compuestos es igual. Con un promedio menor, lo sigue de cerca el tratamiento con sulfato de amonio, lo que sugiere un marcado retraso en el crecimiento del hongo con respecto a los demás tratamientos.
Grafica 3. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes dosis en condiciones de laboratorio en la fecha 2. *Promedios seguidos de la misma letra no presentan evidencia de diferencias estadísticamente significativas por la prueba de Tukey HSD con una confianza del 95%.
5.4. Efecto de la dosis para la fecha dos
El análisis estadístico para la variable de dosis se realizó teniendo en cuenta las 42 mediciones realizadas durante el ensayo. El análisis de varianza para la variable transformada arrojó diferencias altamente significativas (P≤0.05) para los tratamientos. Posteriormente se identificaron mínimas diferencias entre las dosis de aplicación, siendo la dosis tres la de mejor respuesta.
Grafica 4. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes dosis de nitrógeno en condiciones de laboratorio en la fecha 2 *Promedios seguidos de la misma letra no presentan evidencia de diferencias estadísticamente significativas por la prueba de Tukey HSD con una confianza del 95%.
5.5. Efecto de la fuente para la fecha tres
Para el análisis estadístico de la variable fuente se tuvieron en cuenta 42 mediciones realizadas durante el ensayo. El análisis de varianza para la variable de crecimiento de
colonias del hongo F. Oxysporum muestra diferencias altamente significativas (P≤0,001)
entre los tratamientos de nitrato de amonio, urea con respecto al que contenía sulfato de amonio. El agrupamiento de medias de Tukey muestra comportamientos similares en el crecimiento del hongo que fue tratado con urea y nitrato de amonio, agrupándolos con una misma letra (grafica 4). Estos dos tratamientos obtuvieron los mayores promedios de crecimiento durante todo el ensayo, lo que sugiere un efecto marcado sobre el crecimiento de F. oxysporum en estos, debido a que el contenido de nitrógeno total de ambos compuestos es igual. Con un promedio menor, lo sigue de cerca el tratamiento con sulfato
de amonio, lo que sugiere un marcado retraso en el crecimiento del hongo con respecto a los otros tratamientos.
Grafica 5. Promedio de crecimiento de colonias de fusarium oxysporum sometidas a diferentes fuentes de nitrógeno a diferentes dosis en condiciones de laboratorio en la fecha 3. *Promedios seguidos de la misma letra no presentan evidencia de diferencias estadísticamente significativas por la prueba de Tukey HSD con una confianza del 95%.
6. CONCLUSIONES
Se evidencio que fuentes nitrogenadas como urea y nitrato de amonio comparten la misma cantidad de nitrógeno total lo que explica el comportamiento similar del crecimiento del hongo en los dos tratamientos.
En la presente investigación se evidencio que el uso de sulfato de amonio obtuvo mejor respuesta en cuanto inhibir el crecimiento de F. oxysporum.
Está establecido que altos niveles de suministro de nitrógeno aumentan la severidad de las enfermedades causadas por hongos que actúan como parásitos obligados, por lo tanto la concentración de aminoácidos es también alta cuando hay excesos de nitrógeno, limitando la síntesis de polímeros favoreciendo la penetración y el desarrollo de las enfermedades causadas por hongo, lo que se evidencio en los tratamientos con mayor desarrollo micelial.
7. RECOMENDACIONES
Realizar evaluaciones con otros tipos de fertilizantes y verificar si efectúan control sobre el crecimiento de Fusarium oxysporum.
Realizar la evaluación del efecto de nitrógeno sobre el crecimiento de Fusarium oxysporum en condiciones de campo.
BIBLIOGRAFÍA
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1. Anexos
1.1. Análisis descriptivo para crecimiento de Fusarium Oxysporum a diferentes
fuentes de nitrógeno en la fecha 1
N Mínimo Q1 Mediana Promedio Q2 Q3 Máximo DE EE CV
N. Amonio 15 7.37 8.70 9.90 10.33 9.90 11.46 14.17 2.24 0.58 21.70
S. Amonio 15 4.01 5.34 6.44 6.75 6.44 7.72 10.41 1.91 0.49 28.28
Urea 15 6.71 8.42 9.66 9.51 9.66 10.95 12.15 1.70 0.44 17.89
1.2. Prueba de normalidad para la fecha 1
data: anava1$residuals W = 0.97354, p-value = 0.4008
1.3. Prueba de homocedasticidad para la fecha 1
data: fecha1$Crecimiento by fecha1$TTO Bartlett's K-squared = 10.617, df = 8, p-value = 0.2244
1.4. ANAVA para crecimiento de Fusarium Oxysporum para la fecha 1
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
fecha1$Fuente 2 105.55 52.77 16.208 1.04e-05 ***
fecha1$Dosis 2 13.39 6.70 2.056 0.1431
fecha1$Fuente:fecha1$Dosis 4 31.62 7.90 2.428 0.0661 .
Residuals 35 113.96 3.26
---
Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
1 observation deleted due to missingness
1.5. Prueba de comparación múltiple para la fecha 1
fecha1.Crecimiento std r Min Max
N. Amonio 10.33373 2.242782 15 7.365 14.168
S. Amonio 6.74520 1.907240 15 4.006 10.409
Urea 9.50850 1.701115 14 6.712 12.149
fecha1$Crecimiento groups
N. Amonio 10.33373 a
Urea 9.50850 a
S. Amonio 6.74520 b
1.6. Análisis descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes
dosis de nitrógeno para la fecha 1
n Minimo Q1 Mediana Promedio Q2 Q3 Maximo DE EE CV
N. Amonio 15 5.64 7.30 9.71 9.35 9.71 11.05 14.17 2.43 0.63 26.00
S. Amonio 15 5.48 7.43 8.47 9.12 8.47 10.02 13.89 2.54 0.66 27.90
Urea 15 4.01 5.75 8.70 8.02 8.70 9.85 11.25 2.43 0.63 30.29
1.7. Prueba de comparación múltiple para fecha 1
fecha1.Crecimiento std r Min Max
1 9.350000 2.431439 15 5.638 14.168
2 9.116200 2.543847 15 5.477 13.891
3 8.022143 2.429642 14 4.006 11.249
fecha1$Crecimiento groups
1 9.350000 a
2 9.116200 a
3 8.022143 a
1.8. Análisis descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes
fuentes de nitrógeno en la fecha 2
n Mínimo Q1 Mediana Promedio Q2 Q3 Máximo DE EE CV
N. Amonio 15 17.71 20.73 21.95 23.44 21.95 25.83 30.64 4.11 1.06 17.55
S. Amonio 15 10.18 11.58 13.85 14.08 13.85 14.55 23.86 3.80 0.98 26.98
Urea 15 17.61 21.46 26.09 26.55 26.09 32.32 34.55 5.91 1.53 22.25
1.9. Prueba de Normalidad para la fecha 2
data: anava2$residuals W = 0.98227, p-value = 0.7245
1.10.
Prueba de Homocedasticidad para la fecha 2
data: fecha2$Crecimiento by fecha2$TTO Bartlett's K-squared = 7.8462, df = 8, p-value = 0.4486
1.11.
ANAVA para la fecha 2
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
fecha2$Fuente 2 1236.2 618.1 41.232 6.28e-10 ***
fecha2$Dosis 2 89.1 44.6 2.972 0.06424 .
fecha2$Fuente:fecha2$Dosis 4 278.8 69.7 4.650 0.00408 **
Residuals 35 524.7 15.0
---
Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
1 observation deleted due to missingness
1.12.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 2
fecha2.Crecimiento std r Min Max
N. Amonio 23.44233 4.113917 15 17.709 30.639
S. Amonio 14.07907 3.798256 15 10.176 23.857
Urea 26.54686 5.907760 14 17.614 34.549
fecha2$Crecimiento groups
Ure a 26.54686 a
N. Amonio 23.44233 a
S. Amonio 14.07907 b
1.13.
Análisis Descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes dosis de nitrógeno en la fecha 2
n Minimo Q1 Mediana Promedio Q2 Q3 Maximo DE EE CV
N. Amonio 15 10.29 14.67 24.46 23.11 24.46 30.04 34.55 8.44 2.18 36.52
S. Amonio 15 10.18 15.33 20.97 21.24 20.97 27.62 31.32 7.43 1.92 34.96
Urea 15 11.57 15.70 19.99 19.24 19.99 21.87 26.16 4.40 1.14 22.88
1.14.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 2
fecha2.Crecimiento Std r Min Max
1 23.10607 8.438073 15 10.287 34.549
2 21.23853 7.425241 15 10.176 31.323
3 19.23629 4.400330 14 11.571 26.156
fecha2$Crecimiento groups
1 23.10607 a
2 21.23853 ab
3 19.23629 b
1.15.
Análisis descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes fuentes de nitrógeno en la fecha 3
n Minimo Q1 Mediana Promedio Q2 Q3 Maximo DE EE CV
N. Amonio 15 28.36 31.77 35.15 35.35 35.15 38.95 43.23 4.93 1.27 13.94
S. Amonio 15 13.40 17.24 21.23 21.05 21.23 23.81 31.20 5.36 1.38 25.44
Urea 15 24.84 28.54 33.31 32.28 33.31 34.53 40.50 4.23 1.09 13.09
1.16.
Prueba de Normalidad para la fecha 3
data: anava3$residuals W = 0.97889, p-value = 0.5897
1.17.
Homocedasticidad para la fecha 3
data: fecha3$Crecimiento by fecha3$TTO Bartlett's K-squared = 7.8131, df = 8, p-value = 0.4519
1.18.
ANAVA para la fecha 3
Df sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
fecha3$Fuente 2 1692.4 846.2 40.011 9.07e-10 ***
fecha3$Dosis 2 99.3 49.6 2.347 0.111
fecha3$Fuente:fecha3$Dosis 4 134.2 33.6 1.586 0.200
Residuals 35 740.2 21.1
---
Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
1 observation deleted due to missingness
1.19.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 3
fecha3.Crecimiento std r Min Max
N. Amonio 35.35413 4.927188 15 28.361 43.229
S. Amonio 21.05440 5.356713 15 13.396 31.201
Urea 32.28286 4.225203 14 24.840 40.502
fecha3$Crecimiento groups
N. Amonio 35.35413 a
Urea 32.28286 a
S. Amonio 21.05440 b
1.20.
Análisis Descriptivo para crecimiento de fusarium oxysporum a diferentes dosis de nitrógeno en la fecha 3
n Minimo Q1 Mediana Promedio Q2 Q3 Maximo DE EE CV
N. Amonio 15 13.4 23.66 30.84 29.06 30.84 34.42 40.50 7.49 1.93 25.76
S. Amonio 15 14.1 22.15 28.36 28.09 28.36 34.74 43.23 9.24 2.39 32.90
Urea 15 20.4 25.91 32.90 31.49 32.90 35.77 41.48 6.78 1.75 21.54
1.21.
Prueba de comparación múltiple para la fecha 3
fecha3.Crecimiento std r Min Max
1 29.06027 7.485578 15 13.396 40.502
2 28.09153 9.242221 15 14.102 43.229
3 31.48650 6.781472 14 20.399 41.477
fecha3$Crecimiento groups
3 31.48650 a
1 29.06027 a
2 28.09153 a
Cita: Gamboa Beltrán, Carlos Andrés, Jiménez Torres, Zulma Rocío (2017), Evaluación del efecto de diferentes fuentes de nitrógeno sobre el desarrollo de Fusarium oxysporum en condiciones de laboratorio, Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, p. N. https://repository.udca.edu.co/handle/11158/938