Bogotá - Ciencias - Doctorado en Biotecnología · 2026
Caracterización molecular y funcional del gen codificante para la dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides IBUN 91.2.98
Los dextranos son exopolisacáridos (EPS) de alto peso molecular con diversas aplicaciones en sectores como el farmacéutico, alimentos, ambiental, agrícola e industrial; rango de aplicaciones que ha aumentado con los años, especialmente para los dextranos de bajo peso molecular. Esta investigación se centró en caracterizar el gen dsr_IBUN de Leuconostoc mesenteroides IBUN 91.2.98 para posteriormente obtener variantes de la enzima dextransacarasa (DSR_IBUN) para la que este gen codifica. El gen completo (4584 pb) codifica una proteína de 1527 aminoácidos y a partir de él, se obtuvieron dos variantes más cortas de esta enzima. La variante DSR_IBUN_Var1 mostró actividad enzimática, aunque reducida un 19,2% respecto a la enzima nativa. La deleción en el C-terminal de bolsillos de unión a glucano de la enzima, mostró un efecto directo en la distribución de tamaños del polímero generado, produciendo un dextrano con mayor polidispersión y menor viscosidad, aunque sin cambios en los enlaces glicosídicos. El polímero obtenido con la variante más corta presentó un 74,48% de fracciones >2000 KDa, acompañado de proporciones menores en rangos de 800 KDa, 400 KDa y 15 KDa, en comparación al polímero sintetizado por la enzima nativa que presenta un 100% de dextranos de fracción >2000 KDa. Estos hallazgos sugieren que los bolsillos activos del C-terminal son determinantes para dar estabilidad al polímero durante su formación, especialmente en la actividad de transferencia de glucosa, la cual disminuyó de 0,48 ± 0.02 U/mg a 0,28 ± 0.03 U/mg, respecto a la enzima nativa, siendo más afectada que la actividad hidrolítica que presentó una variación de 0,54± 0.03 U/mg a 0,42 ± 0.02 U/mg, lo que resalta la importancia de dichos bolsillos en la procesividad de la DSR_IBUN, abriendo la posibilidad de diseñar dextranos con propiedades fisicoquímicas ajustadas a necesidades específicas de la industria, ampliando su potencial de aplicación, así como el uso de residuos agroindustriales con alto contenido de sacarosa como sustratos de bajo costo para su obtención. (Texto tomado de la fuente)
Texto completo 166 páginas con texto de 173
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Contenido
- Lista de tablasp. 21
- Introducciónp. 22
- Marco teóricop. 25
- Género Leuconostocp. 25
- Leuconostoc mesenteroidesp. 26
- Enzimas activas sobre carbohidratosp. 30
- 1.3.1 Glicosilhidrolasas (GH) (E.C. 3.2.1.-)p. 31
- 1.3.1.1 Glucosiltransferasas (GTS) (E.C. 2.4.1.-)p. 33
- 1.3.1.1.1 Dextransacarasas (DSR) (E.C. 2.4.1.5)p. 37
- Dextranosp. 44
- 1.4.1 Aplicaciones de los dextranosp. 49
- Hipótesisp. 61
- Objetivosp. 63
- Objetivo generalp. 63
- Objetivos específicosp. 63
- Metodologíap. 65
- IBUN 91.2.98p. 68
- 4.1.1 Cultivo de L. mesenteroides IBUN 91.2.98 y purificación de DNA totalp. 65
- filogenia de la cepap. 66
- dextransacarasa de L. mesenteroides IBUN 91.2.98p. 65
- dextransacarasap. 57
- DSR_IBUNp. 69
- 4.2.2 Modelado de la estructura 3D de la dextransacarasa DSR_IBUNp. 73
- 4.2.3 Diseño de variantes del gen dsr_IBUNp. 75
- en el plásmido PGEXp. 79
- y sus variantes empleando el plásmido ChampionTM pET151 Directional TOPOp. 84
- más cortas y su respectiva producción de polímerosp. 91
- más cortas expresadas de manera heterólogap. 91
- variantes más cortas expresadas de manera heterólogap. 94
- con las propiedades fisicoquímicas de los dextranos producidosp. 95
- 4.4.1 Determinación del peso molecular de los dextranos producidosp. 95
- 4.4.2 Determinación de pH, viscosidad y densidad de los dextranos producidosp. 95
- resonancia magnética nuclear (RMN)p. 96
- Resultados y Discusiónp. 97
- IBUN 91.2.98p. 68
- 5.1.1 Cultivo de L. mesenteroides IBUN 91.2.98 y purificación de DNA totalp. 97
- filogenia de la cepap. 99
- dextransacarasa de L. mesenteroides IBUN 91.2.98p. 65
- DSR_IBUNp. 69
- 5.2.2 Modelado de la estructura 3D de la dextransacarasa DSR_IBUNp. 113
- 5.2.3 Diseño de variantes del gen dsr_IBUNp. 75
- mesenteroides IBUN 91.2.98 y las variantes propuestasp. 126
- en el plásmido PGEXp. 126
- y sus variantes empleando el plásmido ChampionTM pET151 Directional TOPOp. 130
- más cortas y su respectiva producción de polímerosp. 137
- más cortas expresadas de manera heterólogap. 137
- variantes más cortas expresadas de manera heterólogap. 140
- con las propiedades fisicoquímicas de los dextranos producidosp. 141
- 5.5.1 Determinación del peso molecular de los dextranos obtenidosp. 141
- 5.5.2 Determinación de viscosidad y densidad de los dextranos producidosp. 143
- resonancia magnética nuclear (RMN)p. 147
- Conclusionesp. 152
- Bibliografíap. 99
- medio suplementado con sacarosa al 6%p. 27
- alterando la configuración anomérica de los residuos del polisacáridop. 32
- Figura 3. Esquema de la organización de los dominios de las enzimas GH13 y GH70p. 34
- biopolímero dextranop. 38
- los cinco dominios identificados en las dextransacarasasp. 39
- GH70, en la que se muestran los dominios A, B, C, IV y Vp. 40
- polisacáridos y oligosacáridos catalizada por la dextransacarasa a partir de sacarosap. 44
- embargo, puede contener también ramificaciones de tipo α-(1-2) y α-(1-4)p. 45
- molecular y a su concentración a 25°Cp. 47
- las variantes de la enzima dextransacarasa DSR_IBUNp. 76
- DSR_IBUNp. 69
- vectorp. 80
- variantes 1 y 2p. 89
- 91.2.98p. 98
- cepas de interésp. 102
- observan las CDS mayores a 1500 pbp. 103
- de L. mesenteroides IBUN 91.2.98p. 104
- (metabolismo de los carbohidratos) en L. mesenteroides IBUN 91.2.98p. 105
- para la cepa de estudio y las cepas relacionadas en el análisisp. 106
- purificaciónp. 107
- dsr_IBUN clonado en el vector pTOP TA V2 de Takarap. 108
- Figura 22. Resultados de la transformación de cepas de E. coli con pTOP TA_dsrp. 109
- Figura 23. Motivos estructurales conservados en DSR-IBUNp. 113
- dextransacarasa DSR-M de L. citreum NRRL B-1299p. 114
- TASSER (D)p. 116
- organización de los dominios predicha para DSR-IBUNp. 118
- catalítico Asp509, Glu547 y Asp620 de la dextransacarasa DSR_IBUN (lavanda)p. 121
- 469, Asn 513, Asp 986 de la DSR (lavanda)p. 122
- en la enzima dextransacarasa DSR_IBUNp. 124
- DSR_IBUN con glucosap. 125
- DSR-IBUN alineada con la variante 1. B. DSR-IBUN alineada con la variante 1p. 126
- tras ensayo de restricción con la enzima NotIp. 127
- restricción del constructo pGEX_dsrIBUN con la enzima NotIp. 128
- de la proteína DSR_IBUN empleando el plásmido PGEXp. 129
- del cultivo de E. coli BL21 (A y D) y L. mesenteroides (B y C)p. 130
- gen dsr_IBUN y sus variantes más cortasp. 131