DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS · 2025
Evaluación del efecto de la proteina GP63 sobre linfocitos B humanos (Ramos RA-1) y células mononucleares de sangre periférica
La proteína GP63 es una metaloproteasa presente en la membrana de parásitos del género Leishmania spp., que le permite evadir la respuesta inmune del hospedero. Esta proteína modula diversas moléculas del sistema inmune, incluyendo el C3b del complemento, el correceptor CD4 en linfocitos T, mTOR, caspasas, algunas MAPK quinasas y factores de transcripción como NFκB. Su capacidad para modular múltiples rutas inmunológicas fue lo que permitió considerarla una posible herramienta para modular blancos inmunológicos relevantes en linfocitos B (LB). Inspirados por los avances recientes en el desarrollo de proteínas recombinantes y la transferencia dirigida de proteínas o material genético con fines terapéuticos; se desarrolló un sistema de expresión constitutiva de la proteína GP63 y la producción de la proteína recombinante. Estos modelos, permitieron evaluar los efectos de GP63 en la supervivencia, proliferación, activación y diferenciación de LB humanos. Observamos que la exposición a GP63 recombinante, inducía la expresión de CD38, mientras que su expresión intracelular generaba el aumento de CD11b. En conjunto, estos cambios sugieren que la vía de dosificación de la proteína tiene un impacto en el fenotipo del LB, en especial hacia un perfil más regulador que activador. Mediante esta aproximación biotecnológica, buscamos aportar evidencia crítica sobre la aplicación de este tipo de proteínas como agentes terapéuticos. El enfoque de este trabajo es innovador, ya que se aleja del paradigma tradicional que considera a GP63 exclusivamente como un factor de virulencia o un blanco terapéutico, proponiendo en cambio su aprovechamiento como una molécula inmunomoduladora, con potencial bioactivo, en contextos terapéuticos que puedan ser aplicados en el futuro, para el tratamiento de enfermedades inmunomediadas.
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Contenido
- 1.0 INTRODUCCIÓNp. 17
- 2.0 MARCO TEÓRICO GENERALp. 21
- 2.1 Metaloproteasa GP63 / Leishmanolysinp. 21
- 2.2 Centro activo y coordinación del Zincp. 21
- 2.3 Mecanismo de corte o clivaje proteolíticop. 24
- 3.0 OBJETIVOSp. 30
- 3.1 Objetivo Generalp. 30
- 3.2 Objetivo Específicosp. 30
- 4.0 DISEÑO METODOLÓGICOp. 32
- 4.1 Diseño del estudiop. 32
- 4.2 Población de estudio y Consideraciones Éticasp. 33
- 4.3 Manejo de datos estadísticosp. 34
- 5.0 CAPÍTULO 1p. 39
- 5.1 MARCO TEÓRICOp. 39
- 5.1.1 Docking molecularp. 39
- 5.1.2 Dinámica molecularp. 40
- 5.2 MATERIALES Y MÉTODOSp. 41
- 5.2.1 Identificación bioinformática de GP63 y proteínas dianap. 41
- 5.2.2 Análisis de Docking Molecularp. 42
- 5.2.3 Análisis de Dinámica molecularp. 43
- 5.3 RESULTADOS CAPÍTULO 1p. 46
- activación de linfocitos B humanosp. 46
- 5.4 DISCUSIÓN CAPÍTULO 1p. 55
- 5.5 Resumen de los hallazgos:p. 60
- 6.0 CAPÍTULO 2p. 61
- 6.1 MARCO TEÓRICOp. 39
- 6.1.1 Producción de proteínas recombinantesp. 61
- 6.1.2 Células CHO y Células HEKp. 61
- 6.1.3 Células primarias y su susceptibilidad a transfección/transducciónp. 62
- 6.1.4 Terapia génica con lentivirusp. 64
- 6.1.5 Tipos de lentivirus y pseudotificadop. 64
- 6.2 MATERIALES Y MÉTODOSp. 41
- 6.2.1 Cultivo de líneas celulares humanasp. 67
- 6.2.2 Producción de la proteína GP63 recombinantep. 69
- CRL-11268™p. 71
- 6.2.4 Sistema de expresión constitutiva de la proteína GP63p. 75
- 6.3 RESULTADOS CAPÍTULO 2.0p. 77
- 6.3.1 Producción de la proteína recombinante GP63 WT/mtp. 77
- 6.3.2 Producción del lentivirus LV-MND-GP63 WT/mtp. 89
- 6.4 DISCUSIÓN CAPÍTULO 2p. 91
- 6.5 Resumen de Hallazgos:p. 95
- 7.0 CAPÍTULO 3p. 96
- 7.1 MARCO TEÓRICOp. 39
- 7.1.1 Activación de los Linfocitos B (LB)p. 96
- 7.2 MATERIALES Y MÉTODOSp. 41
- 7.2.3 Análisis de viabilidadp. 107
- 7.2.4 Determinación de proliferaciónp. 108
- citometría de flujop. 109
- 7.2.6 Ensayos de cuantificación molecularp. 112
- 7.2.7 Activación de LB Ramos in vitrop. 113
- GFPp. 114
- number VCN)p. 114
- 7.3 RESULTADOS CAPÍTULO 3p. 116
- MNSP humanosp. 116
- MND-GP63) Parte 1p. 131
- MND-GP63) Parte 2p. 154
- 7.4 DISCUSIÓN CAPÍTULO 3p. 177
- 7.5 Resumen de los hallazgos:p. 60
- 8.0 CONCLUSIONES GENERALESp. 192
- 9.0 LIMITACIONES Y PERSPECTIVASp. 193
- 10. BIBLIOGRAFIAp. 194
- 11. ANEXOSp. 215
- Figura 1 Estructura de la proteína y el centro activo de GP63p. 23
- Figura 2 Descripción del efecto proteolítico de GP63p. 25
- Figura 3 Estrategia experimental objetivo 1.0p. 36
- Figura 4 Estrategia experimental objetivo 2.0p. 37
- Figura 5 Estrategia experimental objetivo 3p. 38
- Figura 6 Docking molecular de la interacción entre GP63 y Sykp. 49
- Figura 7 PDBSum análisis del modelo 5.1 interfase GP63:Sykp. 50
- Figura 8 Representación del complejo GP63:Syk nativa (WT) y mutante (mt)p. 53
- Figura 9 Interacciones polares y no polares complejo GP63:Sykp. 54
- Figura 10 Partes de un lentivirusp. 65
- Figura 11 Generaciones y genes de un lentivirusp. 66
- Figura 12 SDS-PAGE y Western Blot: Limitaciones técnicas en células CHOp. 79
- Figura 13 Representación construcción del plásmido para expresión de GP63p. 82
- Figura 14 Transfección de las líneas celulares THP-1, LT Jurkat y LB Ramosp. 84
- Figura 15 Las células HEK293T producen GP63 recombinante (48h)p. 87
- Figura 16 La concentración de GP63 recombinantep. 88
- Figura 17 La viabilidad de los LB disminuye de forma dosis dependientep. 118
- Figura 18 La proliferación de los LB disminuye con la exposición a GP63p. 119
- Figura 19 Marcadores celulares de LB Ramos moduladosp. 122
- Figura 20 Cinética de expresión de marcadores en MNSPp. 123
- Figura 21 Concentración de TNF e IgM en LB Ramos y MNSPp. 125
- Figura 22 Perfil de activación LB Ramos estimulados con LPS,PMA,CpGp. 128
- Figura 23 Detección de TNF en linfocitos B Ramos activadosp. 129
- Figura 24 Detección de TNF e IL-10 intracelular en LB Ramos activadosp. 130
- Figura 25 La viabilidad celular de los LB Ramos disminuye por efecto del LVp. 133
- Figura 26 Clasificación de tipo de muerte celular en LB Ramos transducidosp. 135
- Figura 27 Evaluación morfológica de cultivos de LB Ramos transducidosp. 136
- Figura 28 Comparación del VCN en los LB Ramos transducidosp. 138
- Figura 29 Porcentaje de GFP en LB Ramos transducidosp. 140
- Figura 30 Microscopia de luz y fluorescencia LB Ramos transducidos GFP+p. 141
- MOI-dependientep. 144
- MOIp. 146
- Figura 34 Concentración de IgM en LB Ramos transducidosp. 147
- Figura 37 Muerte celular por apoptosis de los LB Ramos transducidosp. 155
- transducidosp. 138
- transducidosp. 138
- a un MOI de 0.5p. 160
- a un MOI de 0.5p. 161
- GP63p. 48
- Figura 43 GP63 promueve un fenotipo no convencionalp. 167
- LB Ramos transducidos sin restauración con la activación clásicap. 168
- Figura 45 GP63 altera la distribución de subpoblaciones en MNSPp. 171
- distribución de subpoblaciones ni en la viabilidad celularp. 172
- Figura 47 MNSP transducidos presentan producción sostenida de TNFp. 173
- de MNSP transducidosp. 175
- en MNSPp. 176
- Figura 50 Docking molecular entre GP63 vs CXCL10p. 222
- Zinc, en Haddockp. 225
- Programa W-001p. 233
- Figura 55 Análisis de enriquecimiento funcional por GP63 en LBp. 238
- Tabla 1 Colección de moléculas hidrolizadas por GP63p. 26
- Tabla 2 Secuencias PDB de cristales analizadosp. 45
- Tabla 3 Resultados de puntajes y energíasp. 47
- Tabla 4 Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantesp. 63
- Tabla 5 Plásmidos para la expresión de GP63 (Addgene)p. 70
- Tabla 6 Resumen de la descripción funcional de las moléculasp. 103
- Tabla 7 Anticuerpos para la detección de marcadores por citometría de flujop. 111
- Tabla 8 Ensayos inmuno enzimáticos ELISA para cuantificaciónp. 113
- ANEXO 4 Secuenciación del plásmido de Addgene D5_Ld_280600……...…p. 226