Bacteriología y Laboratorio Clínico · 2019
Detección de Treponema pallidum subespecie pallidum en muestras clínicas para el diagnóstico de Sífilis congénita mediante la utilizaciòn de variantes de la reacciòn en cadena de la polimerasa en tiempo real
La sífilis es una enfermedad sistémica de transmisión sexual, sanguínea, y vertical (congénita, perinatal y neonatal) causada por la espiroqueta Treponema pallidum subsp pallidum, que se desarrolla en etapas agudas asintomáticas o sintomáticas y puede llegar a producir infecciones crónicas con secuelas y discapacidades considerables si no es detectada y tratada oportunamente. La sífilis congénita es un importante problema de salud pública en Colombia ya que puede conllevar a padecer una condición con consecuencias graves y un alto costo humano, social y económico para los pacientes. En el presente estudio, por medio de variantes de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR tr y PCR tr-sondaTaqman) se evaluó la presencia del gen TpN47 en muestras clínicas para la identificación de Treponema pallidum subsp pallidum para comparar la sensibilidad y especificidad de estas variantes. De 27 muestras procesadas de sangre total periférica y suero de gestantes y neonatos, sangre de cordón umbilical y líquido cefalorraquídeo, el 48,14% arrojaron resultados positivos para la PCR tr y el 81,48% para PCR tr-Taqman en comparación con la técnica serológica VDRL con una especificidad del 100% para ambas variantes. El límite de detección para la PCR tr y PCR tr-Taqman fue de 4,5 fg y 1,135 fg respectivamente. Se puede concluir que el gen TpN47 es una diana molecular promisoria y la variante PCR tr-Taqman es una herramienta valiosa para el diagnóstico de sífilis congénita que minimiza tanto los falsos negativos como positivos de las técnicas serológicas.
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Contenido
- Objetivos específicosp. 18
- ANTECEDENTESp. 19
- MARCO TEÓRICOp. 22
- 1. Generalidades de la Sífilisp. 22
- 1.1 Patogeniap. 22
- 1.2 Sífilis primaria, secundaria y terciariap. 23
- 1.3 Sífilis gestacional y congénitap. 26
- 1.4 Infección fetalp. 27
- 1.4.1. Sífilis Congénita Tempranap. 29
- 1.4.2. Sífilis Congénita Tardíap. 29
- 2. Agente etiológicop. 31
- 2.1 Taxonomíap. 32
- 2.2 Estructurap. 33
- 2.3 Virulencia y Componentes Antigénicosp. 33
- 2.4 Genomap. 34
- 2.4.1 Gen TpN47p. 35
- 3. Inmunologíap. 35
- 3.1 Respuesta Inmunep. 35
- 3.2 Mecanismo de Evasiónp. 36
- 4. Epidemiologíap. 37
- 4.1 Sífilis Congénitap. 38
- 5. Diagnósticop. 40
- 5.1 Pruebas directasp. 41
- 5.2 Pruebas serológicasp. 41
- 5.2.1 Pruebas no treponémicasp. 42
- 5.2.2 Pruebas Treponémicasp. 43
- 5.3 Pruebas Molecularesp. 45
- 5.3.1 Fundamento de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)p. 45
- 5.3.2 PCR en Tiempo Real (PCR tr)p. 45
- 5.3.3 PCR en tiempo real en el diagnóstico de sífilisp. 47
- 6. Tratamiento y Prevenciónp. 48
- METODOLOGÍAp. 50
- 7. Tipo de investigaciónp. 50
- 8. Población de estudiop. 50
- 8.1 Muestrap. 50
- 9. Controlesp. 50
- 9.1 Control Positivop. 50
- 9.2 Control Negativop. 50
- 9.3 Control Exógenop. 50
- 9.4 Control Endógeno de extracciònp. 51
- 9.5 Control Interno de Amplificaciónp. 51
- 10. Muestras Clínicasp. 51
- 11. Extracción de ADNp. 52
- 11.1 Control Positivo y Muestras Clínicasp. 52
- 11.2 ADN Plasmídicop. 52
- 12. PCR Convencionalp. 52
- 12.1 Titulación del ADNp. 53
- 12.2 Titulación de primersp. 54
- 12.3 Ensayo de Sensibilidad en PCR convencionalp. 54
- 13. PCR en Tiempo Real (PCR tr)p. 45
- 13.1 Curva de Calibración para PCR trp. 55
- 13.2 Ensayo de sensibilidad en PCR trp. 56
- 13.3 Ensayo de especificidad en PCR trp. 56
- 14. PCR en Tiempo Real con Sonda Taqman 47 REMA (PCR tr-Taqman)p. 57
- 14.1 Curva de Calibración para PCR tr-Taqmanp. 58
- 14.2 Ensayo de sensibilidad en PCR tr-Taqmanp. 58
- 14.3 Ensayo de especificidad en PCR tr-Taqmanp. 59
- RESULTADOSp. 60
- 15. PCR Convencionalp. 52
- 15.1 Titulación de ADNp. 60
- 15.2 Titulación de los primers TpN47p. 61
- 15.3 Ensayo de sensibilidad por PCR convencionalp. 61
- 16. PCR en Tiempo Real (PCR tr)p. 45
- 16.1 Curva de calibración PCR trp. 62
- 16.2 Ensayo de sensibilidad por PCR trp. 65
- 16.3 Ensayo de especificidad por PCR trp. 65
- 16.3.1 Análisis bioinformático de los primers TpN47p. 67
- 16.4 Controles negativos en PCR trp. 71
- 16.5 Control interno de amplificación en PCR trp. 71
- 17. PCR en Tiempo Real con Sonda Taqman (PCR tr Taqman)p. 72
- 17.1 Curva de Calibración PCR tr Taqmanp. 72
- 17.2 Ensayo de sensibilidad PCR tr-Taqmanp. 74
- 17.3 Ensayo de Especificidad PCR Taqmanp. 74
- 17.3.1 Análisis bioinformático de la sonda Taqman 47 REMAp. 76
- 17.4 Control Negativo en PCR tr-Taqmanp. 79
- 17.5 Control de amplificación en PCR tr-Taqmanp. 79
- 18. Valores de Ctp. 80
- 19. Muestras Clínicasp. 51
- DISCUSIÓNp. 87
- CONCLUSIONESp. 97
- ANEXOSp. 100
- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASp. 111
- Tabla 1: Manifestaciones y secuelas de la sífilis congénitap. 30
- Tabla 2: Cuadro comparativo de las pruebas diagnósticas para sífilisp. 44
- Tabla 3: Tratamiento de la sífilis gestacionalp. 49
- Tabla 4: Número de muestras y su clasificación según origen y tipop. 51
- Tabla 5: Condiciones de amplificación del gen TpN47 por PCR convencionalp. 52
- Tabla 6: Programa de ciclaje del gen TpN47 por PCR convencionalp. 53
- Tabla 7: Características de primers TpN47p. 54
- Tabla 8: Reactivos para la amplificación del gen TpN47 por PCR trp. 55
- Tabla 9: Programa de ciclaje para el gen TpN47 por PCR trp. 55
- Tabla 10: Características de la sonda Taqman 47 REMAp. 57
- Tabla 11: Reactivos para la amplificación del gen TpN47 por PCR tr-Taqmanp. 57
- Tabla 12: Condiciones de amplificaciòn para el gen TpN47 por PCR tr-Taqmanp. 58
- Tabla 13: Resultados de Ct de la curva de calibración por PCR trp. 64
- Tabla 14: Resultados de Ct del ensayo de especificidad con PCR trp. 66
- Tabla 16: Resultados de Ct de la curva de calibración en PCR tr Taqmanp. 73
- Tabla 17: Resultados de Ct del ensayo de especificidad en PCR tr Taqmanp. 75
- Taqman 47 REMAp. 80
- Tabla 19: Comparación de la sensibilidad entre las variantes de PCRp. 80
- Tabla 20: Comparación de especificidad entre las variantes de PCRp. 81
- Tabla 21: Número y porcentaje de muestras positivas por técnicap. 81
- muestrap. 50
- Tabla 25: Condiciones de amplificación para el gen beta actica y TpN47p. 107
- Tabla 26: Programa de ciclaje para el gen beta actinap. 107
- Figura 1: Patogenia de la enfermedadp. 23
- Figura 2: Chancro sifilíticop. 24
- Figura 3: Lesiones de la etapa secundaria de la sífilisp. 25
- epidemiológica 52 de 2017p. 40
- Figura 6: Mecanismo de acción de las sondas de hidrólisisp. 47
- PCR convencionalp. 52
- PCR trp. 72
- PCR tr Taqmanp. 58
- Figura 10: Titulación de ADN de Treponema pallidum subsp pallidump. 60
- Figura 11: Titulación de primers TpN47p. 61
- Figura 12: Ensayo de sensibilidad por PCR convencionalp. 62
- Figura 13: Curva de amplificación del gen TpN47 por PCR trp. 62
- Figura 14: Curva de calibración PCR trp. 63
- Figura 15: Curva melting PCR trp. 64
- Figura 16: Curva melting del ensayo de especificidad por PCR trp. 66
- Figura 17: Análisis bioinformático del Primer Forward TpN47p. 67
- Figura 18: Análisis bioinformático del Primer Reverse TpN47p. 68
- denticolap. 68
- pallidum subsp pertenuep. 69
- burgdorferip. 69
- gonorrhoeaep. 70
- ducreyip. 71
- pallidum subsp pallidump. 72
- Figura 25: Curva de calibración PCR tr Taqman 47 REMAp. 73
- Figura 26: Análisis bioinformático de la Sonda Taqman 47 REMAp. 76
- Treponema denticolap. 68
- Treponema pallidum subsp pertenuep. 69
- Borrelia burgdorferip. 78
- Neiseseria gonorrhoeaep. 78
- Haemophilus ducreyip. 71
- gen TpN47p. 35
- con primers TpN47p. 108