EFECTO DE LA MURAMIDASA Y BACILLUS SUBTILIS SOBRE
LA HISTOMORFOMETRIA INTESTINAL, EXPRESIÓN DE
PROTEINAS DE UNIÓN ESTRECHA E INMUNOGLOBULINAS EN
POLLOS DE ENGORDE DE 21 Y 42 DÍAS
Mariana Cardenas Cardona
Universidad de Ciencias Ambientales y Aplicadas Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia Bogotá D.C, Colombia Marzo, 2026
EFECTO DE LA MURAMIDASA Y BACILLUS SUBTILIS SOBRE
LA HISTOMORFOMETRIA INTESTINAL, EXPRESIÓN DE
PROTEINAS DE UNIÓN ESTRECHA E INMUNOGLOBULINAS
EN POLLOS DE ENGORDE DE 21 Y 42 DÍAS
Mariana Cardenas Cardona
Trabajo presentado como requisito para optar al título de: Médico Veterinario Zootecnista
Director (a):
Edicson Mauricio Rincón S.
Msc.
Codirector (a):
Carlos Felipe Duque Ramirez Msc.
Línea de Investigación:
Salud Humana y Animal Grupo de Investigación: Ciencia Animal Semillero de estudio investigación en nutrición
Universidad de Ciencias Ambientales y Aplicadas Facultad de Ciencias Agropecuarias Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia Bogotá D.C, Colombia
2026
Nota de aceptación:
Aprobado por el Comité de Programa en cumplimiento de los requisitos exigidos por el Acuerdo Superior N° 11 de 2017 y Acuerdo Académico N° 41 de 2017 para optar al título de (Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia)
Jurado
Jurado
Bogotá, __20__ de _03__de ___2026_____
Dedicatoria
A mi familia
Por haber estado mi lado en cada uno de los buenos y malos momentos dándome el apoyo, esperanza y ganas de continuar con mis sueños; también a Atenea que desde el cielo me sigue cuidando.
XI Contenido
V
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, agradezco a Dios por haberme brindado la vida, la salud y la perseverancia necesarias para culminar esta este proyecto tan importante en mi vida profesional.
Expreso mi más profunda gratitud a el codirector de esta investigación el profesor Carlos Felipe Duque Ramirez la persona que estuvo en cada paso de esta investigación, por medio de su acompañamiento, su tiempo, su dedicación y sus conocimientos, al ser un pilar fundamental el este proceso de investigación y en mi crecimiento profesional a lo largo de estos años.
A la universidad de ciencias aplicadas y ambientales por ser la institución que me desarrollo como profesional y como persona, por prestar sus instalaciones y brindarme acompañamiento por parte de personas dedicadas que potenciaron mis conocimientos. También agradezco a la empresa Tekzol SAS por financiar el proyecto, facilitando cada uno de los recursos, implementos y herramientas utilizadas para el desarrollo de esta investigación.
Finalmente, quiero dar las gracias a mi familia que ha sido el apoyo más grande en cada uno de mis pasos, por su paciencia, amor y participación en las buenas y en las malas.
Muchas gracias a todos.
VI Resumen
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la muramidasa y el probiótico Bacillus subtilis, en la salud intestinal en pollos de engorde de 21 y 42 días, evaluando parametros como la histomorfología intestinal, inmunohistoquímica y pruebas de bioquímica sanguínea. Este experimento se llevó a cabo en la Unidad Experimental Avícola de Tekzol S.A.S., ubicada en el municipio de Papayal, Valle del Cauca, Colombia. El estudio se realizó con aves Cobb 500, de un día de edad (50% machos y 50% hembras); distribuidos en 3 tratamientos: CN (Control negativo), con -60 kcal/kg de energía metabolizable y -1%; MUR (Muramidasa) 50 ppm; Bacillus subtilis 200 ppm. A los 21 y 42 días de edad de las aves, estas fueron sacrificadas aleatoriamente (dos aves por réplica), se obtuvieron segmentos de
2 cm de yeyuno e íleon, los cuales se procesaron histológicamente. Los datos obtenidos
fueron analizados a través del programa estadístico SAS 9.4. Frente a los valores obtenidos en la histomorfometria se puede indicar que la adición de Bacillus subtilis y muramidasa, estabiliza la microbiota intestinal, promoviendo a el crecimiento del largo de vellosidades y disminución en profundidad de criptas. En cuanto a la expresión de inmunoglobulinas se observó un aumento en la IgY del yeyuno en machos de 21 días del grupo tratado con control negativo. En la inmunohistoquímica se observó diferencia significativa en yeyuno de machos de 21 días tratados con control negativo, donde la ocludina presento expresión fuerte; dando como resultado que el control negativo, puede generar una respuesta adaptativa en el epitelio a estímulos negativos en comparación con otro tratamiento ya sea con probióticos o enzimas digestivas, ya que, en este caso los aditivos pueden robustecer la mucosa y disminuir la inflamación.
Palabras Claves: Muramidasa, Bacillus subtilis, control negativo, Histomorfométria, Inmunohistoquímica, Inmunoglobulinas, salud intestinal en pollos.
VI Abstract
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of muramidase and probiotic Bacillus subtilis on intestinal health in chickens aged 21 and 42 days, evaluating parameters such as gut histomorphology, immunohistochemistry and blood biochemistry tests. This experiment was carried out at the Experimental Poultry Unit of Tekzol S.A.S., located in the municipality of Papayal, Valle del Cauca, Colombia. The study was conducted with oneday-old Cobb 500 birds (50% males and 50% females); distributed in 3 treatments: CN (negative control), with -60 kcal/kg of metabolizable energy and -1%; MUR (muramidase) 50 ppm; Bacillus subtilis 200 ppm. At the birds' 21 and 42 days of age, they were randomly slaughtered (two birds per replica), segments of 2 cm of yeon and ileum, which were histologically processed. The data obtained were analyzed using the SAS 9.4 statistical program. Compared to the values obtained in histomorphometry, it can be indicated that the addition of Bacillus subtilis and muramidase stabilizes the intestinal microbiota, promoting the growth of vellosity length and decrease in depth of crypts. As for the expression of immunoglobulins, an increase in the IgY of the jejunum was observed in 21-day males of the group treated with a negative control. In immunohistochemistry, a significant difference was observed in jejunum of 21-day males treated with negative control, where ocludine presented strong expression; resulting in the negative control, can generate an adaptive response in the epithelium to negative stimuli compared to other treatment with either probiotics or digestive enzymes, since in this case the additives can strengthen the mucosa and decrease inflammation.
Key words: Muramidase, Bacillus subtilis, negative control, Histomorphometry, Immunohistochemistry, Immunoglobulins, intestinal health in chickens.
VII
Contenido
CONTENIDO
Pag.
RESUMEN......................................................................................................................... VI CONTENIDO ................................................................................................................. VIII LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... VI LISTA DE TABLAS ......................................................................................................... VI LISTA DE SÍMBOLOS Y/O GLOSARIO ........................................................................7
1.
OBJETIVOS ...............................................................................................................12 1.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................12 1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................................................12
2.
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................13 2.1. Ubicación experimental y consideraciones éticas ....................................................13 2.2. Animales, instalaciones y manejo ..............................................................................13 2.3. Programa de alimentación .........................................................................................14 2.4. Tratamientos experimentales ....................................................................................14 2.5. Sacrificio de animales y obtención de muestras .......................................................15 2.6. Procesamiento histológico ..........................................................................................15 2.7. Obtención y análisis de resultados ............................................................................15 Histomorfométria ...............................................................................................................15 Inmunohistoquímica ..........................................................................................................16 Inmunoglobulinas ..............................................................................................................17 2.8. Análisis estadístico ......................................................................................................17
3.
RESULTADOS ...........................................................................................................18 3.1. Histomorfométria .......................................................................................................18
3.1.1.
Hembras de 21 días de edad ...............................................................................18
3.1.2.
Hembras de 42 días de edad ...............................................................................19
3.1.3.
Machos de 21 días de edad. ................................................................................21
XI Contenido
VIII
3.1.4.
Machos de 42 días de edad .................................................................................22 3.2. Inmunoglobulinas .......................................................................................................24 3.3. Inmunohistoquímica ...................................................................................................26
3.3.1.
Hembras ...............................................................................................................26
3.3.2.
Machos ..................................................................................................................33
4.
DISCUSIÓN ................................................................................................................49
5.
CONCLUSIONES ......................................................................................................49
6.
RECOMENDACIONES ............................................................................................49
7.
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................51
IX Contenido
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representación de colorimetría en base a reacción inmunohistoquímica en cuanto a proteinas de union estrecha. ............................................................................................. 26 Figura 2. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; hembras; 21 días de edad. ................................................................ 27 Figura 3. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; hembras; 21 días de edad. ..................................................................... 28 Figura 4. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; hembras; 42 días de edad. ................................................................ 29 Figura 5. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; hembras; 42 días de edad. ..................................................................... 30 Figura 6. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; machos; 21 días de edad. .................................................................. 34 Figura 7. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; Machos; 21 días de edad. ...................................................................... 35 Figura 8. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; machos; 42 días de edad. .................................................................. 36 Figura 9. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; machos; 42 días de edad. ...................................................................... 37
X Contenido
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. composición de las dietas experimentales ........................................................... 14
Tabla 2. Tabla de referencias para categorización de coloración en inmunohistoquímica según Cizkova et al., (2021). .............................................................................................. 16
Tabla 3. Media y desviación estándar (±) con relación a el tamaño histomorfométrico de vellosidades y criptas (largo y ancho) de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad. ...................................................................................................... 20
Tabla 4. Media y desviación estándar (±) con relación a el tamaño histomorfométrico de vellosidades y criptas (largo y ancho) de yeyuno e íleon, con los tratamientos en machos de 21 y 42 días de edad. ...................................................................................................... 23
Tabla 5. Media y desviación estándar (±) en relación con la expresión de inmunoglobulinas de los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad....................... 25
Tabla 6. Media y desviación estándar (±) en relación con la expresión de inmunoglobulinas de los tratamientos en machos de 21 y 42 días de edad. ....................... 25
Tabla 7. Media y desviación estándar (±) con relación a la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad. ................... 31
Tabla 8. Categorización de la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad. .............................................................. 32
Tabla 9. Media y desviación estándar (±) con relación a la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon en machos de 21 y 42 días. .................................................................... 49
Tabla 10. Categorización de la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos de machos de 21 y 42 días.............................................................................. 49
Introducción
7
LISTA DE SÍMBOLOS Y/O GLOSARIO
Símbolo Significado
AC Ancho de Cripta AV Ancho de vellosidad CN control negativo
DAB
cromógeno 3,3'-Diaminobenzidine
HRP
enzima peroxidasa de rábano picante
IGA
Inmunoglobulina A
IGM
Inmunoglobulina M
IGY
Inmunoglobulina Y
IHQ
Inmunohistoquímica IH Íleon hembra IM Íleon macho LC Largo de Cripta LV Largo de vellosidad
MUR
Muramidasa
RAM
La resistencia antimicrobiana
TGI
Tracto gastrointestinal TJ uniones estrechas YH yeyuno hembra YM yeyuno macho ZO Zona de oclusión
Introducción
8
INTRODUCCIÓN
La población microbiana del tracto gastrointestinal (TGI) es un recurso natural que se puede desarrollar y utilizar para reducir el impacto de las bacterias patógenas que afectan la salud animal, el desempeño y la seguridad alimenticia (Callaway et al., 2008). La microbiota intestinal posee un enorme potencial metabólico y genera variaciones en la salud intestinal del huésped (Rinttilä & Apajalahti, 2013). El equilibrio de la población intestinal se hace relevante, ya que, hay gran variedad de especies de bacterias, que pueden afectar o beneficiar al organismo, dependiendo la cantidad y susceptibilidad del huésped, lo cual es un vínculo entre la microbiota y la salud intestinal de las aves (Larsen et al., 2021).
El sistema gastrointestinal también posee una gran importancia al ser regulador y protector frente a la entrada de diferentes sustancias al organismo, el epitelio intestinal posee mecanismos y unidades especializadas como los enterocitos, las células caliciformes y las células de Paneth, que se hacen necesarias en el combate contra microrganismos patógenos. El intestino, estructuralmente posee diferentes componentes como lo es el borde intestinal, este es relevante por dos estructuras específicas, que son las vellosidades y criptas (Gassler, 2017). Las vellosidades brindan un área elongada para la absorción de nutrientes (Uni et al, 1998) y las criptas intestinales poseen células especializadas, las cuales participan en la defensa antimicrobiana y en la regulación del nicho de células madre, favoreciendo la proliferación y regeneración de células epiteliales, incluidas las células absorbentes y secretoras (Gassler, 2017). Para que el intestino tenga la capacidad de cumplir las funciones, estas estructuras continuamente se reemplazan desencadenando así regeneración y constante recambio celular (Sancho et al., 2003).
También se ha mencionado que la funcionalidad de la barrera intestinal depende de la interacción de las células, por ejemplo, los enterocitos poseen la capacidad de regular la
entrada de sustancias a través de sus componentes intracelulares (vía transcelular) o a través
Introducción
9
de uniones estrechas (vía paracelular) (Fasulo, 2014), estas uniones estrechas (TJ) son bandas angostas que rodean la zona superior, apical o el espacio lateral de las células epiteliales que generan puntos de fusión (Gasbarrini & Montalto, 1999: Roussel, et al., 2015), están formadas por proteínas específicas, generando áreas altamente dinámicas y permeables, regulando el movimiento transepitelial pasivo de las moléculas que puede ser modificado en respuesta a estímulos tanto externos como intracelulares (Liang & Weber, 2014), con el fin de generar una cerradura hermética frente a diferentes agentes, desempeñando una labor en la vía paracelular, al favorecer el transporte unidireccional a través de los epitelios, al mitigar el movimiento de las proteínas entre las membranas apical
y basolateral, generando así equilibrio y manteniendo adecuadamente delimitado el medio
externo del interno (Arenas-Bazán, 2017).
Un desbalance en los factores anteriormente nombrados puede producir enfermedades intestinales y pérdidas económicas para el productor, derivadas de la patogenicidad y mortalidad (Revidatti et al., 2001; Olaya et al., 2010; Angulo et al., 2004; Larsen et al., 2021), ya que, en condiciones normales, la microbiota intestinal y el epitelio regulan los microorganismos patógenos, disminuyendo la acción de células del sistema inmunológico; si hay inmunosupresión o desequilibrio de la microbiota en el intestino, las células inmunitarias pueden inducir daño a las células epiteliales (Barbara et al., 2021), provocando así alteraciones en una o más de estas funciones de secreción y absorción en el intestino, que pueden conllevar a enfermedades inflamatorias e infecciosas a nivel sistémico (Wallaeys et al., 2023; Larsen et al., 2021; Barbara et al., 2021).
Otra de las problemáticas relevantes en la actualidad es la baja eficacia de los antibióticos y consecuentemente el riesgo de la trasmisión de bacterias resistentes a través de productos animales (Hinton, 1988; Van Boeckel et al., 2015; García et al., 2022). La resistencia antimicrobiana (RAM), es planteada como una gran amenaza frente a la salud humana y animal, ya que, se describe como la capacidad de los agentes patógenos para mutar e inhibir mecanismo de acción de los antibióticos (Baque et al., 2021; Cuccato et al., 2022). Las causas que pueden generar resistencia son la subdosificación, la administración en enfermedades no
Introducción
10
bacterianas, no respetar los tiempos de retiro y el uso con fines profilácticos (García et al.,
2022).
En búsqueda de alternativas para evitar el uso de antibióticos y mejorar la salud intestinal en la producción avícola se han desarrollado investigaciones frente a la utilización de otros métodos alternativos para maximizar el rendimiento (Iñiguez-Heredia et al., 2021; Amer et al., 2023; Aliakbarpour et al.,2012). Algunas de las soluciones potenciales para minimizar el uso de antibióticos como promotores son: i) los probióticos, ii) compuestos químicos no tradicionales, iii) bacteriófagos, iv) ácidos orgánicos, extractos de plantas y aceites esenciales, v) enzimas digestivas (Tellez et al., 2012). Se ha planteado que estos aditivos pueden llegar a ser sustitutos de los antibióticos en la industria avícola, ya que, favorecen a el crecimiento de microbiota benéfica, aumentan la superficie de absorción y ayudan a la salud intestinal (Gong et al., 2017; Khan et al., 2020; Śliżewska et al., 2020). Sin embargo, la cantidad de estudios frente los efectos de estos aditivos aún son escasos (Amer et al., 2023; Naeem & Bourassa, 2025).
En este contexto, la industria avícola enfrenta el reto de promover, innovar y aplicar estrategias que fortalezcan el bienestar y la inmunocompetencia de las aves, con el fin de mejorar indicadores productivos como el rendimiento, la ganancia de peso, la conversión alimenticia y la reducción de la mortalidad, todos ellos estrechamente relacionados con la nutrición, el manejo y las condiciones ambientales (Marín et al., 2004). Desde el punto de vista nutricional, se busca optimizar estos parámetros mediante la inclusión de suplementos, con el fin de identificar, minimizar y mitigar los problemas asociados a la salud intestinal, evitando al mismo tiempo el uso de antibióticos como promotores de crecimiento (Kurukulasuriya, 2017).
Dentro de las alternativas ya mencionadas, se encuentran los probióticos y las enzimas digestivas, que cada vez poseen más relevancia en la suplementación de animales (Tellez et al., 2012); Estos aditivos han sido ampliamente estudiados y utilizados con el fin de evitar el uso de antibióticos promotores de crecimiento. Uno de los probióticos usados en la avicultura
Introducción
11
es el Bacillus subtilis, una bacteria Gram positiva, aerobia facultativa, formadora de esporas, perteneciente al grupo de los bacilos, grupo que se caracteriza por su capacidad de formar endosporas altamente resistentes a condiciones ambientales (Chen et al., 2025). Esta cualidad sirve para la resistencia a el pH estómacal, las sales biliares y las enzimas digestivas, cuando hace el paso por el TGI (Phan et al., 2025), una vez en el intestino, el B. subtilis es capaz de multiplicarse y colonizar el intestino. El Bacillus subtilis actúa en mayor proporción frente a la modulación de la microbiota, competencia con bacterias patógenas y leve estimulación del sistema inmune (Ma et al., 2018; Śliżewska et al., 2020; Khan et al., 2020). En cuanto enzimas digestivas la muramidasa (lisozima), es una enzima del sistema inmune que actúa degradando componentes estructurales de la pared celular bacteriana (Amer et al., 2023). Ejerce un efecto al ser capaz de degradar fragmentos de peptidoglicano bacteriano, disminuyendo estímulos inflamatorios y mejorando el ambiente intestinal (Molina et al, 2022; Frederiksen et al., 2021).
Se plantea que, aunque se han realizado trabajos tanto de los efectos de probióticos como el Bacillus subtilis y de enzimas como la muramidasa, donde se han demostrado efectos positivos sobre la salud intestinal Chen et al., 2025; Goes et al., 2022), se hace necesario comparar y determinar cuál tratamiento ejerce mayor impacto sobre la integridad del epitelio, la respuesta inmunológica y la reducción de posibles enfermedades entéricas, ya que al poseer mecanismos de acción diferentes la interacción con el huésped genera diferentes resultados (Mou et al., 2016; Amer et al., 2023).
Por esta razón, este trabajo busca evaluar alternativas eficientes para disminuir el uso de antibióticos en la producción aviar, por medio de la evaluación de tratamientos con suplementos como el Bacillus subtilis y la muramidasa sobre la salud intestinal de pollos de engorde, evaluando parámetros de histomorfología intestinal, inmunohistoquímica y bioquímica sanguínea, a los 21 y 42 días de edad de pollos de engorde.
Objetivos
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1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la muramidasa y el probiótico Bacillus subtilis, sobre la salud intestinal en pollos de engorde de 21 y 42 días mediante variables como la histomorfología intestinal, inmunohistoquímica y pruebas de bioquímica sanguínea.
1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Correlacionar los efectos de la muramidasa y el probiótico Bacillus subtilis en los parámetros histomorfométricos.
• Determinar el efecto de la muramidasa y el Bacillus subtilis en la expresión de proteínas de unión estrecha por medio de inmunohistoquímica. • Evaluar el efecto de la muramidasa y el Bacillus subtilis en la respuesta de inmunoglobulinas.
Materiales y métodos
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2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Ubicación experimental y consideraciones éticas
El experimento se llevó a cabo en la Unidad Experimental Avícola de Tekzol S.A.S., ubicada en el municipio de Papayal, Valle del Cauca, Colombia (3°31'48'' N y 76°81'13'' O), a una altitud de 1.000 m s. n. m., con una temperatura promedio de 26 °C y una humedad relativa del 79%. El manejo de las aves se desarrolló bajo los principios éticos de la experimentación animal, cumpliendo con las normativas nacionales e internacionales de bienestar animal. Todos los procedimientos fueron previamente aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (UDCA).
El experimento se llevó a cabo en corrales de piso en la Unidad Experimental Avícola de Tekzol SAS ubicada en Palmira (Departamento del Valle del Cauca, Colombia). Se alojaron 12 pollos/m²
2.2. Animales, instalaciones y manejo
Se utilizaron 528 en una proporción 50%-50% pollos de engorde machos y hembras de la línea genética Cobb 500, distribuidos aleatoriamente en grupos de 25 en cada uno de los tratamientos, cada uno con un número equivalente de aves (cada tratamiento conto con siete réplicas independientes). Estos especímenes se criaron en un lugar limpio y desinfectado después de un vaciado sanitario adecuado antes del inicio de la prueba, utilizando una capa de 10 a 15 cm de viruta de madera nueva, posteriormente, las instalaciones se sometieron previamente a un vacío sanitario riguroso, seguido de limpieza y desinfección con amoníaco cuaternario y glutaraldehído.
Los pollos se mantuvieron en condiciones ambientales controladas, con comederos idénticos, todos del mismo tipo, tamaño, color. Cada comedero se identificó con un marcador de color que indicaba el tipo de alimento recibido. Todos los cambios realizados en las dietas se
Materiales y métodos
14
aplicaban a todos los animales, teniendo en cuenta que las aves tuvieron alimento y agua disponibles ad libitum. Se monitoreo la temperatura, luz, agua, alimento, estado de la cama y la mortalidad realizando registros diarios. El programa oficial de vacunación nacional se administro con el fin de garantizar condiciones de bioseguridad.
2.3. Programa de alimentación
Se dividió en tres fases: la fase de preinicio (I), de 1 a 10 días; la fase de inicio (II), de 11 a 24 días de edad; y la fase de crecimiento (III), de 25 a 42 días. Se tomaron dos muestras de cada etapa y tratamiento, que se enviaron a Tekzol para análisis adicionales. Todas las dietas experimentales fueron elaboradas en base a una dieta basal (control negativo), a base de maíz y harina de soya, la cual presento una reducción de -60 kcal/kg de energía metabolizable y - 1% de proteína porcada etapa; estas fueron ajustadas a los requerimientos nutricionales.
2.4. Tratamientos experimentales
Se manejaron tres tratamientos experimentales, la distribución de los tratamientos y las réplicas a través de la Unidad aparece en la tabla a continuación:
Tabla 1. Composición de las dietas experimentales
Dieta Descripción Control Negativo (CN) Dieta control negativo con -60 kcal/kg de energía metabolizable y -1% de proteína de acuerdo con la fase de vida del ave, sin aditivos.
CN + Muramidasa Dieta control negativo con inclusión de 50 ppm de muramidasa.
CN + Bacillus subtilis Dieta control negativo con inclusión de 200 ppm de Bacillus subtilis.
Materiales y métodos
15
2.5. Sacrificio de animales y obtención de muestras
A los 21 y 42 días de edad, se seleccionaron aleatoriamente dos aves por réplica. El sacrificio se llevó a cabo conforme a la legislación vigente en Colombia (Resolución 241 de 2013; Resolución 253 de 2020), utilizando métodos de insensibilización. Las aves fueron sumergidas en una tina con agua y posteriormente recibieron una descarga sinusoidal (50 Hz, 50 V), y posteriormente seguida de la sección de la carótida externa y la vena yugular para garantizar un desangrado rápido y humanitario (Galvin, 2005; De Queiroz et al., 2020). Se obtuvieron segmentos de 2 cm de yeyuno e íleon, los cuales se fijaron en formol bufferado y tamponado al 10% durante 24 horas para su procesamiento histológico.
2.6. Procesamiento histológico
Las muestras fueron deshidratadas en alcoholes de concentración crecientes, posteriormente aclaradas en xilol (2 h) e incluidas en parafina según protocolos estandarizados (Luna, 1968). Los bloques obtenidos se seccionaron en un microtomo a un grosor de 4 µm y montados en láminas y teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) (Pelicano et al., 2007).
2.7. Obtención y análisis de resultados
Histomorfometría Las láminas fueron evaluadas en un microscopio óptico Motic®, en los objetivos 4× (vellosidades) y 10× (criptas). Se realizaron 25 mediciones en el día 21 y en el 42, para machos y hembras en yeyuno e íleon, correspondientes a: altura de vellosidad (del ápice al inicio de la cripta), ancho de vellosidad, profundidad de cripta y ancho de cripta. El análisis se llevó a cabo con el software Motic Images Plus® 2.0, utilizando calibración de escala para garantizar imágenes estandarizadas y comparables (Uni et al., 1998).
Materiales y métodos
16
Inmunohistoquímica Los bloques de yeyuno e íleon se remitieron a un laboratorio externo especializado en inmunohistoquímica. Donde se emplearon anticuerpos primarios dirigidos contra claudina- 1, claudina-5, ocludina y zona de oclusión-1 (ZO-1).
Las láminas se documentaron mediante microfotografía digital, ajustando nitidez y contraste para estandarizar la representación cromática. La cuantificación de la intensidad de tinción se efectuó con el software ImageJ®-Fiji, mediante análisis de densidad de color en áreas representativas de cada proteína, la puntuación de cada una de la expresión de proteínas estrechas realizo en base a el estudio realizado por Cizkova et al., (2021) donde la intensidad de la tinción se evaluó cuatro categorías: fuerte, moderada, débil y negativa, como se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 2. Tabla de referencias para clasificación colorimétrica en inmunohistoquímica por Fiji/imagen J según Cizkova et al., (2021).
Valores de referencia Categoría Descripción 0–60 Fuerte Alta deposición de DAB Alta expresión de la proteína
61–120 Moderada Tinción intermedia Expresión Moderada
121–180 Débil Tinción tenue Baja expresión
≥181 Negativa Muy claro o blanco Ausencia o mínima expresión detectable
Materiales y métodos
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Inmunoglobulinas Para ello, se realizó la extracción de muestras sanguíneas de las aves, las cuales se remitieron a un laboratorio especializado para la determinación (CIDAGRO), cuantificación y caracterización de los principales isotipos de inmunoglobulinas séricas expresados en cada uno de los tratamientos experimentales a través de espectrofotometría.
2.8. Análisis estadístico
Los datos recolectados se procesaron en SAS® v.9.4. Se evaluarán los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas. Las variables histomorfométricas y de inmunoglobulinas fueron analizadas mediante ANOVA, y las diferencias entre tratamientos se establecerán mediante la prueba de Tukey, considerando un nivel de significancia de p <
0,05.
En el caso de la inmunohistoquímica se realizó el cálculo de la media aritmética de los valores obtenidos en el software Microsoft Excel 365 con el fin de aplicar el método descrito por Cizkova et al., (2021), para el análisis e interpretación de los resultados.
Resultados
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3. RESULTADOS
3.1. Histomorfométria
3.1.1. Hembras de 21 días de edad
En la tabla 3, se observan los resultados en el yeyuno de las hembras evaluadas a los 21 días de edad, se evidencio que el largo de las vellosidades fue significativamente mayor (p < 0,05) en el grupo control negativo (773,04 ± 27,56 µm) y en el grupo con Bacillus subtilis (734,14 ± 14,09 µm), en comparación con el grupo alimentado con muramidasa (531,75 ± 23,89 µm). En el íleon de las hembras a los 21 días, el largo de vellosidad del grupo tratado con B. Subtilis (586,46 ± 23,83 µm) y el control negativo (579,14 ±12,23 µm), presento diferencia con las aves alimentadas con muramidasa (487,28 ± 13,92 µm).
El ancho de las vellosidades de hembras en el yeyuno a los 21 días, presento efecto (p < 0.05) en los tratamientos con Bacillus subtilis (112,83 ± 5,77 µm) y muramidasa (104,06 ± 5,41 µm) con respecto al control negativo (87,55 ± 2,89 µm). En cuanto a el ancho de las vellosidades en el íleon de 21 días se observa diferencia estadística entre el grupo alimentado con muramidasa (151,33±6,97 µm) y Bacillus subtilis (106,36±12,56 µm).
Al evaluar el largo de las criptas en yeyuno de hembras de 21 días se observó (tabla 3) diferencias (p < 0.05) en el grupo con Bacillus subtilis (89,17 ± 2,9 µm), en comparación con el control (79,26 ± 2,73 µm) y la muramidasa (75,95 ± 2,48 µm). En cuanto a él íleon de hembras de 21 días el largo de criptas tuvo valores superiores en el control (88,74 ± 3,45 µm), en comparación con Bacillus subtilis (73,9 ± 2,56 µm) y muramidasa (69,41 ± 2,35 µm).
Resultados
19
3.1.2. Hembras de 42 días de edad
En el íleon de las hembras evaluadas en los 42 días, el largo de las vellosidades se incrementó (p < 0.05) en la dieta control negativo (649,35 ± 19,72 µm) y muramidasa (625,6 ± 15,35 µm) al compararlo con Bacillus subtilis (542,77 ± 18,60 µm). En cuanto al ancho de las vellosidades de íleon en machos de 42 días se observó un incremento en los valores en el grupo tratado con B. subtilis (163,34 ± 7,21 µm) a comparación del control (136,17 ± 7,12 µm) y el tratamiento con muramidasa (129,16±8,23 µm).
En la tabla 3 podemos observar que, en el yeyuno de las hembras a los 42 días de edad, frente al parámetro del largo de criptas se presenta diferencias (p < 0.05), en las aves alimentadas con Bacillus subtilis (96,01 ± 5,4 µm) y muramidasa (92,97 ± 4,25 µm) con respecto al control (79,73 ± 3,9 µm). En el caso de ancho de las criptas del íleon en machos de 42 se observó diferencia (p < 0.05), con los tratamientos de Bacillus subtilis (55,82 ± 2,31) y muramidasa (57,2 ± 1,09 µm) frente al control (48,6 ± 1,96 µm).
Resultados
20
Tabla 3. Media y desviación estándar (±) con relación a el tamaño histomorfométrico de vellosidades y criptas (largo y ancho) de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad.1
1 LV: largo de vellosidad; AV: ancho de vellosidad; LC: largo de cripta; AC: ancho de cripta; CN: control negativo; MUR: muramidasa; YH: yeyuno hembra; IH: íleon hembra; Alpha (0.05), Coeficiente de Variación para datos con diferencias significativas: YH.LV.21: 22,65; YH.AV.21: 25,84; YH.LC.21: 17,97; YH.LC.42: 24,65; IH.LV.21: 16,62 IH.AV.21: 41,02; IH.LC.21: 21,02; IH.LV.42: 15,79; IH.AV.42: 25,63; IH.AC.42: 18,44.
YEYUNO HEMBRA
21 DÍAS
42 DÍAS
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
LV 773,04±27,56ª 734,14±14,09ª 531,75±23,89b 815,54±38,38 757,47±46,73 832,15±27,74 AV 87,55±2,89b 112,83±5,77ª 104,06±5,41ª 158,69±10,17 135,4±12,55 129,16±8,23 LC 79,26±2,73b 89,17±2,9ª 75,95±2,48b 79,73±3,9b 96,01±5,4ª 92,97±4,25ab AC 52,28±2,61 54,93±1,79 51,56±1,55 55,75±2,39 59,32±2,78 56,3±1,71
ÍLEON HEMBRA
21 DÍAS
42 DÍAS
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
LV 579,14±12,23a 586,46±23,83ª 487,28±13,92b 649,35±19,72ª 542,77±18,60b 625,6±15,35ª AV 138,71±12,86ab 106,36±12,56b 151,33±6,97a 136,17±7,12b 163,34±7,21ª 133,5±6,33b LC 88,74±3,45a 73,9±2,56b 69,41±2,35b 79,44±2,21 81,97±3,5 77,39±2,14 AC 45,52±2,52 51,59±2,36 48,77±2,25 48,6±1,96b 55,82±2,31ª 57,2±1,09ª
Resultados
21
3.1.3. Machos de 21 días de edad.
En el íleon de los machos de 21 días (tabla 4), se observa un efecto en el largo de las vellosidades en el tratamiento de muramidasa (690,34 ± 22,04 µm) en comparación con el control negativo (579,83 ± 23,23 µm). El ancho de las vellosidades en el yeyuno presento diferencia (p < 0.05), en las aves alimentadas con muramidasa (99,03 ± 1,67 µm) y Bacillus subtilis (96,8 ± 3,08 µm) en comparación con el control (74,8 ± 2,11 µm). En el ancho de las vellosidades se encontraron diferencias significativas entre todos los grupos, siendo mayor en muramidasa (136,8 ± 5,47 µm) menor en el control (85,77 ± 2,85 µm).
En el largo de las criptas del íleon en macho de 42 días se presentaron diferencias (p < 0.05), donde Bacillus subtilis (97,63 ± 3,65 µm) y muramidasa (94,04 ± 3,69 µm) tenían valores mayores en comparación a el grupo tratado con el control negativo (83,22 ± 2,69 µm). En el ancho de las criptas se presentó efecto (p < 0.05), en el grupo muramidasa (70,74 ± 2,21 µm), en comparación a el control negativo (51,93±1,44 µm) y Bacillus subtilis (55,33±2,44 µm). En cuanto al ancho de las criptas el Bacillus subtilis (59,69±2,12 µm) y la muramidasa (65,58±1,99 µm) se presenta un efecto en comparación del control negativo (41,31±1,51 µm).
Resultados
22
3.1.4. Machos de 42 días de edad
En el yeyuno de machos de 42 días (tabla 4), se observaron diferencias (p < 0.05) en el largo de las vellosidades intestinales entre los tratamientos donde B. Subtilis (927,26 ± 45,18 µm) poseía valores altos en comparación a el control negativo (789,02±31,46). En el ancho de las vellosidades del yeyuno en machos de 42 días, hay diferencia significativa en cuanto al control negativo (150,92 ± 6,84 µm), al compararlos con Bacillus subtilis (124,81 ± 2,51 µm) y muramidasa (133,94 ± 3,03 µm). En el íleon, respecto al ancho de la vellosidad, los valores fueron mayores en Bacillus subtilis (144,44 ± 4,45 µm), en comparación con muramidasa (125,14 ± 4,49 µm).
El largo de las criptas en el íleon de machos de 42 días hubo presencia de diferencias en el tratamiento con Bacillus subtilis (93,61 ± 3,68 µm) frente al control (85,01 ± 2,03 µm). Frente al ancho de criptas del yeyuno tuvo mayor resultado en el grupo tratado con Bacillus subtilis (77,64 ± 2,34 µm) en comparación con el control negativo (64,76 ± 2,9 µm) y muramidasa (63,03 ± 2,09 µm).
Resultados
23
Tabla 4. Media y desviación estándar (±) con relación a el tamaño histomorfométrico de vellosidades y criptas (largo y ancho) de yeyuno e íleon, con los tratamientos en machos de 21 y 42 días de edad.2
YEYUNO MACHO
21 DÍAS
42 DÍAS
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
LV 662,53±12,26 619,01±31,46 651,73±18,88 789,02±31,46b 927,26±45,18a 895,29±23,45ab AV 74,8±2,11b 96,8±3,08a 99,03±1,67a 150,92±6,84a 124,81±2,51b 133,94±3,03b LC 79,62±2,56 76,59±3,49 82,29±2,19 94,06±4,72 98,52±3,41 88,28±3,28 AC 51,93±1,44b 55,33±2,44b 70,74±2,21ª 64,76±2,9b 77,64±2,34a 63,03±2,09b
ÍLEON MACHO
21 DÍAS
42 DÍAS
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
LV 579,83±23,23b 646,9±16,43ab 690,34±22,04ª 816,27±28,39 993,97±269,55 786,88±23,98 AV 85,77±2,85c 101,82±3,27b 136,8±5,47ª 128,4±6,03ab 144,44±4,45a 125,14±4,49b LC 83,22±2,69b 97,63±3,65a 94,04±3,69ab 85,01±2,03b 93,61±3,68a 85,06±2,72ab AC 41,31±1,51b 59,69±2,12a 65,58±1,99a 63,09±2,02 69±2,09 66,78±2,21
2 LV: largo de vellosidad; AV: ancho de vellosidad; LC: largo de cripta; AC: ancho de cripta; CN: control negativo; MUR: muramidasa; YM: yeyuno macho; IM: Íleon macho; Alpha (0.05), Coeficiente de Variación para datos con diferencias significativas: YM.AV.21:17,79; YM.AC.21: 22,16; YM.LV.42: 20,73; YM.AV.42: 18,29; YM.AC.42: 20,20; IM.LV.21: 17,56; IM.AV.21: 19,83; IM.LC.21: 16,81; 21,29; IM.AC.21: 25,19; IM.AV.42: 19,83; IM.LC.42: 16,81.
Resultados
24
3.2. Inmunoglobulinas
En esta investigación se observó que la concentración de anticuerpos se encontró elevada en los machos a los 21 días, donde la IgY presenta diferencias significativas (p < 0.05) siendo mayor en el control negativo (44,79±0,52 µm) en comparación con Bacillus subtilis (31,27±1,59 µm).
Resultados
25
Tabla 5. Media y desviación estándar (±) en relación con la expresión de inmunoglobulinas de los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad.3
21 DÍAS
42 DÍAS
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
IGY
42,17±0,007 39,02±8,79 41,81±0,77
IGY
38,37±12,7 38,37±12,7 23,85±2,65
IGM
27,16±1,38 33,48±5,53 40,22±11,62
IGM
34,88±11,13 34,88±11,13 30,58±4,76
IGA
16,9±5,72 25,145±1,85 16,25±0,3
IGA
15,99±19,19 15,99±19,19 7,81±6,13
Tabla 6. Media y desviación estándar (±) en relación con la expresión de inmunoglobulinas de los tratamientos en machos de 21 y 42 días de edad.
21 DÍAS
42 DÍAS
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
CN CN + B. Subtilis
CN + MUR 50
IGY
44,79±1,14a 31,27±3,18b 40,37±3,57ab
IGY
39,26±9,69 31±1,64 47,88±4,76
IGM
52,23±1,32 43,47±10,38 40,41±2,51
IGM
37,18±3,52 37,01±5,8 43,25±11,11
IGA
16,84±3,16 12,14±0,41 20,95±7,55
IGA
5,77±1,002 4,32±5,28 4,8±2,24
3 CN: control negativo; MUR: muramidasa; IGY: inmunoglobulina Y; IGM: inmunoglobulina M; IGA: inmunoglobulina A; Alpha (0.05), Coeficiente de Variación para datos con diferencias significativas: IGY.M.21: 16.86.
Resultados
26
3.3. Inmunohistoquímica
Figura 1. Representación de colorimetría en base a reacción inmunohistoquímica en cuanto a proteínas de unión estrecha.
3.3.1. Hembras
En hembras de 21 y 42 días, tanto en yeyuno como en íleon (Tablas 7–8), la inmunoexpresión de proteínas de unión estrecha evidencio un patrón predominantemente estable para occludina y claudina-5, y mayor variabilidad para claudina-1 y ZO-1. La ocludina presentó una expresión moderada y homogénea entre tratamientos y segmentos intestinales. De forma similar, claudina-5 mantuvo una expresión moderada en yeyuno e íleon en ambos periodos, sin presentarse variaciones relevantes entre grupos.
Sin embargo, la expresión claudina-1 evidenció cambios que fueron dependientes del segmento y la edad; de forma general, la expresión fue débil en la mayoría de las condiciones evaluadas; sin embargo, se observaron expresiones negativas en yeyuno a los 21 días para control negativo y muramidasa, y a los 42 días para los tratamientos con Bacillus subtilis y control negativo. Finalmente, ZO-1 mostró un patrón consistentemente débil en yeyuno e íleon a los 21 y 42 días, lo que indica baja intensidad de marcación bajo las condiciones experimentales.
Fuerte Moderada Débil Negativa
Resultados
27
Figura 2. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; hembras; 21días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis o c l u d i n a Z o n a
d e
O c l u s i ó n c l a u d i n a
Hembras yeyuno 21 c l a u d i n a
Resultados
28
Figura 3. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; hembras; 21 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Hembras ileon 21 dias c l a u d i n a
c l a u d i n a
5
o c l u d i n a Z o n a
d e
O c l u s i ó n
Resultados
29
Figura 4. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; hembras; 42 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Hembras yeyuno 42 o c l u d i n a Z o n a
d e
O c l u s i ó n c l a u d i n a
5
c l a u d i n a
Resultados
30
Figura 5. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; hembras; 42 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Hembras ileon 42 dias o c l u d i n a Z o n a
d e
O c l u s i ó n c l a u d i n a
c l a u d i n a
Resultados
31
Tabla 7. Media con relación a la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad.
YEYUNO HEMBRAS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
67,5
74,65
66,99
66,9
68,44
65,26
CLAUDINA
178,69
190,13
187,25
184,05
179,3
168,53
CLAUDINA 5
95,45
100,86
90,22
76,19
87,17
85,45
ZO
159,3
164,21
147,75
168,22
151,38
161,3
ÍLEON HEMBRAS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
70,83
80,37
69,35
63,92
78,61
70,63
CLAUDINA
169,99
184,45
181,29
173,66
191,72
178,94
CLAUDINA 5
91,47
87,81
89,75
81,55
81,93
79,27
ZO
160,46
169,58
163,09
157,29
156,49
140,54
Resultados
32
Tabla 8. Expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos en hembras de 21 y 42 días de edad.
YEYUNO HEMBRAS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada
CLAUDINA
Débil Negativa Negativa Negativa Débil Débil
CLAUDINA 5
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada ZO Débil Débil Débil Débil Débil Débil
ÍLEON HEMBRAS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada
CLAUDINA
Débil Negativa Negativa Débil Negativa Débil
CLAUDINA 5
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada ZO Débil Débil Débil Débil Débil Débil
Resultados
33
3.3.2. Machos
En el yeyuno e íleon de hembras de 21 y 42 días (Tablas 9–10), la inmunoexpresión de proteínas de unión estrecha presento un patrón diferencial por segmento intestinal, edad y tratamiento. La ocludina presentó, en términos generales, una expresión moderada en la mayoría de los grupos evaluados, con la excepción del control negativo en yeyuno a los 21 días en la cual esta disminuyo. Para claudina-1, se observaron variaciones marcadas: en yeyuno a 21 y 42 días, la expresión fue negativa en la mayoría de los tratamientos, mientras que el grupo suplementado con Bacillus subtilis a los 21 días se observó expresión débil. En íleon a 21 días, tanto B. subtilis como el control negativo la expresión fue negativa, en contraste con muramidasa, que mantuvo una expresión moderada. A los 42 días, el íleon exhibió un comportamiento inverso entre tratamientos, por ejemplo, B. subtilis presento una inmunoexpresión moderada, el control negativo se ubicó como débil, y muramidasa fue negativa.
En relación con claudina-5, el patrón fue homogéneo: en cuanto a yeyuno e íleon, por ejemplo, a los 21 como a 42 días, todos los tratamientos tuvieron una expresión moderada de la proteína, lo que sugiere estabilidad del marcador bajo las condiciones experimentales. Finalmente, para ZO-1, la respuesta en el intestino presento una tendencia a rangos bajos. En yeyuno de 21 días, B. subtilis y muramidasa se observó una expresión débil, mientras que el control negativo fue moderado. En yeyuno de 42 días, todos los tratamientos se clasificaron como débil. En íleon de 21 días, la expresión de ZO-1 fue consistentemente débil en todos los grupos, mientras que a los 42 días se observó una expresión moderada en el control negativo y muramidasa, manteniéndose débil en el grupo con B. subtilis.
Resultados
34
Figura 6. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; machos; 21 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Machos yeyuno 21 o c l u d i n a c l a u d i n a
Z o n a
d e
O c l u s i ó n c l a u d i n a
Resultados
35
Figura 7. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; Machos; 21 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Machos ileon 21 dias o c l u d i n a Z o n a
d e
O c l u s i ó n c l a u d i n a
c l a u d i n a
Resultados
36
Figura 8. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Yeyuno; machos; 42 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Machos yeyuno 42 o c l u d i n a c l a u d i n a
5
c l a u d i n a
Z o n a
d e
O c l u s i ó n
Resultados
37
Figura 9. Expresión de proteínas de unión estrecha (ocludina, zona de oclusión, claudina 1, claudina 5). Íleon; machos; 42 días de edad.
CN Muramidasa B. subtilis Machos ileon 42 o c l u d i n a c l a u d i n a
5
Z o n a
d e
O c l u s i ó n c l a u d i n a
Resultados
49
Tabla 9. Media con relación a la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon en machos de 21 y 42 días.
YEYUNO MACHOS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
74,26
0,06
73,96
60,51
66,7
69,51
CLAUDINA
177,25
183,24
182,59
184,15
189,45
186,51
CLAUDINA 5
92,61
88,1
87,96
75,18
82,28
75,15
ZO
174,24
110,89
154,35
153,17
149,87
141,7
ÍLEON MACHOS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
70,5
82,63
83,6
66,52
74,82
60,9
CLAUDINA
183,69
186,38
178,37
178,87
181,3
183,09
CLAUDINA 5
71,47
93,42
83,51
79,04
83,84
67,1
ZO
170,88
165,44±
166,21
146,41
158,35
140,41
Resultados
49
Tabla 10. Categorización de la expresión de proteínas estrechas de yeyuno e íleon, con los tratamientos de machos de 21 y 42 días.
YEYUNO MACHOS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
Moderada Fuerte Moderada Moderada Moderada Moderada
CLAUDINA
Débil Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa
CLAUDINA 5
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada ZO Débil Moderada Débil Débil Débil Débil
ÍLEON MACHOS
21 DÍAS
42 DÍAS
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
Bacillus subtilis CN
CN + MUR 50
OCLUDINA
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada
CLAUDINA
Negativa Negativa Moderada Débil Negativa Negativa
CLAUDINA 5
Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada Moderada ZO Débil Débil Débil Débil Moderada Moderada
Discusión
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4. DISCUSIÓN
Las infecciones de las aves son extremadamente importantes, más cuando se relacionan con el deterioro de la salud gastrointestinal, influyendo negativamente en el crecimiento de las células intestinales y la expresión de uniones estrechas, disminuyendo la función del epitelio como barrera física (Londero, 2012; Álvarez et al., 2021). Por esta razón se puede comprometer la productividad de las aves debido al estrés y a la disminución en la absorción secundariamente por el daño en la integridad intestinal (Salazar, 2019).
La inmunosupresión en la avicultura es un factor que se vuelve relevante en la expresión de enfermedad en la industria avícola; por ejemplo, un mal manejo en la secuencia de producción, administración y manipulación en aves, generan alta mortalidad y pérdidas económicas para los productores (Orsi et al., 2010). En busca de mejorar la productividad y con ello la salud intestinal, se han implementado diferentes suplementos y aditivos que ayudan a reducir el uso de antibióticos como método para promover el crecimiento (Thirumeignanam et al., 2024); Entre los aditivos más utilizados en la avicultura se encuentra el uso de prebióticos, los probióticos, enzimas, ácidos orgánicos, entre otros (Iñiguez et al., 2021); el uso de estos aditivos promueven el incremento de los microorganismos benéficos que modulan positivamente el equilibrio de la salud intestinal (Amer et al., 2023).
En la actual investigación se realizó evaluación histomorfométrica del yeyuno e íleon en aves tratadas con control negativo, Bacillus subtilis y muramidasa, se determinó la media y desviación estándar (±) del largo y ancho de las vellosidades intestinales, así como del largo y ancho de las criptas, tanto en el yeyuno como en el íleon, de machos y hembras de 21 y 42 días de edad.
Los cambios más relevantes en la evaluación histomorfométrica del epitelio intestinal, son la altura y ancho de las vellosidades, en cuanto a las criptas, la profundidad (Sen et al., 2012). Una mayor longitud de vellosidades puede indicar mayor absorción de nutrientes (Jayaraman et al., 2013). Consecuentemente, un incremento en su ancho o largo de las criptas, indica
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mayor renovación celular, ya que, albergan células madre que se encuentran encargadas de la proliferación de células (Nii et al., 2020; Xiang et al., 2023; Gao et al., 2018). Adicionalmente se ha documentado que las criptas intestinales producen diversas células que regulan la respuesta inmunitaria y la microbiota, lo que facilita la digestión (Umar, 2010). Los resultados de esta investigación se presentan a continuación.
En cuanto al largo de vellosidad de yeyuno e íleon en hembras y el largo de vellosidad de íleon 21 días y yeyuno de 42 días en machos, se observan diferencias significativamente mayores en los grupos tratados con Bacillus subtilis, esto se puede relacionar con que el uso de B.subtilis aumenta la altura de las vellosidades a comparación de otros suplementos, esto se puede dar dependiendo de las diferencias en el mecanismo de acción de cada uno de los grupos de aves alimentadas con el aditivo , así como los procesos adaptativos del intestino frente a los factores nutricionales y microbianos (Amer et al., 2021).
B. subtilis actúa de forma generalizada sobre el ecosistema intestinal, modulando positivamente la microbiota, disminuyendo la respuesta inflamatoria e incrementando la absorción de nutrientes por parte de los enterocitos (Ma et al., 2018; Fuller, 1989; Śliżewska et al., 2020; Khan et al., 2020; Belkaid & Hand, 2014).
Una estimulación negativa por parte de bacterias patógenas en el epitelio intestinal conlleva a un mayor recambio y con esto una mayor producción de células madre que producen enterocitos, llevando a una profundidad de cripta mayor (Hou et al., 2022; Yang et al., 2016; Lee et al., 2010). La exclusión competitiva es constante y necesaria, pero en aves adultas, dependiendo de su estado inmunológico puede que no sea biológicamente significativa a comparación de aves en desarrollo (Callaway et al., 2008; Glendinning et al., 2019).
B. subtilis posee varios factores que lo hacen una buena alternativa como aditivo, entre ellos, el mecanismo de acción, que no solo genera síntesis de metabolitos antimicrobianos, como bacteriocinas lipopeptidos (surfactina, iturina, fengicina) (Tian et al., 2021; Cutting, 2011), sino también la capacidad de generar ácidos grasos de cadena corta (Barker, 2014; Milián et al., 2008) y la capacidad de generar enzimas exógenas con actividad hidrolítica, entre las que
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se mencionan proteasas, amilasas y lipasas, mejorando la capacidad de degradar eficazmente los nutrientes en el tracto gastrointestinal (Abdallh et al., 2024; Cutting, 2011; Khan et al., 2024; Qiu et al., 2021 Stefanello et al., 2025) incrementando la altura de las vellosidades y la relación vellosidad cripta tanto en duodeno como en el íleon (Sen et al., 2012; Chen et al.,
2025).
Frente a la utilización de bacterias como Bacillus, Lactobacillus o Bifidobacterium se menciona que ellas tienen la posibilidad de fermentar sustratos y posteriormente transformarlos en ácidos grasos de cadena corta como el acetato, propionato y butirato, estos se hacen fundamentales en el mantenimiento de la barrera intestinal, ya que, hacen parte del sustento energético para lo enterocitos (Memon et al., 2022; Śliżewska et al., 2020; Bedford & Gong, 2018; Celi et al., 2017; Liu, Y, et al., 2021). En cuanto a las bacterias benéficas se documenta que poseen mayor capacidad de metabolizar algunas sustancias como carbohidratos, oligosacáridos y algunas sustancias que no se digieren por parte del hospedero (Liu, Y et al., 2021; Borda-Molina et al., 2018). En cambio, bacterias patógenas (como E. coli, Clostridium perfringens o Salmonella) se encuentran mayormente dependientes de nutrientes como monosacáridos, péptidos y hierro (Schubert et al., 2024; Ratledge & Dover,
2000).
Como mecanismo competitivo las bacterias benéficas tienen la capacidad de retener minerales mediante sideróforos que son quelantes de hierro limitando la disponibilidad en el entorno, disminuyendo la cantidad de nutrientes para el desarrollo de las patógenas (Ollinger et al., 2006). En el caso del Bacillus subtilis, este mecanismo de competencia se puede relacionar con la producción de bacillibactina, un sideróforo que es secretado por bacterias del género Bacillus este posee alta afinidad por Fe³⁺, posteriormente se genera el complejo bacillibactina–Fe³⁺ que optimiza la capacidad de internalizar el hierro permitiendo cubrir las necesidades metabólicas del Bacillus (Miethke et al., 2006); Este mecanismo de acción aparte de que favorece el crecimiento de las bacterias Bacillus, también ayuda en la exclusión competitiva ,ya que, reduce la disponibilidad de hierro afectando directamente a bacterias hierro-dependientes, controlando la proliferación y el crecimiento de bacterias patógenas (Schubert et al., 2024; Ratledge & Dover, 2000).
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Los investigadores mencionan que el yeyuno es un sitio importante en la digestión y
absorción de micronutrientes y de macronutrientes, esto conlleva mayor actividad
metabólica y gasto energético, debido a su mayor extensión anatómica (Seijas, 2014), Cuando se adicionan probióticos como el B. subtilis, se mejora la digestión tras producción de enzimas que modulan el pH a nivel del intestino, se disminuye el pH intestinal, brindando un ambiente más ameno para las bacterias benéficas, ya que estas se adaptan con facilidad a las condiciones acidas, reduciendo la carga de bacterias patógenas, se documenta que la competencia no es solo se relaciona con la disminución en la disponibilidad de nutrientes, sino que también por el ambiente químico (Ma et al., 2018; Śliżewska et al., 2020; Šimunović et al., 2025; Diaz-López et al, 2017; Iñiguez-Heredia et al, 2021). Esto genera un efecto modulador y antiinflamatorio, disminuyendo la respuesta inflamatoria basal y el gasto energético asociado a la activación inmune (Memon et al., 2022), El yeyuno posee una población microbiana reducida en comparación con el íleon, esto favorece que sea más susceptible a los beneficios generados por la suplementación de probióticos en la dieta (Cai et al., 2024). Por el contrario, el íleon tiene una población microbiana elevada, mayor respuesta inmunológica local y actividad inflamatoria, ya que, al poseer mayor interacción con la población de microrganismos, la adición de B. subtillis puede mostrar cambios más marcados en cuanto a histomorfologia (Glendinning et al., 2019). Los efectos en cuanto al el aumento en el tamaño de las vellosidades en íleon de 42 días, pueden darse o no dependiendo de la microbiota y de la salud individual del animal. (Cai et al., 2024; Glendinning et al.,
2019).
En íleon de machos de 21 alimentadas con B. subtilis, los cambios en la morfología pueden asociarse con la fase de crecimiento, ya que, durante la etapa temprana, es de alta demanda metabólica, ya que, la energía estará enfocada en el crecimiento y el aumento de masa muscular (Guo et al., 2020; Ravindran & Abdollahi, 2021; Ma et al., 2018); En este contexto, la profundidad de las criptas en esta etapa en aves puede que sea transitoria y no necesariamente sea algo patológico o algo asociado con lesiones, sino con la estabilización estructural de la mucosa que se desencadena por estrés leve o modificaciones en la población microbiana (Yosi & Metzler-Zebeli, 2023). Los estímulos proveen un ambiente en el que
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puede haber liberación local de factores de crecimiento como EGF e IGF-1, los cuales activan las células madre intestinales y promueven la expansión del compartimento proliferativo (Yan & Charles, 2018).
En cuanto a el tamaño de las criptas la mayoría de casos donde se documenta una cripta más profunda suele estar asociada a la respuesta cuando hay agresiones continuas de la mucosa ya sea por estímulos como la disbiosis, procesos inflamatorios, procesos adaptativos o compensatorios tras daño o desequilibrio de microorganismos, tras estos posibles factores el organismo regenera enterocitos de manera más acelerada para mantener la integridad de la barrera intestinal (Ducatelle et al., 2018; Jha et al., 2019).
En cuanto a el ancho de vellosidad los enterocitos como método compensatorio aumentan su superficie apical, su volumen citoplasmático y la organización celular, este aumento del tamaño de los enterocitos asocia morfológicamente con un epitelio más grueso y un incremento en el ancho de la vellosidad, incluso sin cambios marcados en su altura (Short & Derrickson, 2020). Consecuentemente, un aumento en la formación de transportadores de nutrientes, tales como el SGLT1, el PepT1 y los transportadores de aminoácidos, los cuales aumentan el flujo de transcelular de glucosa, péptidos y aminoácidos (Cervantes et al., 2016). En el caso de existir incremento debido a la tasa metabólica se debe a un incremento en la densidad mitocondrial, ya que, a mayor demanda hay mayor crecimiento a nivel (Short & Derrickson, 2020).
Por último, la maduración de enterocitos que se genera tras la adición de Bacillus subtilis ayuda a la uniformidad estructural de cada una de las vellosidades dando una epitelio continuo, compacto y funcional, en conjunto, genera cambios fisiológicos que aumentan el ancho de la vellosidad en aves de 42 días reflejando una adaptación intestinal, asociada a enterocitos más grandes y metabólicamente activos (Chen et al., 2025). Este aumento puede interpretarse como un mayor recambio celular y de la tasa de renovación del tejido intestinal, efecto característico de los probióticos que estimulan la regeneración del epitelio (Yosi & Metzler-Zebeli, 2023). Se documenta que, en aves de corral, uno de los métodos para aumentar la ingesta y eficiencia en la digestibilidad son los probióticos, estos pueden generar
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aumento en la actividad de las enzimas, generando un equilibrio en el microbiota, esto con el fin de promover la integridad intestinal y aumentar el rendimiento productivo (Cuccato et al., 2022). Esto provee un ambiente ideal para que las criptas mantengan una mayor actividad proliferativa y de regeneración, estabilizando la mucosa intestinal, con mayor capacidad de adaptación y recuperación estructural, especialmente en segmentos distales como el íleon (Yosi & Metzler-Zebeli, 2023).
En cuanto a el comportamiento observado en las aves tratadas con control negativo se evidencia que la altura de las vellosidades aumento significativamente en las hembras de 21 en el yeyuno e íleon y a los 42 días en el íleon sé puede asociar con un mecanismo adaptativo compensatorio a las deficiencias nutricionales o a la deficiencia en la absorción (Hrncir, 2022; Montagne et al., 2003; Yamauchi, 2002; de Verdal et al., 2010; Palo et al., 1995). En el estudio realizado por de Verdal, et al., (2010) se seleccionaron dos dietas, una con alta digestibilidad (D+) y otra una con baja digestibilidad (D−) (control negativo), como resultado se observaba que la altura de la vellosidad era mayor para D− en comparación con D+ en el yeyuno. En una dieta sin aditivos o los nutrientes necesarios, pueden presentarse deficiencias en el equilibrio de microorganismos en el intestino, ocasionando un mayor desgaste energético relacionado con el mantenimiento de la homeostasis (Palo et al., 1995; Barekatain et al., 2023), por eso las aves alimentadas con dietas que tengan altos niveles de componentes no digestibles, presentan adaptaciones morfológicas en las vellosidades, como el incremento en el número de células en las criptas y mayor tamaño de vellosidad (Montagne et al., 2003); ya que, los cambios compensatorios en las vellosidades reflejan la adaptación tisular durante el estrés nutricional o inmunológico, ya que se estimula la liberación de hormonas por las células L conllevando a la producción de hormonas intestinótrofas como el GLP-2, esta hormona se relaciona con la proliferación de células de la cripta, aumenta la profundidad estas y favoreciendo a el aumento en la altura de las vellosidades (Burrin et al., 2001; Deng et al., 2021); Además, se ha asociado que el exceso de nutrientes no digeridos conlleva a disbiosis incrementado bacterias patógenas en el lumen intestinal que puede lesionar las células de la mucosa intestinal (Ma et al., 2018); esto posteriormente desencadena inflamación, daño epitelial y cambios morfológicos en las vellosidades intestinales, incrementado la altura de vellosidades y profundidad de criptas (Hrncir, 2022).
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También se reporta que puede que el uso de control negativo no muestre cambios estructurales significativos en etapas tempranas, sin embrago en el día 42, el intestino al mantener estímulos negativos constantes posee la capacidad de adaptarse a las condiciones del ambiente luminal para brindar una mayor absorción, los estímulos constantes pueden inducir un aumento en el tamaño del epitelio (Gilani et al., 2021).
En el caso de la dieta control negativo a nivel celular, se documenta que la disminución en nutrientes necesarios en la dieta aumenta la proliferación de células madre con el fin de incrementar el recambio celular, esto se produce mediante la activación de vías que interactúan con el estrés metabólico, como AMPK y HIF-1α, dando como consecuencia hiperplasia y el crecimiento adaptativo por parte del epitelio, permitiendo una mayor absorción (Ribeiro-Castro et al., 2025; Yibcharoenporn et al., 2025). Este incremento en el tamaño de las criptas no necesariamente se relaciona con mala salud intestinal o un epitelio más eficiente, sin embargo, se puede relacionar como una adaptación de la barrera intestinal para mantener la homeostasis y evitar traslocación de patógenos (Pérez-Segura, 2022). La ausencia o disminución de nutrientes puede generar proliferación por parte de microorganismos no beneficiosos, lo que puede estimular el aumento de células en las criptas y acelerando la migración de enterocitos hacia la vellosidad (Montoya, 2019). Finalmente, en el íleon las modificaciones en la mucosa pueden llegar a ser más pronunciadas debido la proporción de células M, las cuales son sensibles a los cambios microbianos en la luz, lo que, facilitan la respuesta inmune y la protección de la mucosa intestinal (Chistiakov et al., 2015). Por otro lado no siempre el control negativo presenta vellosidades más largas, ya que, en algunos casos el organismo puede inducir un estado de supervivencia metabólica, ante una dieta deficiente o un desafío, el animal puede dirigir los nutrientes a funciones vitales por encima del mantenimiento del tejido intestinal (Cant et al., 1996).
La reducción en el largo de vellosidad en aves alimentadas con muramidasa (tabla 3 y 4), se ha relacionado a que estas enzimas ejercen efecto sobre los enlaces β-1,4 del peptidoglicano, de bacterias Gram positivas, un componente que se encuentra en la pared celular de microorganismos patógenos (Amer et al., 2023; Molina et al, 2022). La capacidad de
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hidrolizar el peptidoglicano contribuye a la reducción de la carga de bacterias no benéficas en la luz intestinal, mejorando la salud intestinal por medio de la reducción de la respuesta inflamatoria, optimizando la integridad y equilibrando el ambiente intestinal (Frederiksen et al., 2021). Se ha reportado que el uso de la muramidasa como suplemento alimentario es relevante en la regulación de la microbiota e histomorfología intestinal, puede ser una posible alternativa ante el uso de antibióticos (Gong et al, 2017); Cho et al., (2024) menciona que la ausencia de un desafío puede disminuir la eficacia de la muramidasa ,ya que, sustrato no encuentra el sustrato hidrolizable (patógeno blanco) o este disminuido, lo que afectaría negativame6nte la efectividad del aditivo; por ello, la suplementación con muramidasa en ausencia de sustrato bacteriano e inflamatorio no es alternativa funcional en la alimentación de pollos de engorde (Cho et al., 2024; Broom & Kogut, 2018). Por otro lado, en condiciones sanitarias y de manejo óptimas, se genera un microambiente ideal para el desarrollo de la microbiota gastrointestinal, la producción endógena de enzimas digestivas y sin patógenos que alteren la funcionalidad gastrointestinal (Apajalahti & Vienola, 2016; Clavijo & Flórez, 2018; Broom & Kogut, 2018). Otro estudio realizado por Bortoluzzi et al., (2024), demostró que en pollos desafiados con Eimeria y Clostridium perfringens donde se generó estrés intestinal, el uso de muramidasa como suplemento redujo la respuesta inmune en el intestino y mejoro la función de la barrera epitelial.
Sin embargo, a los 42 y 21 días e íleon de los machos se obtuvo un incremento de las vellosidades, esto se relaciona con una mejor capacidad digestiva y absortiva (Vollmer et al., 2008); Adicionalmente la muramidasa tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces glicosídicos β-1-4 entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina en carbohidratos simples y aminoácidos (Amer et al., 2023). Además, otros autores reportaron que suplementación con muramidasa mejoró la digestibilidad de aminoácidos de la proteína cruda en el íleon e incremento la utilización de la energía (Pérez-Calvo et al., 2023). Esto plantea que en ciertas condiciones favorece la digestibilidad de nutrientes de los pollos de engorde (Cho et al., 2024). Sin embargo, un factor que también influye en el crecimiento de vellosidades en el día 21, es que el intestino se encuentra aún en fase de crecimiento, ya que esta etapa, la muramidasa puede ser más efectiva si existe una carga elevada de bacterias
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Gram positivas o fragmentos de peptidoglicano en la luz intestinal (Goes et al., 2022). Esto relacionado a la falta de maduración de la microbiota facilita los procesos secundarios de disbiosis, la muramidasa puede disminuir la carga de peptidoglicano, , ayudando a mejorar la integridad de las uniones estrechas y favorecer una mejor absorción de nutrientes (Bortoluzzi et al., 2024).
Otro estudio relacionado suplementación con Muramidasa genero la ganancia lineal de condición corporal, disminuyó el índice de conversión alimenticia. aumentando linealmente la relación entre la longitud vellosidades ileales y profundidad de las criptas (Boroojeni et al., 2019).
Así mismo, la estructura a los 42 días es más madura y la población microbiana es más estable (Oakley et al., 2013), por esto, la muramidasa puede ser beneficiosa ya que al ser una enzima que rompe los enlaces de peptidoglicano, ayuda a reducir la acumulación de fragmentos de pared celular reduciendo la respuesta inflamatoria.
En cuanto a las inmunoglobulinas son un grupo de proteínas, producidas por los linfocitos B y los plasmocitos, el organismo al detectar por un agente patógeno o un elemento extraño cumple la función de secretar anticuerpos, con el fin de generar especificidad contra antígenos (Patel et al.,
2023).
Las inmunoglobulinas potencian la inmunidad humoral, promoviendo protección a los órganos, esto con el fin de reducir la recurrencia y gravedad de infecciones. El aumento en la respuesta inmune incrementa la inmunidad, minimizando la recurrencia de las infecciones, mejorando la salud animal y reduciendo la dependencia de antibióticos en el alimento (Chase, 2018; Soto, et al, 2016).
Existen diferentes clases de inmunoglobulinas, como la IgY, esta se presenta en mayor proporción en los organismos, posee gran importancia debido a que esta genera protección inmunológica, capacidad de opsonizar y brinda aporte en la unión de receptores para células NK durante la citotoxicidad (Nezlin, 1998). La IgA interviene en la inmunidad innata, evita la entrada de agentes patógenos (virus y bacterias) en la mucosa y a los epitelios (Wieland et
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al., 2004). La IgM neutraliza proteínas y carbohidratos presentes en la superficie de bacterias, virus y parásitos, posee un rol fundamental en las infecciones agudas y es activador de la citólisis dependiente del complemento. (Robledo, 2008; Schroeder & Cavacini, 2010).
Las concentraciones de inmunoglobulinas (IgY, IgA e IgM) en el suero o la mucosa sirven como indicadores cruciales del estado inmunitario inespecífico del animal, por esto la medición y la revisión de estos indicadores es fundamental en una producción. Asimismo, un sistema inmunitario intestinal funcional y sin presencia de patógenos, favorece la eficiencia digestiva y la absorción de nutrientes (Broom & Kogut, 2018; Kogut, 2019).
Numerosos estudios documentan beneficios de los tratamientos con probióticos, ya que, estos contribuyen a estabilizar la microbiota y a fortalecer la barrera intestinal, por medio de una disminución en la activación y proliferación de células inflamatorias, resultando en niveles más bajos de IgY (Mazziotta et al., 2023). Con el uso de probióticos como Bacillus subtilis, la microbiota se equilibra, disminuyendo la adhesión de bacterias patógenas reforzando la barrera intestinal (a través de claudinas, ocludina y ZO-1), ya que, reduce la entrada de antígenos al organismo por medio del epitelio intestinal, se reporta que al haber un equilibrio en la microbiota y las inmunoglobulinas sistémicas (especialmente IgY) son más bajas (Huang & Lee, 2018). La presencia de diferencias significativas en un solo tratamiento puede explicarse por la forma en que cada grupo interactúa con el sistema inmunitario intestinal, el tratamiento probiótico tiene la capacidad a modular la respuesta inmune, promoviendo tolerancia inmunológica y equilibrio del microbiota, esto puede expresarse en valores de inmunoglobulinas normales, (Kazemi et al., 2021). En contraste, el control negativo carece de este efecto modulador, lo que puede favorecer una estimulación inmune basal más alta frente a antígenos luminales (Haghighi et al., 2005).
En síntesis, la significancia observada en IgY (tabla 5) no indica una mejor condición inmunitaria del control negativo, sino una posible respuesta por estrés o aumento en la respuesta inflamatoria en comparación con otro tratamiento ya sea con probióticos o enzimas digestivas (Khosravi et al., 2025). La presión antigénica en pollos se refiere a la variabilidad y cantidad de estímulos microbianos, estos continuamente activan el sistema inmune
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intestinal, la presión no proviene de una sola fuente, la literatura menciona factores que, cuando se combinan, generan sobrecarga inmunológica y metabólica (Frank, 2002).
Uno de los factores que influyen en lo anteriormente mencionado, es la presencia de bacterias patógenas u oportunistas como Clostridium perfringens, E. coli y Salmonella, la proliferación de estas puede verse en procesos de disbiosis, ya sea por mala higiene del galpón, estrés, malnutrición o fallas en la bioseguridad (Attia et al., 2025; Withanage et al., 2005). Estos microorganismos liberan toxinas y componentes de pared celular (como lipopolisacáridos y peptidoglicanos) que estimulan constantemente el tejido linfoide asociado al intestino. Se documenta que, a nivel inmunológico, B. Subtilis modula la producción de inmunoglobulinas, regulando la IgA (mucosa). IgY e IgM (a nivel sistémico) (Naqi et al.,1984). Su acción no se caracteriza por una hiperestimulación, sino por una regulación más eficiente de la respuesta, reduciendo la activación excesiva frente a antígenos luminales, esto se traduce en una menor presión inflamatoria crónica y en una respuesta humoral más controlada, compatible con un estado de homeostasis intestinal (Cai et al., 2024).
Otro factor importante es la digestión, ya que, cuando la formulación posee deficiencias a nivel nutricional o la actividad de las enzimas digestivas es limitada o nula, hay una mayor cantidad de proteínas y carbohidratos en la luz intestinal (Clark & Johnson, 2018). Estos componentes en la última porción del íleon y el ciego pueden favorecer la fermentación bacteriana excesiva y la producción de metabolitos irritantes, incrementando la exposición del epitelio a antígenos microbianos (Qaisrani et al., 2014).
En este caso la muramidasa al ser una enzima antibacteriana, estabiliza y modula la población de microorganismos en el intestino, por medio de la hidrolisis los enlaces del peptidoglicano, componente presente en la pared celular de bacterias Gram positivas (Oladokun et al., 2023). Al romper los enlaces en la estructura genera un daño en la pared bacteriana, reduciendo la carga microbiana potencialmente perjudicial en el tracto gastrointestinal (Vollmer, 2008). Bajo este escenario, la suplementación con enzimas como la muramidasa puede no generar efectos significativos adicionales, ya que sus beneficios suelen manifestarse con mayor claridad cuando existe un desequilibrio microbiano o un desafío patógeno que compromete
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la homeostasis intestinal (Amer et al., 2023). Las enzimas digestivas actúan de forma complementaria: al mejorar la digestión, reducen la cantidad de proteína y carbohidratos no digeridos que llegan al intestino distal, lo que disminuye la fermentación bacteriana y la producción de toxinas, esto también reduce el estímulo inflamatorio y, por tanto, reduce la producción de inmunoglobulinas (Kiarie et al., 2013; Memon et al., 2022).
Una de las funciones más relevantes del tracto gastrointestinal es ser barrera, que proteger al organismo de invasiones biológicas, físicas y químicas (Chichlowski et al., 2007). La barrera epitelial a nivel gastrointestinal es un borde que posee componentes esenciales como lo son estructuras intercelulares físicas denominadas uniones estrechas (Guttman & finlay, 2009). Las TJ (uniones estrechas) poseen un rol fundamental en el transporte y permeabilidad de diferentes sustancias que ingresan al organismo (Dorelo et al., 2014). Estas uniones poseen diversidad de proteínas transmembranas unidas con adaptadores citoplasmáticos y al citoesqueleto de actina generando así sellos intercelulares o bandas celulares (Guttman & finlay, 2009). Las TJ según un estudio de microscopia parecen estar agrupadas por una red selladora que rodea la zona apical de cada célula epitelial, esta relación está compuesta por una larga fila de proteínas, que reaccionan y se producen un cierre selectivo del espacio entre las células (Dorelo et al., 2014). Parte de la estructura de la vía paracelular del enterocito está modulada por complejos proteicos constituidos por proteínas como la ocludina, ZO y Claudinas (Guttman & Finlay, 2009; Shen et al., 2005), los cambios en la expresión de estas proteínas transmembrana es esencial para evitar que agentes o sustancias ingresen entre las células epiteliales (Dorelo et al., 2014). La ruptura de esta barrera tiene efectos muy marcados en la salud, ya que, las deficiencias en la estructura epitelial en la mayoría de los casos van de la mano con procesos patológicos, inflamación crónica y diarrea (Guttman & finlay, 2009).
La confirmación de enfermedades infecciosas, procesos neoplásicos o presencia de diferentes moléculas en un órgano puede realizarse en cortes histológicos mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) (Gimeno et al., 1999). La técnica inmunohistoquímica relaciona componentes a nivel inmune, histológicos y bioquímicos, dando una herramienta para la localización y detección de un antígeno especifico (Delgado et al.,2007; Silva et al., 2005).
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Este método constituye una herramienta diagnóstica fundamental, ya que, permite la detección específica de antígenos tisulares a través de la unión antígeno-anticuerpo, visualizada mediante sistemas de revelado con marcadores enzimáticos o cromogénicos. (Spraker et al., 2002), las láminas teñidas suelen ser evaluadas por medio de sistemas de puntuación semicuantitativa, este tipo de evaluación se da por medio de la percepción de la expresión de marcadores IHC por parte de los sujetos (Cizkova et al., 2021).
Para la IHQ se utiliza un sistema con el uso de enzima peroxidasa de rábano picante (HRP), esta enzima es una oxidoreductasa, que tiene como fin catalizar reacciones de oxidación, también se usa el cromógeno 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) (Magaki et al., 2018). El proceso consiste en que se coloca un anticuerpo primario que se une al antígeno en el tejido, posteriormente se adiciona un anticuerpo secundario que posea HRP y se añade el sustrato DAB, después de esto se genera una reacción y un precipitado marrón insoluble que se acumulara en la zona donde está el antígeno, donde entre mayor color hay mayor expresión de la proteína de unión (Ramos-Vara, 2005). El uso de enzimas específicas permite generar una reacción de señalización sobre diferentes sustratos, produciendo un precipitado coloreado que revela con precisión la localización tisular de la proteína (Montero, 1998; Ramos-Vara & Borst, 2016).
En un corte histológico de intestino analizado mediante inmunohistoquímica, en el caso de proteínas de unión estrecha se interpreta que la localización en el caso de expresión de alguna proteína se va a visualizar en la región más apical del dominio lateral de los enterocitos (Dorelo et al., 2014). La razón por la que las proteínas se observan específicamente en la región apical o en la región apical lateral se atribuye a la estructura del epitelio intestinal y a la interacción de las proteínas de unión con cada uno de los enterocitos, por esta razón, la reacción genera un depósito marrón en el borde superior de los enterocitos.
En cuanto a la expresión de las TJ, las proteínas como la ocludina, es una proteína transmembrana que se localizada en la región apical de las TJ, esta posee la función de señalización intracelular y zona de anclaje para proteínas adaptadoras como las ZO, participando en rutas de proliferación y apoptosis (Kuo et al., 2022), un aumento por la
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sobreexposición de estímulos negativos, ya sea por agentes patológicos o sustancias nocivas, puede interferir con las funciones, alterando la proliferación y renovación normal del epitelio, en algunos procesos de respuesta inflamatoria crónica, hay reportes en los que se evidencia que el acumulo o redistribución de la ocludina, puede darse por el mantenimiento incorrecto de la barrera intestinal, modificándose el balance osmótico y con esto la absorción intestinal (Ahn et al, 2016).
Se observaba expresión fuerte de la ocludina en el caso de yeyuno en machos de 21 días tratados con control negativo, esto se puede relacionar como un método adaptativo frente a estímulos negativos constantes en el epitelio intestinal, con el fin de generar mayor robustes en la barrera intestinal, reduciendo la permeabilidad paracelular y reforzando la barrera epitelial, evitando el paso de sustancias nocivas (Montagne et al., 2003; Hrncir, 2022). Los valores del control negativo en comparación con otros tratamientos, podría indicar una respuesta compensatoria temprana del epitelio intestinal, ya que, las dietas con niveles bajos en nutrientes genera un estado de estrés metabólico para las células intestinales; los enterocitos activan vías celulares orientadas la preservación, la absorción y la integridad de la barrera intestinal, esto se puede traducir en el aumento compensatorio de la expresión de proteínas de unión estrecha (Sung & Adeola, 2025).
Hay que tener en cuenta que no en todas las ocasiones la expresión puede que sea alta, ya que, la dieta control negativo puede que favorezca a problemas como la disbiosis, lo que incrementa los metabolitos y desechos irritantes, compuestos que inducen a la respuesta inflamatoria y liberación de citocinas que alteran la organización de las TJ (Feng et al., 2019). El estrés nutricional puede activar vías inflamatorias (NF-κB, MLCK), estas producen la fosforilación y cambio en la distribución de la ocludina y claudinas desde la membrana hacia el citoplasma, esto puede reducir la expresión (Shen & Turner, 2005).
También hay que tener en cuenta que la síntesis de proteínas está muy ligada a la disponibilidad de nutrientes adecuados, al ser proteínas, requieren aminoácidos esenciales para su formación (Council, 1994). En conjunto, la falta de nutrientes puede producir limites en la cantidad de sustratos como la capacidad metabólica necesaria para la síntesis y correcta
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distribución de las proteínas de unión estrecha (Barekatain et al., 2019). Esto puede traducirse en una expresión débil o incluso negativa en evaluaciones.
Por su parte las claudinas constituyen una familia de más de 20 isoformas y cada una tiene distribución específica dependiendo el tejido y en este caso segmento intestinal (Suzuki, 2013; Suzuki, 2020). Las claudinas cumplen funciones entre ellas están, la formación de barreras con el fin de disminuir la permeabilidad paracelular y las formadoras de poros de los canales, que sirven como canales para la entrada de sustancias (Tsukita & Furuse, 2000; Günzel & Yu, 2013).
En cuanto la Claudina-1, es una proteína formadora de barrera, que se encarga de restringir el paso paracelular de moléculas cargadas (iones como Na⁺ o Cl⁻) y no cargadas, ayudando a reducir el espacio intercelular, limitando la difusión pasiva entre células (Günzel & Yu, 2013). Esta proteína de unión se expresa mayormente, en epitelios estratificados como la piel y en ciertos tejidos específicos como pulmón, riñón, entre otros (Simard et al., 2005; Collins et al., 2013).
En el caso de la claudina-5 es una claudina de tipo sello, su función principal es reducir la permeabilidad paracelular a iones y macromoléculas, haciendo que el epitelio sea más robusto, estas se encuentran mayormente en el endotelio pero se pueden presentar en el epitelio intestinal (Ozden et al., 2010). En el epitelio intestinal suele predominar la expresión de proteínas como la claudina 3, 4, 5 y 2, siendo las proteínas más predominantes la claudina 3 y 4 en el epitelio intestinal. En este caso si las isoformas que predominan en el intestino se encuentran en niveles, el epitelio no requiere necesariamente una alta expresión de claudina- 1 y 5 (Günzel & Yu, 2013).
En el caso de proteínas como la ZO actúa como proteína estructural de anclaje que conecta las claudinas y la ocludina con el citoesqueleto de actina, mejorando la cohesión entre enterocitos y da resistencia al epitelio frente al daño e inflamación (Ahn et al, 2016). Desde el punto de vista funcional, este aumento en proteínas de unión estrecha busca minimizar el “escape” de nutrientes y electrolitos hacia la luz intestinal y limitar la translocación
Discusión
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bacteriana en un contexto donde el organismo no puede permitirse pérdidas (Huang & Lee, 2018; Shu et al., 2023).
Por su parte, la muramidasa, degrada fragmentos de peptidoglicano bacteriano presentes en el lumen, estas partículas tienen la capacidad de activar receptores inmunes como TLR y estimulando la respuesta inmune (Brott & Clarke, 2019). Al disminuir los estímulos se reduce la activación inflamatoria, dando como resultado, integridad epitelial, que se puede ver reflejada con la expresión menos exacerbada (Poritz et al., 2011).
Conclusiones
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5. CONCLUSIONES
Los hallazgos histomorfométricos sugieren que la suplementación con Bacillus subtilis actúa de manera beneficiosa en el equilibrio de la microbiota intestinal y favoreciendo mejoras estructurales, esto fue representado como mayor longitud de vellosidades y menor profundidad de criptas en la mayoría de casos, esto puede generar cambios en cuanto a la superficie de absorción, contribuyendo a un mejor desempeño productivo, además de apoyar la reducción en el uso de antibióticos promotores de crecimiento. En cuanto a la muramidasa los resultados demostrado que puede influir en el aumento del ancho de vellosidades, pero al poseer un mecanismo de acción dirigido a hidrolizar el peptidoglicano de algunas bacterias patógenas, sus efectos pueden llegar a ser más evidentes cuando existe mayor presión microbiana o presencia de patógenos.
En cuanto a los valores de las inmunoglobulinas, se evidencia que en etapas tempranas como lo es a los 21 días, un estímulo inmunológico agudo, asociado con un desafío intestinal por bajos niveles de nutrientes o sin suplementos, puede favorecer que haya mayor expresión de IgY en sangre. En contraste, las aves suplementadas con Bacillus subtilis y muramidasa no mostraron un incremento en la producción de inmunoglobulinas, lo que podría indicar que estos aditivos contribuyen a mantener un ambiente intestinal más estable y con menor presión antigénica, disminuyendo la estimulación del sistema inmune.
Y, por último, la expresión de proteínas de unión estrecha como ocludina, claudinas y ZO, no debe interpretarse de única manera como un indicador lineal de mejor integridad en la barrera epitelial, sino también como un factor dinámico del estado fisiológico, inmunológico o patológico de un grupo de animales. Hay que tener en cuenta que no en todas las ocasiones la expresión fuerte de proteínas de unión es un factor positivo en el mantenimiento de la barrera, ya que, dietas como el control negativo pueden generar afecciones por el incremento de metabolitos y desechos irritantes, compuestos que inducen a la respuesta por parte del sistema inmune, esto genera reorganización e incremento de las TJ, a diferencia de tratamientos como el B. subtilis o la muramidasa, que por su mecanismo ayudan a estabilizar
Conclusiones
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el epitelio.
En conclusión, lo observado en cuanto a la expresión fuerte de Ocludina puede deberse a una respuesta adaptativa leve del epitelio, ya que la ocludina al ser la proteína más apical tiene la capacidad de responder rápidamente a los estímulos o estrés leve, esto indica un estado de adaptación rápida.
En cuanto a las claudinas la expresión débil o negativa encontradas en los resultados de esta investigación pueden indicar que las proteínas claudina-1 y 5 al no ser isoformas tan predominantes en el intestino, puede que no se de la expresión de estas no sean tan fuertes.
Recomendaciones
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6. RECOMENDACIONES
• Para próximas investigaciones seria relevante abordar estudios frente a la
conformación de la microbiota intestinal por medio de secuenciación, con el fin de correlacionar la histomorfométria, expresión de uniones estrechas, e inmunoglobulinas con los cambios en la composición bacteriana, ya que, la muramidasa y el Bacillus subtilis ejercen efectos moduladores sobre bacterias Gram positivas, conocer las poblaciones a nivel luminal brindaría más herramientas para comprender las interacciones con los hallazgos observados a los 21 y 42 días.
• También se propone la inoculación de microorganismos patógenos o inducción de la
respuesta inflamatoria por medio de lipopolisacáridos de manera controlada. Con el fin de contemplar si los tratamientos tienen un efecto protector más evidente bajo condiciones de estímulos negativos.
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