DETECCIÓN MOLECULAR DE Rickettsia spp. Y Ehrlichia canis EN CANINOS DE

IBAGUÉ, TOLIMA

JULIETH MICHEL PETANO DUQUE

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo

Director

IANG SCHRONILTGEN RONDÓN BARRAGÁN

MVZ, MSc, PhD.

Codirector

MARIA PAULA HERRERA SÁNCHEZ

Bióloga, cMSc

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA

IBAGUÉ, TOLIMA

2023

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi familia su apoyo y formación durante todos estos años. Al profesor Iang Rondón por la oportunidad dada de llevar a cabo este proyecto y su continuo acompañamiento a lo largo de todo el proceso, así como su amistad, lo que constituye un valioso aporte a mi formación personal y académica. Además, extiendo mi agradecimiento a los miembros del Laboratorio de Inmunología y Biología Molecular, en especial a María Paula Herrera su acompañamiento y colaboración tanto en el planteamiento como desarrollo del trabajo y cada uno de sus productos.

Adicionalmente, doy gracias a la Clínica veterinaria del Tolima, la Clínica TodoVet y al profesor Roberto Chacón por su colaboración en la toma de las muestras y la información epidemiológica asociada al proyecto.

CONTENIDO

Pág.

RESUMEN……………………………………………………………………………………….9

ABSTRACT…………………………………………………………………………………….10

1.

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………11

2.

OBJETIVOS……………………………………………………………………………13

2.1.

Objetivo general……..……………………………………..………………………….13

2.2.

Objetivos específicos……….…………………………………..……………………..13

3.

MARCO TEORICO…………………………………………………………………….14

3.1.

Rickettsiosis…………………………………………………………..………………..14

3.1.1. Clasificación taxonómica…………………...…………………………………………14

3.1.2. Características fenotípicas……………………………………………………...…….16

3.1.3. Características genómicas………………………………………………………...….17

3.1.4. Patogenia……………………………………………………………………………….17

3.1.5. Diagnóstico…………………………………………………………………………..…20

3.1.6. Epidemiología………………………………..…………………………………………20

3.1.7. Signos clínicos…………………………………………………………………………23

3.2.

Ehrlichia canis…………………………………………………………………..……...24

3.2.1. Clasificación taxonómica……………………………………………………………...25

3.2.2. Características fenotípicas……………………………………………………………25

3.2.3. Características genotípicas…………………………………………………………...26

3.2.4. Patogenia……………………………………………………………………………….27

3.2.5. Ehrlichiosis monocítica canina (EMC)……………………………………………….30

3.2.6. Epidemiología…………………………………………………………………………..30

4.

METODOLOGÍA…………………………………………………………………….…31

4.1.

Muestreo………………………………………………………………………………..31

4.1.1. Área de estudio…………………………………………...……………………………31

4.1.2. Tamaño muestreal……………………………………………………………………..31

4.1.3. Declaración ética………………………………………………………………………31

4.1.4. Toma de muestras……………………………………………………………………..32

4.1.5. Encuesta epidemiológica……………………………………………………………..33

4.2.

Extracción de ADN………………………………………………………………..…...35

4.2.1. Protocolo de extracción de ADN con PCI (25:24:1) ……..………………..………35

4.2.2. Cuantificación y dilución del ADN………………………………………………..…..36

4.2.3. Calidad e integridad del ADN…………………………………………………………36

4.3.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)...…………………………..……….37

4.4.

Electroforesis horizontal………………………………………………..……………..38

4.5.

Análisis estadístico…………………………………………………………………….38

4.5.1. Estimación de la prevalencia……….………………………………………….……..38

4.5.2. Factores de riesgo……………………….…………………………………….………38

4.6.

Análisis bioinformático del gen gp36……….……………………………….……….39

4.6.1. Secuenciamiento………………………………………………………………………39

4.6.2. Análisis filogenético…………………………………….…………………….………..39

4.6.3. Modelamiento de la estructura……………………………….…………….………...39

5. RESULTADOS……………………………………………………………...……………...40

5.1.

Población de estudio…………………………………………………..………………40

5.2.

Concentración y calidad del ADN……………………………………………………43

5.3.

Detección molecular………………………………………………………..………….44

5.4.

Factores de riesgo……………………………………………………………..………45

5.5.

Caracterización molecular……………………………………..……………………..47

6. DISCUSIÓN…………………………………………...…………………………………….49

6.1.

Diagnóstico molecular………………………..……………………………………….50

6.2.

Factores de riesgo……………………………..………………………………………52

6.3.

Características moleculares………………………..…………………………………53

7. CONCLUSIÓN………………………………………………………………………...…....55

REFERENCIAS………………………………………………………………………………..56

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación taxonómica de Rickettsia spp……………………...………………14 Tabla 2. Clasificación taxonómica de Ehrlichia canis……………………………………..24 Tabla 3. Tamaño de los estadios de E. canis………………………………………………25 Tabla 4. Secuencia de los primers usados para la detección de agentes Rickettsiales y el gen ACTB de canino………………………………………………………………………..38 Tabla 5. Características de la población canina y los valores OR……………………….46

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida de Rickettsia spp. del grupo de la fiebre manchada (SFG)…...18 Figura 2. Ciclo de vida de Rickettsia spp. del grupo tifus (TG)…………………………..19 Figura 3. Ciclo de transmisión de R. rickettsii……………………………………………...21 Figura 4. Ciclo de vida de Ehrlichia canis en caninos…………………………………….28 Figura 5. Procedimientos para la toma de muestras……………………………………...32 Figura 6. Extracción de ADN con el método PCI (25:24:1) …………………………...…34 Figura 7. Metodología de verificación de la calidad del ADN extraído………………….36 Figura 8. Cajas de bigotes de la proporción A260/A280 y la proporción A260/A230…42 Figura 9. Integridad del ADNg extraído a partir de sangre completa de caninos……...43 Figura 10. Amplificación del gen ACTB a partir del ADNg extraído de sangre completa de caninos………………………………………………………………………………………43 Figura 11. Amplificación de un fragmento del gen gp36 de Ehrlichia canis a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos……………………………………………44 Figura 12. Amplificación de un fragmento del gen gltA de Rickettsia spp. a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos……………………………………………44 Figura 13. Amplificación de un fragmento del gen ompB de rickettsias patógenas (SFG o TG) a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos……………………….45 Figura 14. Análisis bioinformático de la región de la proteína GP36 de E. canis……...47 Figure 15. Análisis filogenético basado en las secuencias de nucleótidos del gen gp36 de E. canis……………………………………………………………………………………...48

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Consentimiento informado………………………………………………………..84 Anexo 2. Encuesta epidemiológica………………………………………………………….85 Anexo 3. Concentración y calidad del ADNg extraído a partir de muestras de sangre completa de caninos de Ibagué, Tolima…………………………………………………….86 Anexo 4. Integridad del ADNg extraído a partir de sangre completa de canino……….95 Anexo 5. Calidad del ADNg extraído a partir de sangre completa de canino………….96 Anexo 6. Amplificación de un fragmento del gen gp36 de E. canis a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos……………………………………………………97 Anexo 7. Amplificación de un fragmento del gen gltA de Rickettsia spp. a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos……………………………………………98

RESUMEN

La rickettsiosis y la ehrlichiosis monocítica canina son enfermedades transmitidas por garrapatas causadas por alfa proteobacterias del orden Rickettsiales y transmitidas a humanos y animales domésticos. Las manifestaciones clínicas son inespecíficas y el diagnóstico en la práctica clínica sigue siendo un desafío para los trabajadores de la salud y los veterinarios. Este estudio establece la prevalencia de Ehrlichia canis y Rickettsia spp. y detecta los factores de riesgo asociados a la infección en perros de Ibagué-Tolima.

Se realizó un estudio transversal en 337 caninos de zonas urbanas y rurales de Ibagué- Tolima. Los factores epidemiológicos (incluyendo edad, sexo, raza, condición corporal, lesiones dermatológicas, infestación por garrapatas y factores demográficos) se recolectaron a través de una encuesta y los factores asociados se calcularon a través de la prueba de Chi-cuadrado y la razón de probabilidades. Ehrlichia canis y Rickettsia spp. fueron identificados mediante la amplificación del gen de la glicoproteína 36 (gp36) y del gen del citrato sintetasa (gltA) mediante PCR. Además, el gen de la proteína B de la membrana externa (ompB) de los grupos de Rickettsias patogénicas (grupo de la fiebre maculosa y grupo del tifus) se amplificó mediante PCR.

La prevalencia de infección por Ehrlichia canis en perros fue del 69,73% (235/337), Rickettsia spp. 9,49% (32/337), y Rickettsia patógenas 2,96% (10/337). La enfermedad previa se determinó como un factor de riesgo asociado a la presencia de E. canis en perros. Adicionalmente, la raza mestiza, las lesiones hiperqueratósicas y residir cerca de zona boscosa son factores de riesgo asociados a la presencia de Rickettsia spp. en perros de Ibagué. Este es el primer estudio molecular de rickettsiosis y ehrlichiosis monocítica canina en perros de Ibagué, en el que se encontró una alta prevalencia de E. canis y la primera detección de Rickettsia spp. en el departamento del Tolima. Palabras clave: Ehrlichia canis, factores de riesgo, grupo de la fiebre manchada, grupo Tifus PCR, Rickettsia spp.

ABSTRACT

Rickettsiosis and canine monocytic ehrlichiosis are tick-borne diseases caused by alpha proteobacterium of order Rickettsiales and transmitted to humans and domestic animals. Clinical manifestations are nonspecific, and the diagnosis in clinical practice remains challenging for health workers and veterinarians. This study establishes the prevalence of Ehrlichia canis and Rickettsia spp. and detects the risk factors associated with the infection in dogs from Ibagué-Tolima.

A cross-sectional study was conducted in 337 dogs from urban and rural areas of Ibagué-Tolima. Epidemiological factors (including age, gender, breed, body condition, dermatological lesions, tick infestation, and demographic factors) were collected through a survey, and associated factors were calculated through the Chi-square test and odds ratio. E. canis and Rickettsia spp. were identified by amplifying glycoprotein

36 (gp36) gene and citrate synthetase (gltA) gene through PCR. Moreover, outer

membrane protein B (ompB) gene of pathogenic Rickettsia groups (spotted fever group and typhus group) was amplified by PCR.

Prevalence of E. canis infection in dogs was of 69,73% (235/337), Rickettsia spp. 9,49% (32/337), and pathogenic Rickettsia 2,96% (10/337). Previous disease was determined as a risk factor associated with E. canis presence in dogs. Additionally, mixed breed, hyperkeratotic lesions, and residing near wooded area are risk factors associated with Rickettsia spp. presence in dogs from Ibagué. This is the first molecular study of rickettsiosis and canine monocytic ehrlichiosis in dogs from Ibagué, in which a high prevalence of E. canis was found, and the first detection of Rickettsia spp. in the department of Tolima.

Keywords: Ehrlichia canis, PCR, Rickettsia spp., risk factors, Spotted fever group, Typhus group.

1. INTRODUCCIÓN

Los agentes zoonóticos transmitidos por vectores se están convirtiendo en una preocupación importante a nivel mundial debido a su alta morbilidad y el desafío diagnóstico que representan sus manifestaciones clínicas inespecíficas (Oliveira et al., 2018; Chitanga et al., 2021). Los artrópodos hematófagos, como las garrapatas y los piojos, se encuentran entre los principales vectores de los agentes procariotas, cuyo rango de distribución se ha ampliado debido al cambio climático y las actividades antropogénicas que modifican el suelo, produciendo un mayor impacto en la salud pública en las regiones tropicales y subtropicales (Chitanga et al., 2021).

Los microorganismos procariotas del orden Rickettsiales son agentes causales de importantes enfermedades transmitidas por garrapatas, pulgas, piojos y ácaros (Blanton, 2019; Cusicanqui, 2020; Salje et al., 2021). Una de ellas es la bacteria intracelular del género Rickettsia, perteneciente a la familia Rickettsiaceae, que se clasifica en el grupo de la fiebre maculosa (SFG), el grupo del tifus (TG), el grupo Rickettsia belli y el grupo Rickettsia canadensis (Blanda et al., 2017; Blanton, 2019). Los perros infectados con SFG y TG pueden desarrollar rickettsemia transitoria y mostrar signos clínicos como fiebre, dolor abdominal, mialgia, erupción petequial, insuficiencia renal u orgánica y vasculitis sistémica (Pieracci et al., 2017).

Ehrlichia canis es el agente etiológico de la ehrlichiosis monocítica canina (EMC), perteneciente al orden Rickettsiales y a la familia Anaplasmataceae (Malik et al., 2018). Esta bacteria se replica dentro de las células mononucleares del huésped, y los perros pueden desarrollar una fase subclínica o una fase aguda en la que pueden presentarse fiebre, disnea, depresión, anorexia, linfadenopatía y pérdida de peso, y convertirse en una fase crónica con síntomas como trombocitopenia cíclica, sangrado, epistaxis, edema periférico, emaciación y shock hipotenso (Aragón-López et al., 2021; Cusicanqui, 2020; Malik et al., 2018; Shiroma, 2019).

Los perros pueden usarse como centinelas para Rickettsia spp. y distribución de E. canis, ya que los ectoparásitos transmiten estos agentes hemotrópicos mientras se alimentan de sangre, siendo susceptibles de actuar como reservorios de rickettsiosis y EMC (Aragón-López et al., 2021). De acuerdo con esto, el objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia de Rickettsia spp. y E. canis en perros de zonas rurales y urbanas de Ibagué, así como evaluar los factores de riesgo asociados a su presencia.

2. OBJETIVOS

2.1.

Objetivo general

Determinar la prevalencia y los factores de riesgo asociados a la presencia de los hemoparásitos Rickettsia spp. y Ehrlichia canis en caninos de Ibagué, Tolima.

2.2.

Objetivos específicos

2.2.1. Identificar molecularmente la presencia de Rickettsia spp. y E. canis en muestras

de sangre provenientes de caninos de Ibagué.

2.2.2. Detectar la presencia de grupos patógenos de Rickettsia spp. en caninos de

Ibagué, Tolima.

2.2.3. Evaluar factores de riesgo asociados a la presencia de Rickettsia spp. y E. canis

en caninos de Ibagué.

2.2.4. Establecer las posibles relaciones filogenéticas entre las cepas de E. canis

circulantes en el municipio de Ibagué, y las reportadas en Colombia.

3. MARCO TÉORICO

3.1.

Rickettsiosis

Las bacterias del género Rickettsia de la familia Rickettsiaceae ocasionan las enfermedades zoonóticas denominadas rickettsiosis (Hidalgo et al., 2013; Tortora et al.,

2013).

3.1.1. Clasificación taxonómica. El género Rickettsia abarca un gran grupo de bacterias

pertenecientes a la familia Rickettssiaceae, orden Rickettsiales, Clase Alphaproteobacteria, filo Proteobacteria (Tabla 1) (Day et al., 2017; Liu, 2015). La familia Rickettsiaceae consta de tres géneros Rickettsia, Orientia y Candidatus Cryptoprodotis, de los cuales Rickettsia y Orientia representan dos linajes evolutivos estrechamente relacionados (Liu, 2015).

Tabla 1. Clasificación taxonómica de Rickettsia spp.

Dominio Bacteria Reino Eubacteria Filo Proteobacteria Clase Alpha proteobacteria Orden Rickettsiales Familia Rickettsiaceae Género Rickettsia (da Rocha-Lima, 1916)

En 1906, Howard Ricketts describió un organismo asociado con la fiebre maculosa de las montañas rocosas con un ciclo de vida complejo que involucra dos huéspedes diferentes, garrapatas y mamíferos (Wood et al., 2012). En 1919, Burt Wolbach denominó la bacteria intracelular como Dermacentroxenus rickettsii (Wood et al., 2012). En 1922, Emile Brumpt propuso el nombre de R. rickettsii en honor a su descubridor (Wood et al., 2012).

Las bacterias del género Rickettsia se clasifican en base a sus características serológicas y fenotípicas en seis grupos representados por las especies R. rickettsii, R. massiliae, R. helvetica, R. akari, R. prowazekii y R. canadensis (Vitorino et al., 2007). En base a las características serológicas y mutagénicas, las especies del género Rickettsia se dividen en cuatro grupos, el Grupo de las Fiebres Manchadas (GFM), Grupo del Tifus (GT), el grupo ancestral (GA) y el grupo transicional (GTR) que comparten características con GFM y TG (Bernabeu-Wittela et al., 2005; Fournier et al., 2009; Fuxelius et al., 2007; Gillespie et al., 2007; Mansueto et al., 2012).

El grupo de las fiebres maculosas (SFG) engloba 32 especies: R. aeschlimannii, R. africae, R. amblyommii, R. asiatica, R. conorii, R. cooleyi, R. heilongjiangensis, R. helvetica, R. honei, R. hoogstraalii, R. hulinensis, R. hulinii, R. japonica, R. marmionii, R. martinet, R. massiliae, R. monacensis, R. mongolotimonae, R. montanensis (antes R. canadensis), R. moreli, R. parkeri, R. peacockii, R. philipii, R. raoultii, R. rhipicephali, R. rickettsii, R. rioja, R. sharonii, R. sibirica, R. slovaca, y R. tamurae (Agahan et al., 2011; Day et al., 2017; Oteo & Portillo, 2012; Richards, 2012; Woods, 2013).

Por otra parte, el grupo del tifus (TG) incluye las especies R. prowazekii y R. typhi (Day et al., 2017). El agente etiológico del tifus epidémico fue denominado R. prowazekii en honor a Stanislav von Prowazek, quien lo estudio durante las epidemias en Serbia (1913) y Hamburgo (1914) (Wood et al., 2012).

El grupo ancestral (AG) está formado por R. bellii y R. canadensis (antes R. canada); mientras que el grupo de transición (TRG) está formado por R. akari (el agente de la viruela rickettsia), R. australis (el agente del tifus por garrapatas del norte de Queensland) y R. felis (el agente de la viruela manchada transmitida por pulgas) (Agahan et al., 2011; Day et al., 2017; Mansueto et al., 2012; Oteo & Portillo, 2012; Richards, 2012; Walker, 2007; Woods, 2013).

3.1.1.1.

Grupo de la Fiebre Manchada. Las bacterias del grupo SFG se caracterizan por la capacidad de polimerizar actina y producir infecciones en el citoplasma y núcleo de las células huésped (Fournier, 2007). Dentro del grupo, se reportan 15 especies patógenas a nivel mundial (Fang et al., 2017), entre ellas se encuentran R. africae (el agente de la fiebre africana), R. conorii (el agente de la fiebre maculosa mediterránea (MSF) también conocida como fiebre botonosa), R. heilongjiangensis, R. honei, R. japonica, R. massiliae, R. mongolotimonae, R. parkeri, R. rickettsii (agente de la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas), R. rioja, R. sibirica (agente de la fiebre maculosa del norte de Asia), R. slovaca (Agahan et al., 2011; Oteo & Portillo, 2012; Richards, 2012; Woods, 2013).

3.1.1.2.

Grupo Tifus. La rickettsiosis del grupo del tifus (TG) es causada por R. typhi y R. prowazekii, 2 organismos de nivel de bioseguridad 3. R. typhi es responsable del tifus murino, la forma endémica de tifus transmitida por pulgas, que está surgiendo en regiones costeras predominantemente tropicales. Mientras que, R. prowazekii es responsable de la epidemia de tifus transmitida por piojos en las regiones templadas y tropicales. La infección por R. typhi suele ser más leve que la infección por R. prowazekii, con tasas de mortalidad del 4% y entre el 13%-30%, respectivamente (Angelakis et al., 2016).

3.1.2. Características fenotípicas. Los miembros del género Rickettsia son bacterias

gram negativas pleomórficas que pueden ser bacilares (0,3 a 0,5 μm de ancho y 0,8 a 2,0 μm de largo), cocoidales (0,1 μm de diámetro) o filamentosas (10 μm de largo) (Liu, 2015). Poseen un genoma pequeño (1,1–1,5 Mb) (Hidalgo et al. 2013; Tortora et al., 2013). Las rickettsias no poseen flagelos ni pili (Liu, 2015).

Las rickettsias tienen una capa de proteína microcapsular (capa S), compuesta por una o dos proteínas multiméricas, rOmpB y rOmpA (Liu, 2015). Al igual que otras bacterias Gram negativas, las paredes celulares de las rickettsias consisten en una membrana externa, el periplasma (espacio entre ambas membranas), y una membrana interna (plasmática) (Liu, 2015). La membrana externa está compuesta de proteínas,

fosfolípidos y lipopolisacáridos, lo que le permite reproducirse tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula infectada (Liu, 2015; Patel et al., 2020). El periplasma contiene peptidoglicano y proteínas de unión para aminoácidos, azúcares, vitaminas, iones, sustancias degradativas y enzimas desintoxicantes) (Liu, 2015).

3.1.3. Características genómicas. Los genomas de diferentes especies del TG, SFG, AG y TRG han sido secuenciados en los últimos años (Liu, 2015). Su material genético se encuentra dispuesto en un cromosoma circular de 1,1 Mb para la cepa vacunal de R. prowazekii y R. typhi, 1,2 Mb para R. conorii subsp. Israelensis y R. sibirica subsp. mongolitimonae, 1,3 Mb para R. massiliae, y 1,5 Mb para R. bellii (Andersson et al., 1998; Bishop et al., 2013; Blanc et al., 2007; McLeod et al., 2004; Sentausa et al., 2012a, 2012b; Ogata et al., 2006). Se han identificado entre 834 a 877 marcos abiertos de lectura (ORF) (Andersson et al., 1998; Bishop et al., 2013; McLeod et al., 2004; Sentausa et al., 2012b). Adicionalmente, se ha encontrado que en todas las especies se codifican entre 32 a 33 isoaceptores de ARN de transferencia (ARNt), y una única copia de los genes de ARN ribosomal (ARNr) 16S, 23S y 5S (Andersson et al., 1998; Bishop et al., 2013; Blanc et al., 2007; McLeod et al., 2004; Sentausa et al., 2012a, 2012b).

En R. massiliae se detectó un plásmido de 15,3 kb, en el cual se presume que hay 14 genes involucrados en la formación del pillis y la transferencia de ADN conyugal (Blanc et al., 2007). Por otra parte, el genoma de R. bellii posee poca colinealidad con otros genomas de rickettsias, ya que codifica para 1429 ORFs, 34 genes de ARNt (Ogata et al., 2006).

3.1.4. Patogenia. Rickettsia spp. son microorganismos intracelulares obligados, por ello

residen dentro del citoplasma de diferentes células eucariotas (e.g., células endoteliales, eritrocitos) (Liu, 2015). Inicialmente se genera la adhesión dependiente de calcio a la superficie celular externa mediante las proteínas rOmpA y rOmpB, son absorbidas por extensiones o invaginación de la membrana de la célula huésped (Figura 1) (Liu, 2015). Ingresan a la célula mediante la inclusión a una vacuola

fagocítica, luego lisa el fagosoma mediante una fosfolipasa, y migra hacia el citoplasma (Figura 1) (Liu, 2015). Tras la liberación del fagosoma, R. rickettsi forma una cola de cometa de actina filamentosa de 70 pm de longitud, para moverse a través del citosol y hacia la membrana de la célula huésped, donde es engullida por células vecinas para iniciar un nuevo ciclo infeccioso (Figura 1) (Liu, 2015).

Figura 1. Ciclo de vida de Rickettsia spp. del grupo de la fiebre manchada (SFG). Dentro del torrente sanguíneo, las rickettsias se dirigen a las células endoteliales vasculares, induciendo la captación mediada por actina y la posterior liberación de las rickettsias al citoplasma. Aproximadamente 8 h después de la invasión, las rickettsias SFG comienzan a replicarse en el citosol del huésped. Posteriormente, se propagan de célula a célula, un proceso en el que atraviesan directamente la unión célula-célula y entran en la célula vecina en una vacuola de doble membrana. Al escapar, pueden reiniciar el ciclo de vida.

Fuente: Autor.

Rickettsia spp. se reproduce en el citosol de la célula huésped con fases de crecimiento retardado, exponencial y estacionario (Liu, 2015; Sahni et al., 2013). Las células infectadas se llenan de rickettsias, llegando a veces a más de 800 microorganismos por célula, generando la lisis celular mediada por la fosfolipasa A2 (PLA2), y la diseminación de la infección en el medio intracelular (Liu, 2015).

En algunas células, las rickettsias SFG invaden el núcleo donde se multiplican para formar masas compactas (Liu, 2015). Las etapas posteriores de la infección se caracterizan por cambios típicos en la estructura celular, en particular la dilatación del retículo endoplásmico rugoso y la membrana nuclear externa y la acumulación de material denso en electrones dentro de las cisternas de las membranas intracelulares, generando la diseminación de los microorganismos sin lisar la célula huésped (Liu,

2015).

El ciclo de vida de las especies del grupo TG comienza de manera similar a SFG con una invasión y un rápido escape de la vacuola fagocítica (Figura 2) (McGinn & Lamason, 2021). Sin embargo, TG no posee una tasa de replicación constante, sino que por el contrario posee una breve fase de retraso inicial seguida de una replicación de altas densidades dentro de las células infectadas (Figura 2) (McGinn & Lamason, 2021). Una vez que la célula infectada se satura de bacterias, la célula huésped se lisa y libera grandes cantidades de bacterias infecciosas que posteriormente invaden otras células huésped (Figura 2) (McGinn & Lamason, 2021).

Figura 2. Ciclo de vida de Rickettsia spp. del grupo tifus (TG). Fuente: Autor.

3.1.5. Diagnóstico. La detección de las Rickettsias se basa principalmente en la

sospecha clínica y en la detección de anticuerpos mediante técnicas de serología como la inmunofluorescencia indirecta (IFI) para detectar las inmunoglobulinas IgM e IgG, tanto en fase aguda como en la convalecencia (Anaya-Ramírez et al., 2017). Además de ello, se ha implementado la detección mediante técnicas moleculares, como la PCR y posterior secuenciación, empleando los genes 23s ARNr comúnmente el gen gltA, que codifica la enzima citrato sintetasa y los genes que codifican las proteínas de membrana externa OmpA y OmpB (Oteo et al., 2014). Recientemente, se han realizados detecciones moleculares de R. rickettsii mediante la amplificación de la región RRi6 mediante PCR cuantitativa (qPCR) (Solis, 2017).

3.1.6. Epidemiología

3.1.6.1.

Vectores, reservorios y huéspedes. Las rickettsias son bacterias intracelulares obligadas, cuyo ciclo de vida involucra huéspedes tanto vertebrados como invertebrados (Liu, 2015). Los artrópodos hematófagos como niguas, garrapatas, pulgas y piojos no sólo actúan como vectores, sino que también funcionan como reservorios primarios y huéspedes amplificadores.

R. canadensis ha sido aislada de garrapatas Haemaphysalis spp. de Richmond (Canadá) y del condado de Mendocino (California) (Nogueras et al., 2014). El principal vector de R. akari es el ácaro Liponysoides sanguineus, que parasita a Mus musculus (Liu, 2015). Adicionalmente, los vectores de R. felis son pulgas como Ctenocephalides felis, y sus huéspedes son gatos y zarigüeyas (Liu, 2015).

Las rickettsias del grupo de las fiebres maculosas infectan las glándulas salivales, el intestino medio o los ovarios de garrapatas susceptibles (Figura 3) (Kim, 2022). Las garrapatas infectadas transmiten rickettsias a través de sus picaduras durante la alimentación con sangre, junto con componentes inmunomoduladores en la saliva de las garrapatas (Figura 3) (Kim, 2022). R. rickettsii es transmitida por la garrapata de la

madera Dermacentor andersonii, la garrapata del perro D. variabilis, Rhipicephalus sanguineus y Amblyomma cajennense (Figura 3) (Eremeeva, 2012). El vector de R. slovaca es D. marginatus, R. helvetica se encuentra asociada con Ixodes ricinus, R. sibirica ha sido detectada en más de 20 especies diferentes de garrapatas dirás de la familia Ixodidae, A. tifus es el vector de R. africae (Liu, 2015).

Figura 3. Ciclo de transmisión de R. rickettsii. Las garrapatas (Dermacentur spp) adquieren R. rickettsii al alimentarse, como larvas o ninfas, de un huésped infectado. Luego, este hemoparásito puede transmitirse durante la alimentación posterior de las ninfas o adultos. Además, la infección por R. rickettsii se puede transferir transováriamente en las garrapatas Dermacentor spp, lo que provoca que algunas larvas al eclosionar de los huevos ya están infectadas pro R. rickettsii. Fuente: Autor.

Se han descrito infecciones de R. prowazekii en la ardilla voladora americana, Glaucomys volans (Liu, 2015). Se cree que el tifus rickettsia epidémico se transmite entre animales a través del piojo específico de la ardilla y a los humanos a través de pulgas, que no son específicas del huésped (Liu, 2015).

Los pequeños mamíferos, como las ratas y las zarigüeyas, pueden actuar como huéspedes de las rickettsias (Liu, 2015). Adicionalmente, se ha identificado a Rattus norvegicus y R. rattus como reservorios de R. tyhphi, transmitida por pulgas y piojos de las ratas como Xenopsylla cheopis, designado como el principal transmisor de la enfermedad a humanos (Liu, 2015).

3.1.6.2.

Distribución geográfica. Diversos estudios han identificado más de 10 especies de Rickettsia spp. en Europa, 8 en Asia, 3 en África, 4 en Oceanía y 6 en América (Abdad et al., 2017; Balcells et al., 2011; Ghorbani et al., 1997; Horton et al., 2016; Parola et al., 2013), lo cual demuestra un amplio rango de distribución encontrándose en todos los continentes excepto en Antártida (Abdad et al., 2018). A pesar de ello, la mayoría de las especies de Rickettsias están bloqueadas por regiones debido a las condiciones climáticas y las limitaciones de vectores y hospedadores naturales, salvo R. prowazekii, R. typhi, R. felis y R. massiliae que se han reportado en todo el mundo (Abdad et al., 2011; Labruna et al., 2011; Telford et al., 2007).

El grupo de la fiebre manchada ha sido relacionado con infecciones en humanos de Belice, Costa Rica, Guatemala, Honduras, Nicaragua y Panamá (Bermúdez, 2018). En Colombia existen antecedentes de brotes de la fiebre manchada en Antioquia (Pacheco-García et al., 2008), Córdoba (Hidalgo et al., 2011) y Cundinamarca (Hidalgo et al., 2007; Patino et al., 2006), con seroprevalencias desde 7,8% hasta 87,7% y una letalidad de hasta el 95% (Hidalgo et al., 2007; Miranda et al., 2017; Patino et al., 2006; Ríos et al., 2008). Sin embargo, las fiebres manchadas causadas por Rickettsias se han considerado accidentales en humanos, mientras que los equinos y los caninos han sido estudiados como centinelas de la circulación del agente causal, debido a su contacto natural con la vegetación y con las garrapatas (Freitas et al., 2010; Toledo et

al., 2011). Los caninos pueden presentar un amplio espectro de signos clínicos, las cuales pueden ser leves hasta graves, con la presentación de cuadros clínicos no específicos de la enfermedad como lo son fiebre, anorexia, letargo, trombocitopenia, hemorragias petequiales y signos de daños neurológicos (Allison, 2013).

Se ha descrito una seroprevalencia para R. rickettsii de 18,2% en caninos de Villeta, Cundinamarca (Hidalgo et al., 2009). En el noroeste del país se determinó una prevalencia de Rickettsias en garrapatas del 5% y del 4% en pulgas (Londoño et al., 2017), mientras que, en municipios del departamento Caldas se estableció una alta prevalencia de R. amboinensis y R. felis tanto en pulgas de animales domésticos como en animales de vida silvestre (Colonia et al., 2020).

Con respecto al grupo tifus, el tifus murino ha sido reportado en pacientes de África, sudeste asiático, España, Canarias, Grecia, Alemania, Chipre, Italia, Francia, Croacia y Eslovenia respectivamente (Angelakis et al., 2010; Jensenius et al., 2009; Nogueras et al., 2006; Walter et al., 2012).

3.1.7. Signos clínicos. Las infecciones por el SFG no presentan signos clínicos

específicos que permitan la diferenciación de las fiebres causadas por otros patógenos como el dengue y Leptospira spp. (Ríos et al., 2008). Las especies con mayor relevancia en la salud pública de Latinoamérica y el Caribe: R. rickettsii, R. parkeri, R. massiliae y R. africae (Venzal, 2013; Spolidorio et al., 2010; Labruna et al., 2011). R. rickettsii es el agente causal de la enfermedad conocida como fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (FMMR), fiebre maculosa brasileira o fiebre de Tobias (Oteo et al.,

2014).

El cuadro clínico de la TG es fiebre, cefalea y exantema (Angelakis et al., 2016; Tsioutis et al., 2017), sin escaras de inoculación visibles. Durante el curso de la infección pueden ocurrir complicaciones cardíacas, pulmonares y del sistema nervioso central (Angelakis et al., 2016; Tsioutis et al., 2017).

3.2.

Ehrlichia canis

3.2.1. Clasificación taxonómica. En 1935, Donatien y Lestoquard identificaron

organismos en monocitos de perros con fiebre y anemia similares morfológicamente a Rickettsia, por lo que los clasificó como Rickettsia canis (Gutiérrez et al., 2016). Posteriormente, en 1945 Moshovski los reclasificó como Ehrlichia canis en honor al bacteriólogo alemán Paul Ehrlich (Gutiérrez et al., 2016). Actualmente, E. canis pertenece al grupo Alpha-proteobacteria, orden Rickettsiales (Tabla 1), el cual se encuentra conformado por bacterias intracelulares obligadas de las familias Anaplasmataceae y Rickettsiae que residen en vacuolas de células huésped (Bowman, 2011; Dumler et al., 2001; Popov et al., 1998).

Tabla 2. Clasificación taxonómica de Ehrlichia canis.

Dominio Bacteria Reino Eubacteria Filo Proteobacteria Clase Alpha proteobacteria Orden Rickettsiales Familia Anaplasmataceae Género Ehrlichia (Moshkovski 1945) Especie Ehrlichia canis (Donatien y Lestoquard, 1935), Moshkovski 1945

La familia Rickettsiae estaba compuesta por las tribus Ehrlichiae, Wolbachieae y Anaplasmataceae (Dumler et al., 2001), sin embargo, estás fueron abolidas dado que las afinidades genotípicas no se encontraban delimitadas (Dumler et al., 2001). Por ello, a partir del análisis filogenético del gen 16s ARNr (rrs) y el operón groESL, los géneros Anaplasma, Wolbachia, Ehrlichia, Cowdria, y NeoRickettsia fueron agrupados en la familia Anaplasmataceae (Tabla 2) (Dumler et al., 2001). La familia

Anaplasmataceae agrupa bacterias que se replican mientras están encerradas en la vacuola derivada de la membrana celular de la célula huésped (Bowman, 2011; Dumler et al., 2001; Rikihisa, 2010).

En el género Ehrlichia se encuentran las especies Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ruminantum, E. ewingii y E. muris (Tabla 2) (Dumler et al., 2001).

3.2.2. Características fenotípicas. Los microorganismos pertenecientes a la especie E. canis son gramnegativos, pequeños, pleomórficos, cocoides o helicoidales (Dumler et al., 2001; Popov et al., 1998). Estas bacterias presentan diferentes estadios, entre los cuales se encuentran las formas maduras infectantes extracelulares denominadas cuerpos elementales o células de centro denso (CD), los cuerpos reticulares (CR), las inclusiones citoplasmáticas inmaduras llamadas cuerpos iniciales, y las vacuolas citoplasmáticas rodeadas de membranas que las protegen y aíslan del sistema inmune, lisosomas y especies reactivas de oxígeno (ROS) de la célula huésped, predominantemente se encuentran agrupadas en inclusiones compactas designadas como mórulas (Tabla 3) (Gutiérrez et al., 2016; Harrus et al., 2012).

Tabla 3. Tamaño de los estadios de E. canis Estadio Ancho (µm) Largo (µm) CD 0,4 – 0,6 *

-

CR 0,4 – 0,6 * 0,7 – 1,9 * Cuerpos iniciales 1,0 – 2,5 *

-

Mórulas 2,0 – 4,0 ** 4,0 – 6,0 *

-

*Gutiérrez et al. (2016), ** Popov et al. (1998)

Las bacterias correspondientes a la especie E. canis están rodeadas por una membrana externa ondulada, un pequeño espacio periplásmico y una membrana interna (Popov et al., 1998). En la membrana externa posee proteínas de membrana externa (OMP) inmunodominantes (30 a 32 kDa), inmunoreactivas (19 y 110 kDa) e

inmunoprotectoras (28 y 140 kDa), similares a las OMP de E. chaffeensis, E. ewingii, E. ruminantium, A. marginale, A. phagocytophila y W. pipientis (Dumler et al., 2001; McBride et al., 2000; 2003; Ohashi et al., 2001; Reddy et al., 1998; Rikihisa, 2015; Unver et al., 2001; Yu et al., 2000).

Por otra parte, estos microorganismos en el citoplasma cuentan con numerosos ribosomas y una red de fibrillas de ADN, formando un nucleoide reticulado o denso (Popov et al., 1998).

3.2.3. Características genotípicas. E. canis es la especie del género Ehrlichia con el

genoma más pequeño, con un cromosoma circular de 1’315.030 pares de bases que codifican 984 genes, de los cuales 654 genes han sido correlacionados con una función (Mavromatis et al., 2006). Según Dumler et al. (2001), las secuencias del gen 16s ARNr (rrs) de E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris, y E. ruminantum poseen una homología del 97,7%. Y, de acuerdo con lo encontrado por Yu et al. (2007), el gen rrs posee un porcentaje de identidad entre el 99,9 y el 100% entre las cepas de E. canis reportadas en América, China, Israel, Japón y Turquía.

Se ha reportado que las OMP pueden llegar a conformar entre el 1 al 2% del genoma complete de las especies del género Ehrlichia (Rikihisa, 2015). Por otra parte, los OMP poseen tres regiones en tandem (α, β y γ) conservadas en E. canis y E. chaffensis para la regulación específica de la expresión de parálogos (Ohashi et al., 2011). Sin embargo, las expresiones génicas en Cis parecen estar reguladas por eventos por eventos policistrónicos en la mitad del extremo 5’ y eventos monocistrónicos en la mitad del extremo 3’, así como de manera independiente por los promotores putativos en los espacios intergénicos del extremo 3’ (Ohashi et al., 1998b; 2001).

Entre los principales OMP caracterizados se encuentra la familia multigénica polimórfica p30 (30 kDa) conformada por 28 genes en tandem con codones de inicio universales y funcionalmente activos, de los cuales 25 se encuentran en un loci multigénico y 3 genes en un locus separado dentro del genoma (Ohashi et al., 1998a;

1998b; 2001; Rikihisa, 1999; McBride et al., 1999; 2000; 2003). Adicionalmente, McBride et al. (1999) sugieren el procesamiento postraduccional de la proteína inmadura p30 para producir la proteína madura de 28 kDa (p28), siendo esta última altamente conservada entre las diferentes cepas de E. canis (McBride et al., 1999; Ohashi et al., 1998b).

Los antígenos caracterizados molecularmente incluyen la proteína antigénica principal

2 (MAP2), la glicoproteína de 120 kDa (p120), de 140 kDa (gp140) con 14 repeticiones

altamente conservadas en aislados de Estados Unidos, y la glicoproteína de 36 kDa (gp36) ortóloga de la glicoproteína de 47 kDa (gp47) de E. chaffeensis (Alleman et al., 2001; Doyle et al., 2005; McBride et al., 2003; Yu et al., 2000; 2007). gp36 se identifica por poseer una región N-terminal conservada, conformada por la región prerepetición N-terminal de 143 aminoácidos (aa) homologa en un 97,2% entre los aislados de E. canis; repeticiones en tándem que varían de 4 a 18 copias, que permiten la diferenciación de los aislados de E. canis; y una región rica en serina conformada por 9 aa (TEDSVSAPA) (Doyle et al., 2005; Yu et al., 2007).

Adicionalmente, se ha reportado que esta especie no codifica algunas enzimas presentes en otras especies Rickettsiales como la ADN polimerasa III, la formamidopirimidina ADN glucosidasa, la subunidad chi, la proteína de recombinación N (RecN) y ARNasa PH, prospecto atribuido a la pérdida de enzimas de la vía metabólica, como resultado de la evolución reductiva (Mavromatis et al., 2006). Aunado a esto, no se han encontrado translocasas para ATP o NADH, por lo que parece que E. canis depende de su producción intracelular de ATP (Mavromatis et al., 2006).

3.2.4. Patogenia. La infección en los caninos ocurre cuando una garrapata infectada

ingiere sangre, y la picadura conlleva al contacto con las moléculas anticoagulante, antiinflamatorias e inmunoreguladoras de las secreciones salivales de la garrapata que facilitan la transmisión de los microorganismos como E. canis (Figura 4) (Day 2011; Hajdušek et al., 2013; Procajło et al., 2011). Seguido a ello, las CD de E. canis entran al torrente sanguíneo, se ligan a la superficie de los monocitos mediante adhesinas como

p28 y las glicoproteínas ricas en serina y treonina con sitios de unión O-glicanos (gp19, gp36 y gp140) (Figura 4) (Gutiérrez et al., 2016; Harrus, 2015; McBride et al., 1999; 2003; McBride & Walker, 2011).

Figura 4. Ciclo de vida de Ehrlichia canis en caninos.

Fuente: Autor

Posteriormente, las CD se internalizan en la célula huésped a través de invasinas que inducen la endocitosis mediada por balsas celulares lipídicas denominadas caveolas (Figura 4) (Gutiérrez et al., 2016). Luego, las CD se desarrollan dentro de una vacuola rodeada de membrana plasmática celular que les proporciona un nicho de supervivencia y reproducción, se forma el cuerpo intermedio IM1, que pasa a ser CR (Figura 4) (Gutiérrez et al., 2016).

Las CR se multiplican por fisión binaria posiblemente facilitada por la presencia de calcio y hierro, dado que estos aumentan la polimerización del citoesqueleto de actina en la proliferación celular (Figura 4) (Alves et al., 2014; Harrus, 2015; Levenhagen et al., 2012). Sumado a esto, la polimerización de actina está vinculado con el tráfico de membranas, la formación de filopodios y la exocitosis. Y el hierro representa una de las fuentes principales de nutrientes para esta bacteria (Barnewall et al., 1997; Rikihisa, 2010a; 2010b). A posteriori, las CR se transforman en el cuerpo intermedio IM2, los cuales se convierten en mórulas al agrupar de 20 a 40 CD dentro de la vacuola (Figura

4) (Gutiérrez et al., 2016).

Pocos días después, las mórulas se transfieren intercelularmente a través de los filopodios o se desintegran por exocitosis (Figura 4) (Gutiérrez et al., 2016; Levenhagen et al., 2012; Thomas et al., 2010). Las CD son liberadas de los monocitos, por lo que las CD se pueden diseminar vía sanguínea, vía linfática o sistemas orgánicos como el hígado y bazo, para llevar a cabo los procesos de adhesión, invasión, proliferación celular, exocitosis y diseminación intercelular (Gutiérrez et al., 2016; Harrus et al., 1999; 2015; Kelly, 2000; Procajło et al., 2011; Skotarczak et al., 2003). En la vía linfática, las CD invaden células hematopoyéticas inmaduras y maduras de la medula ósea y células mononucleares de los ganglios linfáticos (Gutiérrez et al., 2016).

Las infecciones persistentes de E. canis son fomentadas por mecanismos efectores de la bacteria que interactúan y suprimen el sistema inmune del huésped (Harrus et al., 2015). Entre ellas se encuentran las numerosas repeticiones de anquirina de la glicoproteína de 200 kDa (gp200) que permiten translocar el núcleo de los monocitos infectados y, por ende, facilitan la activación de las vías de señalización del huésped conllevando a la inhibición del tráfico de lisosomas, la formación de fagolisosomas y la apoptosis celular, así como disminuyen las ROS y subregulan los receptores del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II en monocitos y macrófagos (Harrus, 2015; Liu et al., 2012; McBride et al., 2003; McBride & Walker, 2011; Nethery et al., 2007).

Adicionalmente, el Factor de Inhibición de la Migración de Plaquetas (PMIF), es una glicoproteína termoestable que potencia el secuestro y la estasis de las plaquetas generando la reducción del recuento de plaquetas periféricas (McBride et al., 2000). Sumado a esto, la interacción mórula-mitocondria inhibe el metabolismo mitocondrial manteniendo la permeabilidad de la membrana para evitar la apoptosis (Abeygunawardena et al., 1990; Liu et al., 2011). Y finalmente, la modulación de los niveles de expresión individual de las OMP mediante la recombinación génica contribuye a la variación antigénica que regula la inducción de citoquinas proinflamatorias, por lo cual, E. canis escapa de la vigilancia inmune del huésped (Buller et al., 1999; Cheng et al., 2008; 2013; Doyle et al., 2006; Harrus, 2015; Mavromatis et al., 2006; McBride et al., 2000; Ohashi et al., 2001; Rikihisa, 1991; 2014;

2015).

3.2.5. Ehrlichiosis monocítica canina (EMC). La ehrlichiosis monocítica canina (EMC)

es una rickettsiosis también conocida como fiebre hemorrágica canina, tifus de la garrapata canina, fiebre hemorrágica canina, enfermedad del perro rastreador, pancitopenia canina tropical, y trastornos hemorrágicos de Nairobi (Snowden et al.,

2022).

EMC puede ocasionar afectación en múltiples órganos como el bazo, los ganglios linfáticos, la médula ósea y la sangre periférica (Snowden et al., 2022). Las manifestaciones clínicas se encuentran relacionadas con la respuesta inflamatoria del huésped a la infección (Snowden et al., 2022).

3.2.6. Epidemiología. La frecuencia la ehrlichiosis ha aumentado lo que puede deberse

a un aumento en el reconocimiento y la disponibilidad de diagnósticos, así como a la expansión de la distribución geográfica de sus vectores (Snowden et al., 2017). Las infecciones se informan con mayor frecuencia durante los meses de verano, coincidiendo con las etapas adulta y ninfa del ciclo de vida de la garrapata, en las que es más probable que piquen a los huéspedes (Snowden et al., 2017).

4. METODOLOGÍA

4.1.

Muestreo

4.1.1. Área de estudio. El estudio se desarrolló en el municipio Ibagué del

departamento del Tolima. Se encuentra ubicado en el centro occidente de Colombia, sobre la cordillera central de los Andes entre el Cañón del Combeima y el Valle del Magdalena, a una altitud de 1225 m.s.n.m. Ibagué posee un área de 1498 km2 a 24 °C, y una población de 450785 habitantes.

4.1.2. Tamaño muestreal. El tamaño de la muestra se estimó a través de la fórmula

descrita por Thrusfield (2018) con un nivel de confianza del 95%, una precisión o error del 5% y una prevalencia esperada para E. canis del 31,6% (Salazar et al., 2014) y del 18,2% para Rickettsia spp. (Hidalgo et al., 2009).

𝑛= 𝑧2 ∗𝑝∗𝑞 𝑑2

Dónde:

z2 = coeficiente del nivel de confianza prefijado (1.962, nivel de confianza de 95%) p = proporción esperada (en este estudio 31,6% = 0,316) q = 1- p d= precisión (en este estudio un 5%; 0,05)

Para efectos de este trabajo se tomaron 337 muestras de sangre de caninos, 173 muestras corresponden a caninos que concurrieron al censo vacunal para la rabia canina (MINSALUD, 2019), y 164 muestras corresponden a caninos atendidos en clínicas veterinarias privadas de Ibagué, Tolima.

4.1.3. Declaración ética. Todos los propietarios de los caninos aceptaron la

participación de sus mascotas en el estudio y firmaron un consentimiento informado del

uso de las muestras de sangre completa (Anexo 1). Sumado a esto, las muestras de sangre y la anamnesis fueron realizadas por un médico veterinario, según los parámetros de buena praxis veterinaria. Adicionalmente, los procedimientos siguieron la guía del cuidado animal y su uso en investigación establecido por el comité de ética de la Universidad del Tolima.

4.1.4. Toma de muestras. Las muestras sanguíneas fueron tomadas por médicos

veterinarios mediante el método de goteo, se le colocó un bozal y se localizó la vena cefálica para caninos de talla pequeña o yugular para cachorros, se desinfectó el área de punción con torundas de algodón cubiertas de alcohol al 70% (Figura 5) (Ruiz & Salinas, 2017).

Figura 5. Procedimientos para la toma de muestras.

Fuente: Autor.

Luego, se ocluyó la vena mediante presión digital mientras se estiraba la piel sobre la vena para inmovilizarla, se insertó una aguja calibre 22, y el tubo tapa lila con anticoagulante EDTA de 1 mL se ubicó bajo la parte posterior de la aguja (Ruiz & Salinas, 2017). A cada muestra se le asignó un código, las dos primeras letras corresponden a la sigla del del proyecto (ER), y los números al consecutivo de las mismas (Figura 5). Finalmente, fueron almacenadas a -20 °C hasta ser procesadas para la extracción de ADN.

4.1.5. Encuesta epidemiológica. A los propietarios de los caninos de los que se obtuvo

las muestras, se les realizó una encuesta epidemiológica basada en el estudio desarrollado por Arenas et al. (2016), sobre factores demográficos, de su entorno y estilo de vida que permitieron establecer los factores de riesgo asociados a la presencia de los patógenos en Ibagué, Tolima (Figura 5). Se tuvo en cuenta información general como la raza, la edad y el sexo del canino; aspectos de interacción social como la cantidad de personas que habitan en el hogar, la presencia de más caninos en la casa o periferia de la misma y la permanencia del canino en el hogar durante el día o la noche; aspectos del entorno físico tales como la presencia de alguna producción agropecuaria o zonas boscosas cerca de la vivienda; aspectos físicos del canino tales como su condición corporal, presencia de garrapatas y/o pulgas, el tipo de pelaje como corto o largo, y el padecimiento reciente de una enfermedad; y adicionalmente, se incluyeron aspectos epidemiológicos tales como la presencia de personas enfermas en la vivienda (Anexo 2).

La clasificación de la condición corporal de los caninos fue realizada por los médicos veterinarios, empleando el sistema de puntuación de condición corporal (BCS) de acuerdo con las descripciones e ilustraciones proporcionadas por la World Small Animal Veterinary Association (Chun et al., 2019). Según el cual, en las escalas BCS 1

– 3 el canino tiene huesos fácilmente visibles y palpables con poca o ninguna grasa, y

tanto su cintura como pliegue abdominal son fácilmente identificables desde arriba y de lado; los caninos que poseen huesos con una ligera cubierta de grasa, y una cintura y

un abdomen aparentes de pato, fueron englobados en las escalas BCS 4 y 5; y aquellos caninos que tenían costillas cubiertas de grasa, ausencia de cintura y distensión abdominal evidente se encuentran en las escalas BCS 6 – 9 (Chun et al.,

2019).

Figura 6. Extracción de ADN con el método PCI (25:24:1).

Fuente: Autor.

4.2.

Extracción de ADN

4.2.1. Protocolo de extracción de ADN con PCI (25:24:1). Se tomaron 300 µL de

sangre y se depositaron en un tubo de 1.5 mL (Figura 6). Se agregaron 600 µL de buffer de lisis (10 mM Tris-Cl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8.0); 0,1 % (w/v) SDS) y se homogenizó golpeando suavemente el tubo, luego se adicionaron 3 µL de Proteinasa K (Stratec Molecular, Alemania) a la mezcla y se incubó durante 3 h a 55 °C en constante agitación (Figura 6).

Posteriormente, se incubó a 94 °C por 15 min para inactivar la Proteinasa K (Figura 6). Seguido a ello, se transfirieron 700 µL del producto de lisis a un tubo de 2 mL y se adicionó fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (PCI) (25:24:1) en una proporción de volumen 1:1 con la muestra y se mezcló por inversión de 5 a 7 veces, se centrifugó a

13500 rpm por 10 min a 4 °C. La fase acuosa (400 µL) que contiene el ADN se

transfirió a un tubo de 2 mL y la fase orgánica se descartó (Figura 6). Se adicionó cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) en una proporción de volumen 1:1, se mezcló por inversión y se incubó a 4 °C por 5 min. Se centrifugó a 13500 rpm por 10 min a 4 °C y se transfirió el sobrenadante (200 µL) a un tubo de 1,5 mL (Figura 6).

Para la precipitación, se adicionaron 20 µL de acetato de sodio 3M y se mezcló por inversión 4 veces (Figura 6). Posteriormente, se adicionaron 440 µL de etanol al 99% a -20 °C, y se mezcló por inversión 4 veces (Figura 6). Luego, se incubó durante 15 min a -20 °C, seguido de una centrifugación a 14000 rpm durante 15 min a 4 °C (Figura 6). Posterior a la centrifugación, se descartó el sobrenadante por inversión sobre una servilleta y se dejó secar el tubo por 5 min (Figura 6). Se lavó el pellet adicionando 1 mL de etanol al 75% a -20 °C y se centrifugó a 14000 rpm durante 10 min a 4 °C (Figura 6). Se descartó el sobrenadante por inversión, de la misma manera que se describió anteriormente y se retiró el remanente de sobrenadante con una pipeta de 10 µL, sin remover el pellet (Figura 6). El pellet se resuspendió en 20 µL de buffer TE (Stratec Molecular, Alemania) y se almacenó a -20 °C (Figura 6).

4.2.2. Cuantificación y dilución del ADN. La cuantificación de la calidad del ADNg se

realizará haciendo uso del equipo NanoDrop OneTM (Thermo Scientific, Estados Unidos) (Figura 7). Seguido a ello, se realizó la dilución de las muestras con H2O d.d. autoclavada, para obtener una concentración final de 50 ng/µL como lo recomienda Carter et al. (2013) (Anexo 3).

4.2.3. Calidad e integridad del ADN. La integridad del ADN extraído se verificó

mediante electroforesis horizontal, en un gel de agarosa al 1% (Figura 7) (Chen et al., 2018). Sumado a esto, se verificó la calidad del ADN a partir de la amplificación de un fragmento de 497 pb del gen beta-actina (ACTB) con los primers descritos en la Tabla 2 (Figura 7).

Figura 7. Metodología de verificación de la calidad del ADN extraído. Fuente: Autor.

4.3.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para la detección específica de E. canis a partir de sangre de caninos, se emplearon los primers que amplifica un fragmento de 116 pb del gen gp36 (Tabla 4). Adicionalmente, para detectar la presencia de Rickettssia spp. se amplificó un fragmento de 401 del gen gltA, y la identificación de las Rickettsias del grupo de la fiebre manchada y/o el grupo tifus se realizó mediante la amplificación de un fragmento de 426 pb del gen ompB con los primers descritos en la Tabla 4.

Para la reacción de PCR se usó una mezcla maestra para un volumen final de 25 μL, compuesta por 13,875 μL de agua destilada-desionizada (H2O d.d), 5 μL de 5X GoTaq Green Buffer, 1 μL de dNTPs, 1 μL de MgCl2 [1,5 mM], 1 μL del primer Forward y 1 μL del Reverse [10 pmol/μL] (Tabla 2), 0,125 μL de GoTaq DNA Polimerasa [5 U/μL], y 2 μL de las muestras de ADN [100 ng/μL]. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador ProFlex PCR System (Applied Biosystems, Estados Unidos), con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos comprendidos por 30 s de desnaturalización a 95 °C, 30 s de anillaje a 55 °C y 30 s de extensión a 72 °C, y un ciclo de extensión final a 72 °C durante 3 min.

Tabla 4. Secuencia de los primers usados para la detección de agentes Rickettsiales y el gen ACTB de canino.

Organismo Gen Primer (5’ – 3’) Tamaño del amplicón (pb) Ref.

Canis lupus familiaris

ACTB

F: GGCTACAGCTTCACCACCAC

497

Pérez- Ramírez et al. (2023)

R: TACTCCTGCTTGCTGATCCACA

Ehrlichia canis gp36

F: CCAATGGCTCCTTTTCATGAGT

116

Este studio

R: GCAGGACGTGATGGATTTCC

Rickettsia spp.

gltA

F: GCAAGTATCGGTGAGGATGTAAT

401

Miranda et al. (2020)

R: GCTTCCTTAAAATTCAATAAATCAGGAT

SFG y TG ompB

F: GTTTAATACGTGCTGCTAACCAA

427

Blanda et al. (2017)

R: GGTTTGGCCCATATACCATAAG

Se incluyó un control positivo una muestra de ADNg extraída a partir un canino diagnosticado con EMC, previamente secuenciado y verificado. En las amplificaciones del gen gltA de Rickettsia spp. se incluyó un control positivo de R. belli, y para las rickettsias patógenas se empleó un control positivo de R. conorii. Como control negativo en todas las reacciones de PCR se empleó H2O d.d.

4.4.

Electroforesis horizontal.

Los productos fueron detectados mediante electroforesis horizontal, en gel de agarosa al 2% preparada con TBE 0,5X (TRIS 0,9 M, ácido bórico 0,9 M, EDTA 0,02 M) empleando Hydragreen (ACTGene, Estados Unidos) como agente intercalante. El tamaño de los amplicones se determinó empleando 2 μL del marcador de peso molecular de 100 pb DNA ladder (New England, BioLabs, Estados Unidos). Las condiciones utilizadas en la electroforesis fueron 100 V por 40 minutos en TBE 0.5X usando el equipo PowerPac HC (BIO-RAD, Estados Unidos). Posteriormente, los geles fueron visualizados en el fotodocumentador ENDURO GDS (Labnet International, Estados Unidos).

4.5.

Análisis estadístico.

4.5.1. Estimación de la prevalencia. De acuerdo con lo reportado por Spronk et al. (2019) y Gail et al. (1999), las prevalencias puntuales de E. canis y Rickettsia spp. se determinaron con el método de conteo, siendo este definido como la suma de todas las muestras positivas dividido por el número total de muestras tomadas en este estudio (n= 337).

4.5.2. Factores de riesgo. Para la interpretación de los datos, los caninos se agruparon

en 3 rangos de edad donde el grupo de cachorros incluye aquellos que tienen entre 1 a

12 meses, el grupo de jóvenes a los caninos de 13 a 108 meses, y el grupo de adultos

a los de 109 a 190 meses. Adicionalmente, su condición corporal fue analizada en 3 grupos: BCS 1 – 3, BCS 4 y 5, y BCS 6 – 9.

Se utilizó el paquete estadístico Epi Info v7, para el análisis de las variables independientes incluidas en la encuesta epidemiológica, por medio del cual se realizaron tablas de frecuencias de dichas variables, la prueba de Chi-Cuadrado (X2), Odds ratio y la prueba de Fisher.

4.6.

Análisis bioinformático del gen gp36

4.6.1. Secuenciamiento. Los fragmentos del gen gp36 de E. canis se confirmaron

mediante secuenciación por el método de Sanger en Macrogen Inc (Seoul, Corea). Seguido a ello, las secuencias obtenidas se ensamblaron en el software Geneious Prime v2023.1.4 (Kearse et al., 2012) y se compararon con lo reportado en la base de datos del GenBank (NCBI, Estados Unidos) mediante el uso de la herramienta

BLASTN.

4.6.2. Análisis filogenético. Las relaciones genéticas de E. canis fueron representadas

con un árbol filogenético construido en base a las secuencias del gen gp36 obtenidas en este estudio, así como secuencias previamente reportadas en el GenBank. El método de inferencia filogenética Neighbor Joining fue usado con 1000 réplicas para representar la historia evolutiva de los taxa analizados.

4.6.3. Modelamiento de la estructura. Los dominios se predijeron utilizando

InterproScan y la herramienta de dominios conservados (Paysan-Lafosse et al., 2023). Además, la predicción de las interacciones proteína-proteína a partir de la secuencia se llevó a cabo en ProteinPrompt (Canzler et al., 2022). El modelo estructural de GP36 se construyó en SWISS-MODEL (Studer et al., 2019), utilizando la estructura de RMN de E. canis GP36 (T1SC26.1. A) como plantilla.

5.

RESULTADOS

5.1.

Población de estudio.

Se colectaron 218 encuestas epidemiológicas completas, después del proceso de depuración, por lo que el análisis de la población y los factores de riesgo fueron evaluados en base a este n muestreal. Se cuenta con la información epidemiológica de

45 caninos del área urbana pertenecen a 9 de 13 comunas de Ibagué, 17 de ellos

residen en Ricaurte (barrio Andrés López de Galarza), 9 en Calambeo (barrio Ancón), 6 en Salado (barrio Villa Clara y urbanización Limón), 3 tanto en Picaleña – Mirolindo como en Piedra pintada y Vergel, 2 Jordán, 1 en Centro y Simón Bolivar.

Con respecto a los 173 caninos del área rural pertenecen a 13 de los 17 corregimientos del municipio, 59 de ellos residen en el corregimiento Totumo (vereda Llanos Combeima, n=22; vereda Potrero grande, n=25; vereda Salitre, n=8; vereda Totumo, n=10), 32 en Coello Cocora (vereda Honduras, n=12; vereda La Loma, n=20), 14 en Salado, 13 en Cay, 11 en Calambeo (vereda Ancón tesorito, n=2; vereda Ambalá, n=9) y San Bernardo, 9 en Buenos Aires y Carmén de Bulira, 8 en San Juan de la China y Tapias, 7 en Gamboa específicamente en la vereda Tambo, 2 en Toche, y 1 en Juntas.

Los caninos en un 43,57% (95/218) corresponden a hembras y 56,46% (123/218) a machos; el 18,35% (40/218) cuentan entre 1 a 12 meses, el 67,43% (147/218) tienen entre 13 a 108 meses, y el 14,22% (31/218) son de 109 a 190 meses. Entre las razas incluidas en el muestreo se encuentran Beagle (n=2), Border collie (n=1), Boston terrier (n=1), Boxer (n=1), Cocker spaniel (n=5), Doberman (n=1), French poodle (n=5), Golden retriever (n=6), Labrador (n=8), Bichón maltés (n=1), Pastor alemán (n=6), Pincher (n=5), Pit bull Terrier Americano (n=1), Pitbull bully (n=6), Sabueso fino colombiano (n=1), Schnauzer (n=4) y Shih tzu (n=2). Así como 77 eran criollos y 85 cruces (Dalmata, n=2; Labrador, n=1; Labrador – Pastor alemán, n=1; Rhodesian ridgeback, n=1; y Rottweiler, n=1).

Lo que respecta al estado físico y de salud de los caninos, el 71,10% (155/218) se agrupa en el BCS 3, el 20,18% (44/218) al BCS 2, el 6,88% (15/218) al BCS 4, el 1,83% (4/218) al BCS 1, y no se reportaron caninos en BCS 5 o con sobrepeso (BCS 6

– 9). El 15,60% (34/218) presentaban alguna lesión cutánea (eritematosa, n=5;

granulosa, n=3; hiperquetatósica, n=6; ulcerosa, n=20), de los cuales 7 caninos tenían más de una lesión (granulosa y hiperqueratósica, n=2; granulosa y ulcerosa, n=2; ulcerosa y hiperqueratósica, n=1; eritematosa y hiperqueratósica, n=1; eritematosa, hiperqueratósica y ulcerosa, n=1)

El 28,90% (63/218) presentó prurito, el 29,36% (64/218) poseía garrapatas, y el 23,85% presentaron alguna enfermedad como parasitosis por ácaros, anemia, ceguera, claudicación del miembro torácico derecho, colitis, congestión, conjuntivitis, convulsiones, dermatitis con escoriación, diarrea sanguinolenta, ehrlichiosis, emaciación, enfermedad renal, epistaxis, fiebre, gastroenteritis alimentaria y parasitaria, ictericia, inapetencia, indigestión, inflamación en encía, letargo, linfadenitis, moquillo, neoplasia submandibular, nuches, otitis bilateral, pancreatitis, parvovirosis, periodontitis grado 3, QCS, sarna, sangrado prepucial, sarna, traqueobronquitis infecciosa, trauma con hematoma y mordedura, trombocitopenia, y vómito.

El 73,85% (161/218) de los caninos pasan la mayor parte del día en casa, el 79,36% (173/218) permanecen en casa durante la noche, y el 80,73% (176/218) habitan con más caninos; el 71,56% (156/218) los caninos residen cerca a zonas boscosas, y en el 41,28% (90/218) de las viviendas en que residen los caninos hay producciones agropecuarias como avicultura y porcicultura. El 11,47% (25/218) se han desplazado de otro lugar como Buenaventura (n=1), Bogotá (n=3), Chaparral (n=2), Charco Rico (n=1), Chinchiná (n=2), Espinal (n=1), Palermo (n=1), Salento (n=1) y San Rafael (n=1),

3 del área urbana de Ibagué (barrio Salado, n=1) y 7 del área rural del mismo municipio

específicamente del corregimiento Totumo.

5.2.

Concentración y calidad del ADN

El ADNg extraído a partir de la sangre completa de los 337 caninos obtuvo una media de concentración de 184,1 ng/µL con un valor mínimo del 23,30 y 4161 (Anexo 3). Estas muestras de ADNg oscilaron entre 1,23 y 2,20 en la relación A260/A280 con una media de 1,90, y un coeficiente de variación de 9,83% (Figura 8). Los valores de la proporción 260/A230 oscilaron entre 0,37 y 2,85 con una media igual a 1,79, y un coeficiente de variación del 20,07% (Figura 8).

Figura 8. Cajas de bigotes de la proporción A260/A280 y la proporción A260/A230. Representando la media, valores mínimos y máximos, y el error estándar.

Se verificó la integridad del ADNg extraído mediante una electroforesis horizontal en un gel de agarosa al 1% (Figura 9, Anexo 4). Adicionalmente, se comprobó la calidad del material genético mediante la amplificación de un fragmento del gen ACTB (Figura 10, Anexo 5).

Figura 9. Integridad del ADNg extraído a partir de sangre completa de caninos. WM: DNA Molecular Weight Marker 1Kb Ladder (Thermofisher, EE. UU.), 1 – 21: ER_001 – ER_0021, gel de agarosa al 1%.

Figura 10. Amplificación del gen ACTB a partir del ADNg extraído de sangre completa de caninos. WM: Marcador de pesos molecular GeneRuler (100 pb), 1 – 20: ER_001 – ER_020, NT: Control negativo.

5.3.

Detección molecular

Doscientos treinta y cinco (235/337) perros fueron positivos para E. canis representando una prevalencia de 69,73%, donde 105 (60,69%) perros vivían en zona rural y 130 (79,27%) en zona urbana (Figura 11).

Figura 11. Amplificación de un fragmento del gen gp36 de Ehrlichia canis a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos. MP: 1 kb Opti-DNA Marker (abm, Canadá); 1. Control positivo de E. canis. 2 – 10: ER_015-ER_023. 11: NTC. Gel de agarosa al 2%.

En total 33 perros resultaron positivos para Rickettsia spp., con una prevalencia del 9,79%. A partir de la amplificación del gen gltA se estimó una prevalencia de 9,49% (32/337), donde 26 perros (15,03%) pertenecían a zonas rurales y 6 (3,66 %) a las zonas urbanas (Figura 12). En cuanto a las rickettsias patógenas (SFG y TG), se encontraron 10 (2,96%) perros positivos de zonas rurales mediante la amplificación del gen ompB (Figura 13). Además, se encontraron coinfecciones entre E. canis y Rickettsia spp. en 32 (5,04%) perros, 16 (8,67%) de zona rural y 6 (1,22%) de zona urbana; así como coinfección entre E. canis y rickettsias de los grupos SFG y TG en 1 (0,30%) perro de área rural.

Figura 12. Amplificación de un fragmento del gen gltA de Rickettsia spp. a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos. MP: 1 kb Opti-DNA Marker (abm, Canada); 1 – 8: ADNg de muestras ER_001 – ER_008. Agarosa 2%.

Figura 13. Amplificación de un fragmento del gen ompB de rickettsias patógenas (SFG o TG) a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos. MP: 1 kb Opti-DNA Marker (abm, Canada); 1 – 4: ADNg de muestras positivas para Rickettsia spp.; 5: control positivo R. conorii; 6: control negativo R. bellii; 7: NTC. Agarosa 2%.

5.4.

Factores de riesgo.

La enfermedad previa se determinó como un posible factor de riesgo asociado a la presencia de E. canis en perros (OR= 2,45, p= 0,03) (Tabla 5), así como las áreas boscosas cercanas a las casas de los perros son un posible factor de protección de infección por este patógeno (OR= 0,45, p= 0,03) (Tabla 5). Otros factores evaluados no se asocian con la presencia o ausencia de E. canis en perros de Ibagué (Tabla 5).

Además, cruces (OR= 2,70, p= 0,03), lesiones hiperqueratósicas (OR= 5,62, p= 0,05) y residentes cerca de zonas boscosas (OR= 2,48, p= 0,049) son factores de riesgo asociados a la presencia de Rickettsia spp. en los perros de Ibagué. Asimismo, se determinó que tener una condición corporal de 2 (OR= 0,85, p= 0,008) es un factor de protección para la presencia de microorganismos rickettsiales (Tabla 5).

Tabla 5. Características de la población canina y los valores OR. Factor de riesgo E. canis Rickettsia spp.

OR Valor p OR Valor p Sexo

Hembra

0,85

0,57

1,10

0,96

Macho

1,18

0,57

0,91

0,96

Edad

Joven

0,33 0,00007 1,45

0,46

Adulto

0,04 0,00003 0,98

0,0004

Adulto mayor

0,09 0,00005 0,64

0,41

Geriatrico Ind*

1,05

0,65

Raza

Cocker spaniel

0,33

0,22

1,32

0,58

Mestizo

1,86

0,35

Ind Labrador Retriever

1,59

0,44

Ind Cruces

0,68

0,98

2,70

0,03

Pitbull Ind

4,25

0,08

Condición corporal

1

1,57

0,57

1,78

0,50

2

0,81

0,16

0,85

0,008

3

0,87

0,06

1,33

0,19

4

3,32

0,08

0,38

0,31

Pelaje

Corto

1,08

0,90

1,74

0,28

Largo

0,92

0,01

0,57

0,28

Lesiones dermatológicas Eritematosa Ind

1,32

0,58

Hiperqueratosica

1,04

0,66

5,62

0,05

Ulcerosa

0,69

0,25

1,46

0,35

Prurito

1,16

0,77

1,29

0,67

Garrapatas

0,99

1,00

1,36

0,59

Otra enfermedad

2,45

0,03

0,66

0,52

Día en la casa

1,58

0,20

1,39

0,61

Noche en la casa

1,05

1,00

0,48

0,24

Más caninos

0,69

0,44

2,66

0,17

Areás agricolas cerca al hogar

1,02

1,00

2,21

0,06

Áreas boscosas cerca a la casa

0,45

0,03

2,48

0,04

Desplazamiento de otro municipio

2,10

0,22

0,21

0,14

*Ind: Indeterminado. Valores significativos en negrita.

5.5.

Caracterización molecular

Las secuencias parciales ER_051 y ER_093 codifican 38 aa, donde ER_093 tiene una mutación en aa 12 presentando el cambio de Asparagina a Lisina (A - K) (Figura 14B y 14C). En cuanto a la secuencia ER_235, presentó el cambio de Histidina a Isoleucina (H - I) en el aa 12 (Figura 13A), y en la posición 37 de la secuencia de nucleótidos deleción de C, provocando cambios en el marco abierto de lectura (ORF) y una longitud de 37 aa (Figura 13A). Según el análisis realizado en InterproScan y ProteinPrompt, los cambios en el ORF de ER_235 comprenden una región de una dineína unida a la membrana (Figura 14A) que se prevé que esté incrustada en la membrana.

Figura 14. Análisis bioinformático de la región de la proteína GP36 de E. canis. A: Alineamiento múltiple de secuencia de aminoácidos de la región de la proteína GP36, mostrando la región VNN (anotación purpura), N-glicosilación en NPSRP (anotación amarilla), región de unión a la dineína (anotación azul), y región FFLSMH (anotación verde). Ehrlichia canis (número de acceso MN159558) fue usada como secuencia de referencia para las secuencias ER_051, ER_093 y ER_235 de este estudio. B y C: Modelo de la superficie de la proteína GP36 de ER_051 y ER_093, mostrando las diferencias estructurales denotadas por los cambios de V a G (flecha verde) y N a K (flecha naranja).

Las secuencias de nucleótidos obtenidas en este estudio y de los serogrupos de E. canis de Brasil (MN159558), EE. UU. (MN159531) y Costa Rica (MN159552) se agruparon en un solo clado con alto apoyo (57,4), identidades superiores al 98,29 %. y diferenciado del serogrupo Taiwán (EU139491) con porcentajes de identidad entre 84,96% y 85,84% (Figura 15).

Figure 15. Análisis filogenético basado en las secuencias de nucleótidos del gen gp36 de E. canis. La secuencia del gen gp40 de E. chaffeensis fue empleada como outgroup. Los números de acceso se encuentran en paréntesis. El número en los nodos representan el porcentaje de la reiteración, 1.000 boostrap.

6. DISCUSIÓN

6.1.

Diagnóstico molecular

La EMC y la rickettsiosis en fase subclínica son de difícil detección a través de los exámenes de rutina ya que la mayoría de los caninos se encuentran asintomáticos y las pruebas comúnmente utilizadas para identificar el agente etiológico son frotis de sangre periférica, ELISA, IFI e inmunocromatografía, que muestran baja sensibilidad y especificidad para Rickettsia spp. y E. canis (Anaya-Ramírez et al., 2017; Daramola et al., 2018; Franco-Zerina et al., 2019; López-Romero & Soler-Tovar, 2020). Por lo tanto, la detección de agentes etiológicos en nuestro estudio se realizó por PCR, que se considera una técnica altamente sensible y específica para la identificación de hemoparásitos (Daramola et al., 2018; Neer et al., 2002).

Se ha utilizado una amplia variedad de dianas moleculares para la detección de Ehrlichia spp., entre ellas se ha demostrado que el 16s rRNA y el gen gbs son altamente específicos; sin embargo, no se recomiendan para la diferenciación de especies (Franco-Zetina et al., 2019; Geiger et al., 2018). Por otro lado, el gen gp36 utilizado en nuestro estudio muestra una alta especificidad y sensibilidad para la identificación de E. canis ya que tiene entre 5 y 18 copias en el genoma (da Costa et al., 2019; Geiger et al., 2019).

En Japón, Malaysia, Myanmar, Turquía y Estados Unidos, se encontraron frecuencias inferiores al 6% de E. canis, valor menor que lo reportado en este estudio (Aktas et al., 2015; Dugan et al., 2005; Hmoon et al., 2021; Inokuma et al., 2007; Nazari et al., 2013; Sashika et al., 2011; Yabsley et al., 2008). Se ha detectado una frecuencia del 12,2% de E. canis en China, y del 16% en Italia y España (Ebani et al., 2017; Mengfan et al., 2020; Millán et al., 2016). En perros de Nigeria se halló una frecuencia de infección de E. canis de 22,9%, en Austria del 26,2%, en Pakistán del 28%, y en Costa Rica del

47,7% (Götsch et al., 2009; Daramola et al., 2018; Malik et al., 2018; Romero et al.,

2011).

Lo que respecta a Suramérica, en Brasil se reportó la prevalencia de anticuerpos anti- Ehrlichia en un 70% (Vieira et al., 2011), una prevalencia molecular del 21,7% al 38,9% en caninos sanos, y una frecuencia entre el 20% y 30% en perros con signos clínicos no específicos en hospitales y clínicas veterinarias (Dagnone et al., 2003; Harrus & Waner, 2011; Moraes et al., 2004; Santos et al., 2009; Waner et al., 2014). Adicionalmente, se encontró una frecuencia del 10,45% de E. canis en perros de Paraguay, 6,7% de Argentina, y del 51,3% en perros de Perú (Cicuttin et al., 2016; Huerto-Medina & Dámaso-Mata, 2015; Vinasco et al., 2007).

En el presente estudio, por métodos moleculares, se encontró una alta frecuencia de E. canis (69,73%) en perros, similar a estudios previos de frecuencia en la misma ciudad (63%) (López & Ruíz, 2016), y la prevalencia reportada en Cartagena (84%) y Cali (49,5%) (McCown et al., 2015; Molano et al., 2008). Sin embargo, difiere con la prevalencia de Caquetá (22,4%) (Orjuela et al., 2015), Montería (27%) (Jaramillo, 1996), Barranquilla (28%) (Badillo-Viloria et al., 2017), y Medellín (29,7%) (Cartagena et al., 2015). Además, la prevalencia del 69,73% no concuerda con la seroprevalencia reportada previamente en perros sintomáticos para Ibagué (31,66%) (Salazar et al., 2014), posiblemente porque la sensibilidad de la PCR es mayor que la de la serología (Franco-Zetina et al., 2019; López-Romero & Soler-Tovar, 2020).

Además, el clima de la ciudad de Ibagué brinda condiciones adecuadas de crecimiento y proliferación para vectores como Rhipicephalus sanguineus, R. microplus, Amblyomma ovale, A. cajenense, A. maculatum, A. tigrinum, A. triste, A. varium, Dermacentor parumpaertus y Haemaphysalis longicornis (Benavides-Montaño et al., 2018; Rivera-Páez et al., 2018a; 2018b). Sumado a esto, las temperaturas más altas afectan el comportamiento de vectores como R. sanguineus, lo que provoca una alimentación agresiva donde los humanos podrían verse afectados incrementando el riesgo de transmisión de la enfermedad (Garcia-Rosales et al., 2022). La prevalencia

estimada de E. canis en áreas urbanas es mayor que la obtenida para áreas rurales, un patrón encontrado en estudios previos (Arroyave et al., 2020; Aguiar et al., 2007; Rotondano et al., 2017). Las garrapatas hembra pueden estar poniendo sus huevos en las grietas de las paredes o dentro de las camas de los perros, lo que provoca infestaciones en la vivienda (Telford, 2009; Dantas-Torres, 2010; Muhammad et al., 2008; Dantas-Torres et al., 2011). Así como la exposición a la infestación de garrapatas en las rutinas diarias como paseos por el parque (Dantas-Torres & Otranto, 2014; Jennett et al., 2013; Malik et al., 2018).

La identificación de Rickettsia spp. se ha llevado a cabo mediante la amplificación del 23s ARNr, el gen gltA, la región RRi6 y los genes que codifican las proteínas ompA y ompB (Kato et al., 2013; Oteo & Portillo, 2012). En Ibagué, previamente se realizó un estudio sobre Rickettsia spp en garrapatas aisladas, en el que se determinó que esos hemoparásitos no se encontraban circulando en las garrapatas del municipio (Osorio et al., 2018). Sin embargo, en nuestro estudio el 9,49% de los perros se han infectado con Rickettsia spp. y 2,96% con rickettsias patógenas (SFG y TG), por lo que a conocimiento de los autores este es el primer reporte de detección de Rickettsia spp. en el departamento del Tolima.

En el 2004, en Arizona se halló una seroprevalencia de R. rickettsia del 78% en perros (Nicholson et al., 2006). En China se describió una prevalencia de Rickettsia spp. del 8,1% en perros, entre las especies que identificaron se encuentran R. raoultii, Ca. R. tarasevichiae y R. felis (Shao et al, 2021). De manera similar, en Australia encontraron una frecuencia de R. felis en caninos del 9% (Hii et al., 2011). Mientras que, en otros países se ha estimado una circulación inferior al 6%. En Angola se encontró una prevalencia de rickettsias del SFG en perros del 5,8% (Barradas et al., 2017). En Italia se han reportado diferencias prevalencias de Rickettsia spp. según la región de estudio, para el norte del país fue del 0,4%, para el centro de Italia del 1,4% y en el sur fue del 3,3% (Solano‐Gallego et al., 2008). Finalmente, en Granada se notificó la ausencia de circulación de especies rickettsiales en los perros (Yabsley et al., 2008).

De acuerdo con nuestros datos, se han reportado especies patógenas de Rickettsia en perros de Villeta (R. rickettsii) (Hidalgo et al., 2009), Medellín (R. parkeri) (Arroyave et al., 2020) y Turbo (R. amblyommatis y R. parkeri) (Quintero et al., 2017). Además, la cepa Bosque Atlántico de Rickettsia spp. se encontró en A. ovale de Turbo, Necoclí y Los córdobas (Londoño et al., 2014; Quintero et al., 2017). Adicionalmente, se detectó por PCR la presencia de Ca. R. amblyommii y Candidatus R. asemboensis en pulgas de Villeta (Faccini-Martínez et al., 2016), así como la presencia de R. felis en C. felis aisladas de perros de Caldas (Ramírez-Hernández et al., 2013), lo que hace necesario estudiar las pulgas como vectores de rickettsias patógenas en el departamento del Tolima.

6.2.

Factores de riesgo

La relación entre la enfermedad previa con las lesiones hiperqueratósicas y la presencia de hemoparásitos puede atribuirse al estado inmunitario del huésped (McBride & Walker, 2011). Por otro lado, se determinó que la raza mestiza y las áreas boscosas son factores de riesgo asociados a la infección Rickettsia spp., lo que es acorde a lo encontrado con otros estudios (Abdel-Shafy et al., 2018; Barrett et al., 2014; Durães et al., 2021; McQuiston et al., 2011; Nogueras et al., 2009; Paulino et al., 2018). La positividad asociada a zonas boscosas cerca de la vivienda puede estar denotada por un mayor contacto con R. sanguineus, según lo reporta (Soares et al., 2006)

En el presente estudio, sexo, edad, condición corporal, razas, garrapatas y más perros en la casa no están asociados con la presencia de Rickettsia spp. y E. canis en perros, lo que concuerda con lo informado previamente (Cabrera-Jaramillo et al., 2022; Inokuma et al., 1999; Malik et al., 2018; Silva et al., 2012; Sousa et al., 2010). Sin emabargo, nn reporte previo en Turquía asoció la infección de E. canis en perros con la presencia de garrapatas (Aktas et al., 2015). Sumado a esto, Inokuma et al. (1999) y Mircean et al. (2012) reportaron que la seropositividad a E. canis era ligeramente mayor

en perros que permanecían fuera de la casa, relación no evidenciada en nuestro estudio.

Adicionalmente, diferentes estudios se ha determinado que la edad es un factor asociado con la presencia de estos hemoparásitos en los perros. Algunos de ellos, han encontrado que los perros jovenes poseen una tasa de positividad para Rickettsia spp. y E. canis significativamente mayores que los perros adultos (Rodriguez-Vivas et al., 2005; Shao et al., 2021). Mientras que, otros estudios han asociado una positividad más alta de ambas bacterias en perros adultos, y lo han sustentado en un aumento de exposición a lo largo de la vida del canino (Barrantes-González et al., 2016; Lasta et al., 2013; Pérez-Macchi et al., 2019; Pinter et al., 2008; Trapp et al., 2006; Vieira et al.,

2011).

El buen cuidado y mantenimiento de los perros por parte de los dueños podría ser la razón por la que no existe una correlación significativa entre la presencia de garrapatas y la infección por E. canis o Rickettsia spp. (Malik et al., 2018). Así como la posible situación en la que la garrapata se desprenda esporádicamente del perro tras la alimentación (Malik et al., 2018).

6.3.

Características moleculares

De acuerdo con nuestros resultados, se identificaron los genogrupos US, BR y CR de E. canis en Colombia, Brasil, Venezuela, Perú y Costa Rica (Arroyave et al., 2020; Bouza-Mora et al., 2017; Ferreira et al., 2014; Geiger et al., 2018). En Colombia, el genogrupo US tiene una mayor proporción, seguido de CR y BR, y esto podría deberse a que US es el grupo ancestral (Arroyave et al., 2020; Gallego et al., 2023). Además, las secuencias de E. canis reportadas en nuestro estudio se agruparon en un clado con los genogrupos US, BR y CR, a diferencia de los resultados informados por Bezerra- Santos et al. (2021), donde los tres genogrupos estaban en clados separados, así

como en Tailandia donde los genogrupos de US y BR estaban en clados diferentes (Nambooppha et al., 2018).

GP36 es una proteína inmunorreactiva que se utiliza como marcador molecular para caracterizar los genogrupos de E. canis debido a la alta divergencia en la región de repetición pre-tándem (5'), que en nuestro caso no se utilizó para el diseño del cebador (Kaewmongkol et al., 2020; Nambooppha et al., 2018). Además, las diferencias conformacionales de la proteína GP36 debido a la variación de la región de repetición en tándem en las muestras pueden ser suficientes para tener implicaciones funcionales y antigénicas debido a que su función está relacionada con la evasión inmune, la adhesión y también podría afectar la presentación de la enfermedad (Aktas & Özübek, 2019; da Costa et al., 2019).

En cuanto a la posibilidad de que la dineína se una a GP36, las dineínas son proteínas motoras implicadas en los movimientos citoplasmáticos de Anaplasma phagocytophilum, Orientia tsutsugamushi, Chlamydia trachomatis, Salmonella enterica y Campylobacter jejuni durante la infección y difusión (Cabezas-Cruz et al., 2017; Hu & Kopecko, 1999; Kim et al., 2001; Mital et al., 2015; Ramsden et l., 2007). Además, Cabezas-Cruz (2017) sugiere que las proteínas de unión a dineína interactúan con la dineína del huésped. Actualmente, no existen estudios sobre el papel de la dineína en E. canis, sin embargo, Zweygarth et al. (2014) informaron una variación en la segunda estructura de la proteína GP36 que podría tener una función para evitar la respuesta de degradación de las células huésped y un papel en la transmisión por garrapatas como MSP1 en A. marginale.

7. CONCLUSIÓN

En caninos de Ibagué-Tolima se detectó una alta prevalencia de Ehrlichia canis. Sumado a esto, se encontró la circulación de especies no patógenas de Rickettsia spp., así como especies pertenecientes a los grupos SFG y TG en los caninos. A conocimiento de los autores, este es el primer reporte de Rickettsia spp. en el departamento del Tolima.

Enfermedades previas, razas criollas, lesiones hiperqueratósicas, y vivir cerca a zonas boscosas son factores de riesgo asociados con la presencia de estos hemoparásitos en los caninos de Ibagué-Tolima. Adicionalmente, se requieren más investigaciones sobre el rol de la dineína en el proceso de infección de E. canis, y el posible papel como vector de las pulgas en la transmisión de Rickettsia spp. en el departamento del Tolima.

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26,5

1,97

1,77

-

-

ER_002

35,7

1,53

1,51

-

-

ER_003

23,3

1,53

1,59

-

-

ER_004

278,0

1,94

1,99

3,60

16,40

ER_005

23,7

1,64

1,52

-

-

ER_006

30,8

1,57

1,52

-

-

ER_007

58,4

1,84

1,93

17,12

2,88

ER_008

349,9

1,93

1,83

2,86

17,14

ER_009

30,5

1,60

1,76

-

-

ER_010

389,8

1,93

1,93

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ER_011

32,6

1,88

1,35

-

-

ER_012

185,7

1,94

1,25

5,39

14,61

ER_013

468,6

1,95

2,19

2,13

17,87

ER_014

61,2

1,65

1,07

16,34

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ER_015

94,0

1,89

2,00

10,64

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ER_016

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1,84

1,31

15,06

4,94

ER_017

317,3

1,89

2,30

3,15

16,85

ER_018

142,4

1,92

1,61

7,02

12,98

ER_019

58,0

1,93

1,25

17,24

2,76

ER_020

194,0

1,87

2,06

5,15

14,85

ER_021

184,9

1,89

1,88

5,41

14,59

ER_022

132,8

1,98

1,71

7,53

12,47

ER_023

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1,90

2,07

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1,93

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2,01

17,99

ER_025

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1,93

2,47

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ER_026

1420,4

1,90

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0,70

19,30

ER_027

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1,80

1,71

3,78

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ER_028

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1,49

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ER_029

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1,96

1,69

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17,32

ER_030

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19,01

ER_031

198,8

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ER_032

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15,00

ER_033

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1,90

1,96

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1,91

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177,1

1,94

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1,91

1,82

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10,53

9,47

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2,25

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15,92

ER_050

146,5

1,86

1,81

6,83

13,17

ER_051

170,2

1,90

2,14

5,88

14,12

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125,4

1,89

1,77

7,97

12,03

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50,3

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1,84

19,88

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1,89

1,94

3,24

16,76

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65,0

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37,0

1,67

1,85

-

-

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188,5

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1,72

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167,1

1,35

1,33

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14,02

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124,8

1,47

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291,0

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3,44

16,56

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1572,8

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1,01

0,64

19,36

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426,4

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1,80

2,35

17,65

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265,4

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158,4

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6,31

13,69

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163,9

1,91

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13,90

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172,0

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175,0

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179,8

1,93

2,04

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80,0

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1,74

1,07

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17,52

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82,7

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-

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14,71

ER_262

65,0

2,02

1,42

15,38

4,62

ER_263

278,0

1,67

1,89

3,60

16,40

ER_264

188,5

1,62

1,53

5,31

14,69

ER_265

81,2

1,59

1,72

12,32

7,68

ER_266

188,5

1,23

1,33

5,31

14,69

ER_267

124,8

1,47

1,42

8,01

11,99

ER_268

149,4

2,04

1,75

6,69

13,31

ER_269

274,6

2,01

1,26

3,64

16,36

ER_270

109,2

1,57

1,24

9,16

10,84

ER_271

271,3

2,20

1,47

3,69

16,31

ER_272

4161,0

1,94

1,72

0,24

19,76

ER_273

248,1

1,99

1,89

4,03

15,97

ER_274

496,7

1,93

2,14

2,01

17,99

ER_275

404,1

1,96

1,13

2,47

17,53

ER_276

1420,4

1,90

2,19

0,70

19,30

ER_277

108,7

1,96

1,60

9,20

10,80

ER_278

274,6

1,98

1,26

3,64

16,36

ER_279

50,3

1,44

1,34

19,88

0,12

ER_280

308,7

1,89

1,94

3,24

16,76

ER_281

65,0

1,45

1,42

15,38

4,62

ER_282

172,6

1,67

1,85

5,79

14,21

ER_283

188,5

2,03

1,53

5,31

14,69

ER_284

81,2

1,59

1,72

12,32

7,68

ER_285

167,1

1,35

1,33

5,98

14,02

ER_286

124,8

1,47

1,42

8,01

11,99

ER_287

189,0

1,89

1,63

5,29

14,71

ER_288

165,2

2,01

1,96

6,05

13,95

ER_289

2696,6

2,02

1,96

0,37

19,63

ER_290

232,8

1,57

1,92

4,30

15,70

ER_291

170,4

1,94

1,89

5,87

14,13

ER_292

143,3

1,99

1,68

6,98

13,02

ER_293

26,5

1,97

1,77

-

-

ER_294

35,7

1,23

0,51

-

-

ER_295

23,3

1,53

1,63

-

-

ER_296

317,3

1,89

2,30

3,15

16,85

ER_297

142,4

1,92

1,61

7,02

12,98

ER_298

188,5

2,02

1,25

5,31

14,69

ER_299

194,0

1,87

2,06

5,15

14,85

ER_300

423,3

1,89

1,73

2,36

17,64

ER_301

165,2

2,03

1,81

6,05

13,95

ER_302

271,3

2,20

2,47

3,69

16,31

ER_303

4161,0

1,94

1,68

0,24

19,76

ER_304

696,6

1,89

2,19

1,44

18,56

ER_305

212,0

2,08

1,90

4,72

15,28

ER_306

431,4

1,81

1,63

2,32

17,68

ER_307

189,0

1,99

2,10

5,29

14,71

ER_308

180,7

1,82

1,14

5,53

14,47

ER_309

232,8

1,80

1,37

4,30

15,70

ER_310

347,9

1,89

1,89

2,87

17,13

ER_311

149,4

2,04

0,75

6,69

13,31

ER_312

119,5

1,84

1,47

8,37

11,63

ER_313

319,9

1,92

1,77

3,13

16,87

ER_314

108,9

1,90

1,09

9,18

10,82

ER_315

108,7

1,96

1,60

9,20

10,80

ER_316

274,6

1,89

2,26

3,64

16,36

ER_317

109,2

1,99

2,24

9,16

10,84

ER_318

82,5

1,99

1,84

12,12

7,88

ER_319

107,4

2,01

1,62

9,31

10,69

ER_320

447,8

1,91

1,96

2,23

17,77

ER_321

165,2

2,04

2,80

6,05

13,95

ER_322

50,3

1,44

2,34

19,88

0,12

ER_323

308,7

1,89

1,94

3,24

16,76

ER_324

65,0

1,45

2,42

15,38

4,62

ER_325

37,0

1,67

2,85

-

-

ER_326

189,0

1,62

2,53

5,29

14,71

ER_327

81,2

1,59

1,72

12,32

7,68

ER_328

2696,6

2,02

2,33

0,37

19,63

ER_329

124,8

1,47

2,42

8,01

11,99

ER_330

81,2

1,89

1,72

12,32

7,68

ER_331

81,2

1,59

1,72

12,32

7,68

ER_332

232,8

1,80

1,37

4,30

15,70

ER_333

347,9

1,89

1,89

2,87

17,13

ER_334

149,4

2,04

1,75

6,69

13,31

ER_335

119,5

1,84

1,47

8,37

11,63

ER_336

274,6

1,98

2,26

3,64

16,36

ER_337

109,2

1,57

2,24

9,16

10,84

Anexo 4. Integridad del ADNg extraído a partir de sangre completa de canino. Gel de agarosa al 1%. WM: DNA Molecular Weight Marker 1Kb Ladder (Thermofisher, EE. UU.). A – G: Muestras de ADNg representativas de la extracción.

Anexo 5. Calidad del ADNg extraído a partir de sangre completa de canino. Gel de agarosa al 2%. WM: DNA ladder (New England, BioLabs, EE. UU.). 1 – 56: ER_001 – ER_056. NTC: Control negativo.

Anexo 6. Amplificación de un fragmento del gen gp36 de E. canis a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos. MW: 1 kb Opti-DNA Marker (abm, Canada); 1 – 210: ADNg de muestras ER_001 – ER_210. C+: Control positivo. C-: Control negativo. Agarosa 2%.

Anexo 7. Amplificación de un fragmento del gen gltA de Rickettsia spp. a partir de ADNg extraído de sangre completa de caninos. MP: 1 kb Opti-DNA Marker (abm, Canada); 1 – 71: ADNg de muestras ER_001 – ER_171. Agarosa 2%.