Bacteriología y Laboratorio Clínico · 2019
Identificación de polimorfismo(s) en el gen de la Mieloperoxidasa asociado a infecciones recurrentes por Candida albicans.
La candidiasis es una infección causada por levaduras del género Candida spp. que se presenta de varias formas dependiendo la zona del cuerpo en la que se localice, como la candidiasis bucal y la candidiasis vulvovaginal. Esto ocurre cuando existe un desequilibrio inmunológico entre el huésped y el hongo; por lo tanto, el organismo desencadena un mecanismo de defensa que involucra células como el neutrófilo, quien actúa como principal mediador de la respuesta inmune innata frente a levaduras, dado a que libera sustancias fungicidas como la Mieloperoxidasa (MPO), enzima presente en los gránulos azurófilos. Sin embargo, se han descrito múltiples causas que pueden generar deficiencia o disfunción de esta enzima como la presencia de polimorfismos en el gen que la codifica; por tal motivo, en este estudio se buscó identificar un posible polimorfismo mediante técnicas moleculares y citoquímicas en muestras de pacientes con antecedentes de candidiasis recurrente, logrando estandarizar la técnica de PCR convencional para la amplificación del gen mpo, la secuenciación de la región amplificada y análisis bioinformáticos de los productos de amplificación hallando un cambio en una base nitrogenada (G291T) ubicada en una región no codificante del gen en estudio.
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Contenido
- Resumenp. 11
- Introducciónp. 12
- 2. Objetivosp. 14
- 2.1 Objetivo generalp. 14
- 2.2 Objetivos específicosp. 14
- 3. Marco teóricop. 15
- 3.1 Antecedentesp. 15
- 3.2 Candidiasis generalidadesp. 18
- 3.3 Epidemiologíap. 23
- 3.4 Diagnósticop. 25
- 3.5 Tratamientop. 25
- 3.6 Fisiopatología e inmunidad de Candida albicansp. 26
- 3.7 Los neutrófilosp. 28
- 3.8 Mieloperoxidasap. 29
- 3.9 Deficiencia de MPO y susceptibilidad a infeccionesp. 35
- 3.10 Tipos de polimorfismos genéticosp. 39
- 3.11 Diagnóstico deficiencia de MPOp. 42
- 3.11.1 Técnicas citoquímicasp. 42
- 3.11.2 PCR convencionalp. 43
- 3.11.3 Secuenciación de ADNp. 44
- 4. Metodologíap. 46
- 4.1 Tipo de investigaciónp. 46
- 4.2 Poblaciónp. 84
- 4.3 Muestrap. 55
- 4.4 Recolección de la muestrap. 47
- 4.5 Diseño de primers y análisis Bioinformáticop. 47
- 4.6 Extracción de ADNp. 48
- 4.7 Estandarización PCR convencional para amplificación gen mpop. 49
- 4.7.1 Titulación de ADNp. 49
- 4.7.2 Titulación de MgCl2p. 49
- 4.7.3 Titulación de primersp. 50
- 4.7.4 Temperatura de anillamientop. 51
- 4.8 PCR convencionalp. 43
- 4.9 Purificación de ADNp. 53
- 4.10 Secuenciaciónp. 53
- 4.11 Tinción citoquímica de peroxidasa leucocitariap. 53
- 4.12 Cuadro hemático y FSPp. 54
- 5. Resultadosp. 55
- 5.1 Estandarización PCR convencional para amplificación gen mpop. 55
- 5.1.1 Titulación de ADNp. 49
- 5.1.2 Titulación de MgCl2p. 49
- 5.1.3 Titulación de primersp. 50
- 5.1.4 Temperatura de anillamientop. 51
- 5.1.5 PCR convencionalp. 43
- 5.2 Resultados secuenciaciónp. 62
- 5.2.1 Alineamineto de las secuencias con programa bioinformático BLASTp. 62
- 5.2.1.1 Muestra Nº 1: Paciente con diágnostico candidiasis bucalp. 62
- 5.2.1.2 Muestra Nº 2: Control negativop. 64
- 5.2.1.3 Muestra Nº 3: Paciente con diágnostico candidiasis vaginalp. 66
- secuenciados de candenas complementariasp. 70
- 5.4 Comparación de tinción citoquímica y FSP de las muestras en estudiop. 75
- 6. Discusiónp. 79
- 7. Conclusionesp. 84
- 8. Referenciasp. 85
- 9. Anexosp. 94
- Tabla 6. Titulación de primers …………………………………………………………p. 50
- Tabla 8. Programa perfil térmico para amplificación gen mpo …………………………p. 52
- Tabla 9. Cuantificación ADN obtenido por kit Wizard Genomic DNA purification……p. 56
- Tabla 10. Cuantificación ADN obtenido por kit Wizard Ultra clean blood spin DNA …p. 56
- Tabla 11. Tinción citoquímica para MPO y FSP ……………………………………..…p. 77
- Figura 1. Micrografía electrónica de formas representativas de C. Albicansp. 19
- Figura 2. Descarga vaginal de una mujer con Candidiasis vulvovaginalp. 21
- Figura 3. Presentaciones clínicas de candidiasis bucalp. 22
- Figura 4. Mecanismos de patogenicidad presentes en C. albicans………………………p. 26
- Figura 7. Componentes de reacciones catalizadas por MPO dentro del fagosomap. 32
- Figura 8. Activación sistema antimicrobiano MPO- H2O2-Clp. 33
- Figura 10. Tipos de polimorfismos según su localización en regiones del genp. 40
- Figura 11. Técnicas para identificación de polimorfismosp. 42
- Figura 12. Etapas de amplificación de ADN por medio de la técnica PCRp. 43
- Figura 13. Diluciones seriadas ½, ¼, 1/6 de ADNp. 49
- Figura 14. Programa de ciclaje PCR convencional para amplificación gen mpop. 52
- convencional de titulación de ADNp. 56
- convencional para determinación de concentración adecuada de MgCl2p. 57
- convencional para determinación de concentración adecuada de primersp. 59
- convencional muestras problemas con parámetros finales de estandarizaciónp. 62
- cadena antisentido de muestra 1p. 62
- cadena sentido de muestra 1 ………………………………p. 63
- cadena sentido del control negativop. 64
- antisentido del control negativop. 65
- sentido de la muestra 3p. 66
- antisentido de la muestra 3p. 67
- la MPO de las cadenas complementariasp. 68
- la MPO de cadenas sentidop. 69
- cadenas complementariasp. 70
- Figura 29. Análisis bioinformático para la ubicación de polimorfismos en el gen mpo…p. 73