Doctorado en Biociencias · 2014
Identificación y caracterización de la proteína del cuello de las roptrias 5 (RON5) en Plasmodium falciparum y determinación de las regiones de unión a glóbulos rojos humanos
La malaria es una de las enfermedades infecciosas más prevalentes y mortales a nivel mundial. Cinco especies de Plasmodium (protozoario intracelular obligado del filo Apicomplexa) infectan al humano, siendo Plasmodium falciparum la especie responsable de las manifestaciones clínicas más severas, con amplia distribución en las zonas tropicales y subtropicales del África Subsahariana. Según los estimados de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en el año 2010 se presentaron alrededor de 216 millones de casos de malaria y cerca de un millón de muertes, principalmente de niños menores de 5 años. Esta cifra se ha incrementado en los últimos años, luego de la aparición de variantes del parásito que son resistentes a drogas antimaláricas y por la resistencia a los insectidas por parte del mosquito. Es por lo tanto urgente el desarrollo de medidas de control efectivas que permitan la erradicación de esta parasitosis.
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Contenido
- Introducciónp. 15
- Hipótesisp. 17
- Objetivo Generalp. 17
- Objetivos Específicosp. 17
- Marco Teóricop. 18
- La malariap. 18
- Ciclo de vida del Plasmodium en humanosp. 21
- Fase Hepáticap. 21
- Fase en glóbulos rojosp. 24
- 5.2.2.1. Estructura del merozoítop. 24
- 5.2.2.2. Fases de la invasión y proteínas asociadasp. 27
- 5.2.2.3. Complejo AMA-1/RONs en la invasiónp. 32
- Materiales y Métodosp. 37
- Identificación del gen MAL8P1.73 en la cepa FCB-2p. 37
- Búsqueda de genes homólogos y diseño de cebadoresp. 37
- Extracción de ácidos nucleicos de Plasmodium falciparum y síntesis de ADNcp. 41
- Amplificación y clonación del gen MAL8P1.73p. 42
- Determinación de la secuencia y polimorfismo del gen MAL8P1.73p. 45
- Análisis de la secuencia de PfRON5 de la cepa FCB-2p. 46
- Evaluación de la expresión de la proteína PfRON5p. 46
- Selección y síntesis de los péptidos a inocularp. 46
- Obtención de anticuerpos policlonalesp. 47
- Inmunogenicidad de los péptidos inoculadosp. 48
- Reconocimiento de la proteína PfRON5p. 48
- 6.2.4.1. Ensayo de Western blotp. 48
- 6.2.4.2. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)p. 49
- Localización subcelular de la proteína PfRON5p. 50
- 6.2.5.1. Inmunomicroscopía electrónicap. 50
- Obtención de las proteínas rPfRON5F1 y rPfRON5F4p. 51
- Unión de rPfRON5F1 y rPfRON5F4 a GRhp. 53
- Antigenicidad de la proteína rPfRON5F1p. 53
- Regiones de PfRON5 que se unen a glóbulos rojos humanosp. 54
- Síntesis y marcación de los péptidos con Na125Ip. 54
- Ensayos de unión y saturaciónp. 55
- Ensayos de unión con GRh tratados enzimáticamentep. 55
- Determinación de residuos críticos en la uniónp. 56
- Estructura secundaria de los HABPs de la proteína PfRON5p. 56
- Inhibición de la Invasiónp. 56
- Resultados y discusiónp. 57
- Obtención del ADN parasitario y amplificación del gen MAL8P1.73p. 57
- Estudio de la transcripción del gen que codifica para PfRON5p. 57
- Amplificación del ADN copia del gen MAL8P1.73p. 57
- Clonaciónp. 58
- Determinación de la secuencia y polimorfismo del gen MAL8P1.73p. 45
- Análisis de la secuencia de PfRON5 de la cepa FCB-2p. 46
- Evaluación de la expresión de la proteína PfRON5p. 46
- Obtención de anticuerpos anti-PfRON5p. 64
- Detección de la proteína PfRON5 en lisado de P. falciparump. 64
- Localización subcelular de PfRON5p. 65
- Unión de las proteínas recombinantes rPfRON5F1 y rPfRON5F4 a GR humanosp. 67
- Péptidos sintéticos derivados de PfRON5 se unen a GR humanosp. 70
- La unión de los HABPs es saturablep. 72
- La unión de los HABPs es sensible al tratamiento enzimáticop. 74
- Residuos críticos en la interacción HABP-GRhp. 76
- Estructura secundaria de los HABPs de la proteína PfRON5p. 56
- HABPs de PfRON5 inhiben in vitro la invasión de merozoítos a GRhp. 79
- Conclusionesp. 81
- Perspectivasp. 82
- Bibliografíap. 83
- Aspectos éticosp. 94
- Anexosp. 95
- Publicacionesp. 99