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DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANA DE HOJAS

Y FLORES DE LA ESPECIE VEGETAL Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob.

Andrés Camilo Andrade Burbano Paula Alejandra Giraldo Villamil

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE

QUÍMICO FARMACÉUTICO

DIRECTOR

OSCAR EDUARDO RODRÍGUEZ AGUIRRE

Lic. Química y Biología - M.Sc. – Ph. D. Director trabajo de Grado

UNIVERSIDAD EL BOSQUE

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A)

FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

BOGOTÁ D.C.

2018

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DEDICATORIA

Sin duda alguna este trabajo está dedicado a las personas más importantes en mi vida, Alonso Giraldo y Esperanza Villamil mis padres que con su dedicación y ejemplo me enseñaron que siempre se debe soñar en grande y que con perseverancia y dedicación se conseguirán grandes logros, a Luciana mi hija por ser el ángel de mi vida y mi más grande motivación, a mi hermana Gabriela por su ayuda incondicional, compañía y por siempre creer en mí, a mis abuelos Oliver Villamil, Beatriz Serrano, Odilia Rojas y tíos Juan Villamil y Julián Villamil que siempre han estado conmigo apoyándome en las diferentes decisiones que tomo, guiándome y aconsejándome para que pueda alcanzar cada meta que me propongo, para finalizar a Camilo Andrade por que juntos construimos una gran amistad y alcanzamos este gran sueño. Alejandra Giraldo V.

A Dios por brindarme la sabiduría, inteligencia y perseverancia necesaria para lograr uno a uno los retos para este proceso, a mis padres Hernando Andrade y Floralba Burbano quienes siempre me brindaron una palabra, un consejo, animo en las dificultades presentadas durante este proceso universitario, a mis hermanos Julián, Felipe y Mariana Andrade por creer en mí siempre, porque sin importar los errores estuvieron a mi lado y son mi apoyo constante, a mi abuela Aminta Morales y Daniel Andrade han sido las personas que siempre me han enseñado a seguir adelante sin importar las dificultades, a ser mejor cada día, a ser mejor persona, Alejandra Giraldo con quien logramos sacar adelante esta investigación, por su incondicionalidad, esfuerzo y gran amistad, para finalizar a todas las personas que me han acompañado por este tiempo con quienes comparto momentos y sentimientos de los cuales recibí lo suficiente para seguir adelante y culminar este logro. Andrés Camilo Andrade B.

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AGRADECIMIENTOS

A Dios quien permitió que culmináramos este trabajo de la mejor manera y en el tiempo de él, por mantenernos unidos en este gran proceso que no es fácil, pero con paciencia, fortaleza y dedicación se pudo lograr.

Al Dr. Oscar Eduardo Rodríguez Aguirre por el tiempo compartido, por las enseñanzas y los conocimientos brindados, por los consejos dados y sobre todo por la gran amistad que se forjo durante este largo tiempo.

A Luis Miguel Pombo director control de calidad laboratorios LABFARVE, por permitirnos culminar la parte investigativa en las instalaciones de la Universidad Juan N. Corpas.

A la Pontificia Universidad Javeriana por prestar sus equipos e instalaciones para nuestra investigación.

A nuestras familias y amigos quienes fueron el apoyo incondicional y la motivación de seguir adelante a pesar de los diferentes obstáculos que se presentaron, por creer en nosotros porque gracias a ustedes se realizó este gran trabajo.

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Nota de aceptación

___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________

________________________ Firma del presidente de jurado

________________________ Firma del jurado

________________________ Firma del jurado

Bogotá D.C., 2018

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TABLA DE CONTENIDO

DEDICATORIA ................................................................................................................ 2 AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... 3 TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................. 5 ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................ 6 ÍNDICE DE ILUSTRACIONES ......................................................................................... 7 ÍNDICE DE IMÁGENES .................................................................................................. 8 ÍNDICE DE GRAFICAS ................................................................................................... 9 ABREBIATURAS ........................................................................................................... 12 GLOSARIO .................................................................................................................... 14

1

INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 17

2

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................. 18

3

JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 19

4

ANTECEDENTES ................................................................................................ 20

5

MARCO TEÓRICO .............................................................................................. 22

6

OBJETIVOS ......................................................................................................... 41

7

METODOLOGÍA .................................................................................................. 42

8

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 53

9

CONCLUSIONES ................................................................................................ 90

10

RECOMENDACIONES ........................................................................................ 92

11

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 93

12

ANEXOS .............................................................................................................. 98

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades Género Chromolaena. (Fuente: Díaz et al., 2014) ...................... 24 Tabla 2 Ejemplos de metabolitos secundarios aislados de especies del género Chromolaena (Fuente: Orjuela, 2015) ........................................................................... 25 Tabla 3. Clasificación de los modelos de ensayo in vitro según su modo de reacción ET o HAT. (Fuente: Tovar del Rio , 2013) ........................................................................... 31 Tabla 4. Cantidad obtenida de extracto por cada Solvente. (Fuente: Autores) ............. 54 Tabla 5. Porcentaje de Captación del radical DPPH* empleando Ácido ascórbico (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 55 Tabla 6. Porcentaje de captación del radical DPPH* empleando Rutina (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 56 Tabla 7. Porcentaje de captación del radical ABTS*+ empleando Ácido Ascórbico (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 56 Tabla 8. Porcentaje de captación del radical ABTS*+ empleando Rutina (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 57 Tabla 9. Porcentaje de captación del radical ABTS*+ empleando Trolox (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 57 Tabla 10. Porcentaje de Captación del radical DPPH* de extractos de hojas C. scabra (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 61 Tabla 11. Porcentaje de Captación del radical DPPH* de extractos de flores C. scabra (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 63 Tabla 12. Porcentaje de Captación del radical ABTS*+ de extractos de hojas C. scabra (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 64 Tabla 13. Porcentaje de Captación del radical ABTS*+ de extractos de Flores C. scabra (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 66 Tabla 14. IC50 de extractos de hojas y flores C. scabra, calculados por el método de decoloración del radical DPPH*. (Fuente: Autor) ........................................................... 67

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Tabla 15. IC50 de extractos hojas y flores C. scabra y patrones calculados por el método de decoloración del radical ABTS*+ (Fuente: Autores) .................................................. 68 Tabla 16. AAR de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método de decoloración del radical DPPH* (Fuente: Autores) ........................................................ 70 Tabla 17. AAR extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método de decoloración del radical ABTS*+ (Fuente: Autores) ....................................................... 72 Tabla 18. Datos IC50 extractos hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ (Fuente: Autores) .......................................................................... 74 Tabla 19.Datos Actividad Antioxidante Relativa (AAR) de extractos de hojas y flores C. scabra calculados por los ensayos DPPH* y ABTS*+ con respecto al ácido ascórbico (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 75 Tabla 20. Datos Actividad Antioxidante Relativa (AAR) de extractos de hojas y flores C. scabra calculados por los ensayos DPPH* y ABTS*+ con respecto a rutina (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 76 Tabla 21. Diámetro de inhibición de crecimiento en milímetros con el extracto diclorometano hojas (Fuente: Autores) .......................................................................... 79 Tabla 22. Diámetro de inhibición de crecimiento en milímetros con el extracto diclorometano flores (Fuente: Autores) ......................................................................... 80 Tabla 23. Diámetro de inhibición de crecimiento en mm con el extracto éter de petróleo flores (Fuente: Autores) ................................................................................................. 81 Tabla 24. IC50 extractos de hojas y flores C. scabra frente A. niger (Fuente: Autores) .. 84 Tabla 25. IC50 extractos de hojas y flores C. scabra frente P. digitatum (Fuente: Autores)

...................................................................................................................................... 84

ÍNDICE DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1. Causas y consecuencias del estrés oxidativo. (Fuente: Benito et al., 2014)

...................................................................................................................................... 29

Ilustración 2. Clasificación de los sistemas antioxidantes. (Fuente: Anonimo , s.f) ....... 30

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Ilustración 3. Mecanismos de reacción por transferencia de electrones y transferencia de átomos de hidrogeno (Fuente: Tovar del Rio , 2013) ............................................... 31 Ilustración 4. Estructura química del radical libre meta estable DPPH*. (Fuente: Londoño, 2012) ............................................................................................................. 32 Ilustración 5. Estructura del DPPH* antes y después de la reacción con el antioxidante. (Fuente: Tovar del Rio , 2013) ....................................................................................... 32 Ilustración 6. Estructura química del ABTS*+. (Fuente: Londoño, 2012) ....................... 33 Ilustración 7. Estructura del ABTS*+ antes y después de la reacción con el antioxidante. (Fuente: Tovar del Rio , 2013) ....................................................................................... 34 Ilustración 8. Microscopia Staphylococcus aureus (Fuente: Cervantes et al., 2014) ..... 35 Ilustración 9. Microscopia Eschericha coli (Fuente: Cervantes et al., 2014) .................. 36 Ilustración 10. Microscopia Aspergillus niger (Fuente: González et al., 2013)............... 37 Ilustración 11. Microscopia Penicillium digitatum (Fuente: González et al., 2013) ........ 38 Ilustración 12. Esquema de los halos de inhibición formados por el método de difusión en gel. (Fuente: Castellanos & Pedraza, 2009) ............................................................. 40 Ilustración 13. Grafica log concentración vs Longitud del halo (x2) (Fuentes: Castellanos & Pedraza, 2009) ........................................................................................................... 41 Ilustración 14. Distribución de las muestras en la caja de Petri para la determinación de la actividad antibacteriana. (Fuente: Autores) ............................................................... 50 Ilustración 15. Distribución de las muestras en la caja de Petri para la determinación de la actividad antifúngica. (Fuente: Autores) .................................................................... 52

ÍNDICE DE IMÁGENES

Imagen 1. Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob recolectada el municipio de Sibaté (Cundinamarca). (fuente: Autores) ..................................................................... 26 Imagen 2. Material vegetal Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob. (Hojas) previamente separado. (Fuente Autores) ...................................................................... 43

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Imagen 3. Material vegetal Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob. (Flores) previamente separado. (Fuente Autores) ...................................................................... 43 Imagen 4 Material vegetal Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob. (Flores) en su respectivo proceso de molienda (Fuentes: Autores) ................................................. 43 Imagen 5 Extracción de hojas equipo Soxhlet (Fuente: Autores) ................................. 43 Imagen 6. Agar Mueller Hinton. (Fuente: Autores) ........................................................ 50 Imagen 7. Cajas de Petri para ensayos antimicrobianos. (Fuente: Autores) ................. 50 Imagen 8. Ensayo ABTS*+ (Fuentes: Autores) ............................................................. 54 Imagen 9. Ensayo DPPH* (Fuentes: Autores) .............................................................. 54 Imagen 10. Actividad antibacteriana del extracto diclorometano hojas frentes a S. aureus (Fuente: Autores) ............................................................................................... 78 Imagen 11. Actividad antibacteriana del extracto diclorometano flores frente a S. aureus (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 79 Imagen 12. Actividad antibacteriana del extracto éter de petróleo flores frente a S. aureus (Fuente: Autores) ............................................................................................... 80

ÍNDICE DE GRAFICAS

Grafica 1. Curva de referencia del porcentaje de captación de DPPH* vs concentración de ácido ascórbico (Fuente: Autores) ............................................................................ 58 Grafica 2. Curva de referencia del porcentaje de captación de DPPH* vs concentración de rutina (Fuente: Autores) ............................................................................................ 59 Grafica 3. Curva de referencia del porcentaje de captación del radical ABTS*+ vs concentración de Ácido ascórbico (Fuente: Autores) .................................................... 59 Grafica 4. Curva de referencia del porcentaje de captación del radical ABTS*+ vs concentración de rutina (Fuente: Autores) .................................................................... 60 Grafica 5. Curva de referencia del porcentaje de captación del radical ABTS*+ v/s concentración de Trolox (Fuente: Autores).................................................................... 61 Grafica 6. % captación DPPH* vs extracto hojas C. scabra (Fuente: Autores) ............. 62

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Grafica 7. % captación DPPH* vs extractos flores de C. scabra (Fuente: Autores) ..... 64 Grafica 8. % captación ABTS*+ vs extractos hojas de C. scabra (Fuente: Autores) ...... 65 Grafica 9. % captación ABTS*+ vs extractos flores de C. scabra (Fuente: Autores) ...... 66 Grafica 10. IC50 de extractos hojas y flores de C. scabra y patrones calculados por el método de decoloración DPPH* (Fuente: Autores) ....................................................... 68 Grafica 11. IC50 de extractos hojas y flores de C. scabra y patrones calculados por el método de decoloración ABTS*+ (Fuente: Autores) ....................................................... 69 Grafica 12. Actividad antioxidante relativa de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método DPPH* (Fuente: Autores) ...................................................... 70 Grafica 13. Actividad antioxidante relativa de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método ABTS*+ (Fuente: Autores) ..................................................... 72 Grafica 14. Comparación datos IC50 extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ (Fuente: Autores) ............................................... 74 Grafica 15.Comparación actividad antioxidante relativa (AAR) de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ frente ácido ascórbico (Fuente: Autores) .......................................................................................... 76 Grafica 16.Comparación de los datos de actividad antioxidante relativa de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ frente rutina (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 77 Grafica 17. Masa crítica del extracto diclorometano hojas frente a S. aureus (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 78 Grafica 18. Masa crítica del extracto diclorometano flores frente a S. aureus (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 79 Grafica 19. Masa crítica del extracto éter de petróleo flores frente a S. aureus (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 80 Grafica 20. IC50 extractos de hojas y flores de C. scabra frente a S. aureus (Fuente: Autores) ......................................................................................................................... 81 Grafica 21. ABR extractos hojas y flores de C. scabra y patrón frente a S. aureus (Fuente: Autores) ........................................................................................................... 82

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Grafica 22. IC50 de extractos de C. scabra frente A. niger (Fuente: Autores) ................ 84 Grafica 23. IC50 extractos de C. scabra frente P. digitatum (Fuente: Autores) .............. 85 Grafica 24. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (fluconazol) frente A. niger (Fuente: Autores) .................................................................................................. 86 Grafica 25. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (ketoconazol) frente A. niger (Fuente: Autores) ............................................................................................. 87 Grafica 26. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (fluconazol) frente P. digitatum (Fuente: Autores) ........................................................................................... 88 Grafica 27. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (ketoconazol) frente P. digitatum (Fuente: Autores) ...................................................................................... 89

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ABREBIATURAS

AAR

ABTS*+

Actividad antioxidante relativa Ácido 2,2’- azino-bis-(3-etiltiazolina-bencenosulfónico-6).

ADN

Ácido desoxirribonucleico A. niger Aspergillus niger

APL

Aplicación

ATB

Antimicrobianos CH2Cl2 Diclorometano C.scabra Cu Chromolaena scabra Cobre

DMSO

Dimetilsufóxido

DPPH*

Radical α, α-difenil- β−Picrilhidrazilo (DPPH*). E. Coli Escherichia coli

EROS

Especie reactiva de Oxigeno EtOH Etanol GPx Glutatión peroxidasa GT Glutatión transferasas IC50 MeOH Coeficiente de inhibición 50 Metanol mL mg mm mg /L Mililitro Miligramo Milímetros Miligramo/Litro µg Mn Microgramos Manganeso NO Óxido nítrico O2- Superóxido OH- Hidroxilo

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P. digitatum

Penicillium digitatum Petrol Éter de petróleo Rutina Quercetin-3-rutinósido RL Radicales libres S. aureus Staphylococus aureus

SOD

Súper óxido dismutasa Trolox Ácido - 8- hidroxi- 2, 5, 7, 8- tetrametiloromano-2- carboxílico ufc/µL Vitamina C Unidad formadora de colonias/microlitro Ácido ascórbico Zn Zinc

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GLOSARIO

Antifúngico: Sustancia que tiene la capacidad de evitar el crecimiento de algunos tipos de hongos. (Organizacion Mundial de la Salud, 2009)

Antimicrobiano: Sustancia que demuestran la capacidad de reducir la presencia de microorganismos, como bacterias. (Organizacion Mundial de la Salud, 2009)

Antioxidante: Molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación (pérdida de uno o más electrones) de otras moléculas, generalmente sustratos biológicos como lípidos, proteínas o ácidos nucleicos. (Cardenas, 2017)

Diclorometano: Compuesto químico que se utiliza principalmente como disolvente. Está formado por un compuesto de cloro y de metano y permite disolver, o extraer, moléculas orgánicas. (Ministerio de agricultura y pesca, s.f)

Enfermedad: Alteración o desviación del estado fisiológico en una o varias partes del cuerpo, por causas en general conocidas, manifestada por síntomas y signos característicos, y cuya evolución es más o menos previsible. (Organizacion Mundial de la Salud, 2009)

Etanol: Compuesto químico, líquido incoloro e inflamable en un punto de ebullición de 78° C. Cuando se lo soluciona en agua se lo suele usar como disolvente y en la elaboración de bebidas alcohólicas. (Ministerio de agricultura y pesca, s.f)

Éter de petróleo: Mezcla de hidrocarburos compuesta principalmente por: 3metilpentano. (Ministerio de agricultura y pesca, s.f)

Extracto: Concentrado de plantas medicinales. (Chasquibol & Lengua , 2003 )

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Fitoquímica: Estudia cada grupo de la planta, desde su estructura química molecular, hasta las propiedades biológicas de los vegetales Realiza relevamientos y análisis de los componentes químicos de las plantas, como los principios activos, los olores, pigmentos, entre otros. (Chasquibol & Lengua , 2003 )

Fitoterapéutico: Producto medicinal empacado y etiquetado, cuyas sustancias activas provienen del material de una planta medicinal o sus asociaciones, presentado en estado bruto o en forma farmacéutica, y que se utiliza con fines terapéuticos. También puede provenir de extractos, tinturas o aceites. (Chasquibol & Lengua , 2003 )

IC50: Es una medida de la potencia se una sustancia en la inhibición de una función biológica o bioquímica especifica. Esta medida cuantitativa indica que cantidad de un fármaco u otra sustancia (inhibidor) se necesita para inhibir la mitad un determinado proceso biológico. (Castellanos & Pedraza, 2009)

Medicina tradicional: La medicina tradicional es todo el conjunto de conocimientos, aptitudes y prácticas basados en teorías, creencias y experiencias indígenas de las diferentes culturas, sean o no explicables, usados para el mantenimiento de la salud, así como para la prevención, el diagnóstico, la mejora o el tratamiento de enfermedades físicas o mentales. (Organizacion Mundial de la Salud, 2009)

Metanol: Compuesto químico que a temperatura ambiente se presenta como un líquido ligero, incoloro, inflamable y tóxico que se emplea como anticongelante, disolvente y combustible. Su fórmula química es CH3OH. (Ministerio de agricultura y pesca, s.f)

Planta: Organismo multicelular con células vegetales. (Ministerio de agricultura y pesca, s.f)

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Principio activo: Los principios activos son los ingredientes de los medicamentos herbarios que tienen actividad terapéutica. En el caso de los medicamentos herbarios cuyos principios activos hayan sido identificados, se debe normalizar su preparación, si se dispone de métodos analíticos adecuados, para que contengan una cantidad determinada de ellos. Si no se logra identificar los principios activos, se puede considerar que todo el medicamento herbario es un solo principio activo. (Ministerio de agricultura y pesca, s.f)

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INTRODUCCIÓN

El ser humano en el proceso de adaptación ha buscado y encontrado para las enfermedades que los aquejan soluciones en las plantas y ha descifrado inicialmente por ensayo y error las actividades medicinales en hojas, raíces, cortezas, semillas, frutos o flores; ello dio paso a que las plantas tomaran un importante y significativo papel en la sociedad y de ahí la medicina tradicional basada en las propiedades

curativas de las plantas conocida inicialmente como herbolaría, la cual empieza a

establecer cierta relación empírica entre el tipo de planta y la actividad biológica. Esto conllevo a generar un mayor conocimiento de las especies. Colombia cuenta con una gran variedad de especies nativas que a la fecha no han sido estudiadas, como son algunas de la familia asteráceae, género Chromolaena; siendo una de estas la Chromolaena scabra (L.f.) R.M. King & H. Rob., por tal motivo se pretende determinar la actividad antioxidante y antimicrobiana para así incrementar el conocimiento de este género dando que las otras especies estudiadas presentan alto potencial antioxidante, antimicrobiano, pesticida, tripanozoico, antiprotozoario entre otros. (Rodríguez , 2008)

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La resistencia a múltiples sustancias son un problema de salud pública que se observa en Colombia, esto debido al uso indiscriminado de antibióticos, antifúngicos, antisépticos y desinfectantes que han generado una respuesta de supervivencia en los microorganismos, que los capacita para evadir con eficacia la acción bactericida de algunos agentes, otro problema de salud pública es el incremento en casos diagnosticados con cáncer, enfermedad que anualmente cobra la vida de 33.100 personas, de estas 16,300 son hombres afectados especialmente por cáncer de estómago, pulmón, próstata, colon, recto y leucemias, los restantes 16,800 son mujeres que presentan esta enfermedad principalmente en el cuello uterino, estómago, mama, pulmón, colon y recto, datos reportados por el ministerio de salud y protección social en el año 2011.

Se está buscando soluciones a los problemas de salud pública anteriormente mencionados en las plantas y específicamente en Colombia encontramos el género Chromolaena, que cuenta con 27 especies y a la fecha se han reportado estudios con potencial antifúngico, antibacteriano y antitumoral. Así, por ejemplo, Torrenegra y colaboradores en el 2007, aislaron y corroboraron la efectividad de sustancias responsables de la actividad antimicótica y antibacteriana en C. tacotana, C. perglabra,

C. subscandens y C. bullata. Rodríguez y colaboradores en el 2008 evaluaron los

compuestos químicos y el potencial de extractos con actividad antiparasitaria (Chagas y Leishmaniasis), otros estudios de actividad citotóxica y antitumoral se han realizado en

C. tacotana y C. leivensis, encontrando que estos proseen potencial para ser utilizados

en medicina.

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Debido al poco conocimiento químico y biológico que hay a la fecha de la especie Chromolaena scabra (L.f.) R.M. King & H. Rob., se busca determinar el potencial antioxidante y antimicrobiano para incrementar el conocimiento de esta y su posible uso en las problemáticas anteriormente descritas.

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JUSTIFICACIÓN

Colombia geográficamente hablando, se encuentra en una zona donde prospera una amplia variedad de especies vegetales, debido a su amplia variedad de pisos térmicos, las comunidades por décadas han utilizado las plantas como alternativa de solución a sus enfermedades y muchos “medicamentos” provienen de las mismas. Gracias a los conocimientos de nuestros ancestros se ha avanzado en el conocimiento de especies medicinales generándose una cultura de investigación de nuevos fármacos a base de plantas.

Con el desarrollo la industria farmacéutica se promueve otra percepción de fármacos a base de desarrollo fitoterapéutico, donde se parte del hecho que las plantas poseen metabolitos secundarios con principios activos se sirven para prevenir, atenuar o curar un estado patológico. Estas actividades han generado la necesidad de investigar el principio o principios activos específicos que sintetizan las plantas y que son utilizados en diferentes formas de administración.

Con este precepto inicia la investigación de la especie Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob, especie con poca información a la fecha. Se iniciará estudiando la actividad antioxidante y antimicrobiana de las hojas y las flores en soluciones de diferente polaridad, con los resultados que se obtengan de la presente investigación se plantea generar información y perspectivas para futuros estudios terapéuticos. Se busca que la investigación sirva como herramienta de análisis para futuros investigadores tanto en la academia como en la industria farmacéutica.

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ANTECEDENTES

El uso medicinal de plantas es un tema bastante amplio ya que se puede establecer que inicia en un contexto de multiculturalidad en el que la mayoría de pueblos indígenas tenían diferentes categorías de enfermedad observadas, en estas comunidades se pensaba en que la enfermedad era percibida entre los indígenas como una ruptura en el orden natural o social y que quien se enfermaba era porque había trasgredido alguna norma establecida por la sociedad.

En este entonces la tarea de las personas que trataban estas enfermedades consistía en restablecer el equilibrio tanto en el orden social como en el religioso era allí donde entraba a jugar un papel importante la medicina tradicional ya que toda curación se derivaba de las plantas que la tierra misma ofrece al hombre. La población indígena diferenciaba entre la enfermedad del cuerpo y la enfermedad espiritual, en este caso la enfermedad del cuerpo se trataba con plantas.

Ya más hacía la época contemporánea se empiezan a encontrar y desarrollar medicinas a base de extractos de plantas en las cuales se encuentra principios activos que se cree que puede llegar a tener un resultado positivo en la cura de alguna enfermedad. (Bellet et al., 2012)

Las grandes industrias empezaron a identificar cada vez más, diferentes plantas con este potencial curativo y fue allí en 1992 , dónde se realizó el análisis al género Chromolaena, a las especies C. odorata, C. hirsute y C. moritziana y se evaluó la actividad de cada una de ellas entre estas están su actividad pesticida, repelente, antiprotozoaria, insecticida, tripanocida, antibacterial, antimicobacterial, citotóxica, antioxidante, mutagénica, de proliferación de keratocitos humanos y proliferación de fibroblastos entre otras. (Irobi, 2000)

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En el año 2000 investigadores de la Universidad de Port Harcourt, de la facultad de ciencias, del departamento de bioquímica de Nigeria identificaron el perfil químico de la C. odorata. (Orjuela, 2015)

Luego, en el año 2001 un grupo de profesionales del Hospital de Singapore, del departamento de cirugía plástica y del departamento de farmacia de la universidad nacional de Singapore y del Laboratorio Jodrell, Jardín Botánico Real de Kew, Surrey, de Inglaterra, conformado por Toan-Thang, hallaron los compuestos fenólicos de C. odorata que pueden proteger las células de la piel cultivada del daño oxidativo: Implicaciones para la curación de heridas cutáneas. (Orjuela, 2015)

Posteriormente desde los años 2003, 2004 y el 2006 Taleb-Contin, estudio las propiedades de dos diferentes especies de Chromolaena, la C. Squalida y la C. Hirsuta, e identifico las propiedades antimicrobianas y antioxidantes. (Orjuela, 2015)

En el 2007 un grupo de estudiantes del Federal University of Technology, Nigeria, conformado por Akinmoladun, desarrollaron un proyecto sobre los constituyentes fitoquímicos y propiedades antioxidantes de las hojas de C. odorata. (Orjuela, 2015)

Por consiguiente, a finales del 2010 un grupo de estudiantes del instituto de Roland de ciencias farmacéuticas, de Berhampur, India, conformado por K. Srinivasa Rao, evaluaron la actividad antioxidante tola del contenido de compuesto fenólicos de la C. odorata por el ensayo de TEAC (capacidad antioxidante equivalente a Trolox). (Orjuela,

2015)

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MARCO TEÓRICO

Está claro que las plantas cumplen un papel importante en el buen funcionamiento del planeta, estas proporcionan oxígeno a la atmosfera, actúan de sumideros de CO2, regulan la temperatura, la humedad ambiental, sujetan los suelos, suponen la cadena alimenticia, puesto que son capaces de fabricarse su propio alimento a partir de la luz del sol, el aire y sales minerales.

Los metabolitos primarios presentes en las especies vegetales son: carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos, ácidos nucleicos, aminas, clorofilas e intermediarios metabólicos de las vías anabólicas y catabólicas, los que a su vez producen metabolitos secundarios, que son sustancias que no participan de forma directa en el crecimiento o desarrollo, es decir, sustancia que no son necesarias para que un organismo pueda existir como tal, sino que simplemente aportan al individuo que las produce una ventaja para responder a estímulos del entorno, ya sea como mecanismo de defensa contra predadores o como materia de almacenamiento. (Bellet et al., 2012)

Algunos metabolitos secundarios solo están presentes en determinadas especies y cumplen una función ecológica específica, como por ejemplo atraer a los insectos para transferirle el polen, o animales para que estos consuman sus frutos y así poder diseminar sus semillas; también puede actuar como pesticidas naturales de defensa contra herbívoros o microorganismos patógenos, también pueden sintetizar metabolitos secundarios en respuesta a dalo en algún tejido de la planta, así como contra la luz UV y otros agentes físicos agresivos. (Oranday et al., 2016)

5.1 Familia Asteraceae

La familia Asteraceae o Compositae, con aproximadamente 24000 especies, es de amplia distribución y es considerada como la familia de plantas con el mayor número de especies descritas por Funk (2009). Las Asteraceae suelen ser más abundantes en zonas montañosas y áridas, mientras que son más escasas en las selvas tropicales

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bajas. Bremer (1994) señala que las Asteraceae comprenden 1535 géneros agrupados en 17 tribus y tres subfamilias, mientras que la clasificación recientemente propuesta por Funk en el año 2009, basada en caracteres morfológicos y moleculares, reconoce 1600- 1700 géneros, 43 tribus y doce subfamilias. (Díaz et al., 2014)

5.1.1 Hábitat

La familia está distribuida en todo el planeta, por lo tanto, está considerada como cosmopolita, donde las especies de esta gran familia se encuentran desde zonas frías, templadas, sub-tropicales, hasta zonas tropicales. Se encuentran especialmente en regiones áridas, semiáridas abiertas y regiones montañosas de latitudes tropicales. (Díaz et al., 2014)

5.1.2 Género Chromolaena

El género Chromolaena pertenece a la tribu Eupatorieae y a la subtribu Praxelinae y comprende cerca de 170 especies distribuidas entre el nivel del mar y 3900 m de altitud y desde el sur de Estados Unidos hasta el sur de Argentina, con mayor concentración de especies en Brasil. Entre las especies que se destacan por su amplia distribución están C. laevigata, C. ivifolia y C. odorata, siendo esta última la única especie introducida en África y Asia. (Díaz et al., 2014)

5.1.3 Etimología

Chromolaena proviene del griego chroma que significa color y laina que significa capa, lo cual hace referencia a las filarias coloreadas observadas en algunas especies del género. (Orjuela, 2015)

5.2 Usos del género Chromolaena

En la siguiente tabla se relacionan los usos comunes de algunas especies del género Chromolaena:

Usos del género Chromolaena

C. leivensis

Utilizada en Cundinamarca como diurético o en remedios caseros anticancerígenos y contra la sífilis.

C. odorata

Utilizada en Nariño como remedio para el paludismo, en el Cauca se emplea para quitar

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dolores neurálgicos; para ello se toma en infusión o se realizan masajes sobre la parte del cuerpo adolorida, en San Andrés Islas con las hojas se prepara un té que se toma para el dolor del cuerpo o del estómago y en el Huila se toma en infusión como descongestionante y se utiliza además como cataplasma antirreumática.

C. tacotana

Es considerada como una hierba medicinal ya que sus hojas machacadas con agua y aplicadas sobre una herida tienen acción coagulante, específicamente en el Huila esta especie es utilizada para calmar el dolor de estómago, dolores bajos (matriz) y la vaginitis.

C. subscandens

En Cundinamarca se utiliza para aliviar las inflamaciones.

C. bullata

Se identificó que un flavonoide (CB2) induce la activación de células dendríticas humanas, este proceso es fundamental para identificar y determinar si este flavonoide posee actividad antitumoral o inmunorreguladora. Tabla 1. Propiedades Género Chromolaena. (Fuente: Díaz et al., 2014)

5.3 Propiedades químicas de las Chromolaenas

Como se ha mencionado anteriormente se han realizado diferentes estudios de las especies del género Chromolaena los cuales se muestran en la siguiente tabla:

Estructura y nombre Tipo Fuente

β-farneseno Sesquiterpenoide

C. arnottiana

C. pseudoinsignis

C. corymbosa

Fitol Diterpenoide

C. pseudoinsignis

C. christieana

OH

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Ácido ferúlico Ácido hidroxicinámico

C. odorata.

Ácido protocatéquico Ácido hidroxicinámico

Estigmasterol Triterpenoide

C. chasleae

C. christieana

5,7-dihidroxichalcona Chalcona

C. chasleae

5,7-dihidroxiflavanona Flavanona

C. chasleae

5,7-dihidroxi-6 –metoxi-flavanonol Flavanonol

C. chasleae

5,6,7,4’,5’-pentametoxiflavona Flavona

C. heteroclinium

5,4’,5’-trihidroxi -7-metoxiflavonol Flavonol

C. meridensis

Tabla 2. Ejemplos de metabolitos secundarios aislados de especies del género Chromolaena (Fuente: Orjuela, 2015) O H OH O OH O H O O OH O H O O OH OH O C H3 CH3 C H3 O O O O O C H3 C H3 O O CH3 O O O OH O H C H3 OH OH

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5.4 CHROMOLAENA SCABRA

Arbusto con hojas opuestas, las cuales tienen forma algo triangular. Un par de venas secundarias nacen cerca de la base de cada hoja y corren más o menos paralelas al borde de ésta (curvinervias). Venación terciaria muy marcada, reticulada. Los "canasticos" que sostienen las flores tienen forma estrecha y alargada, siendo más largos que los de otras asteráceas similares. Flores de color morado-rosado, con "hilos" (estilos) que sobresalen de ellas. (Díaz et al., 2014)

Imagen 1. Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob recolectada el municipio de Sibaté (Cundinamarca). (fuente: Autores)

5.4.1 Descripción taxonómica

Reino Plantae Phylum Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Asterales Familia Asteraceae Género Chromolaena Epíteto específico Scabra

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Autor (L. f.) R.M. King & H. Rob.

Tribu Eupatorieae Género Chromolaena Especie Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob.

5.4.2 Etimología

El epíteto proviene del latín scaber = escabroso o rugoso, en alusión a la textura de las hojas por el haz. (Universidad Nacional de Colombia , 2016)

5.4.3 Nombres vernáculos

“Chilca” (Cundinamarca), “Chilquita carrasposa” (Cundinamarca). (Díaz et al., 2014)

5.4.4 Hábitat

C. scabra crece en el borde de ríos y quebradas, a orilla de carreteras y caminos, en

claros de bosque, robledales, bosque nublado o muy húmedo, a orilla de carreteras, en selvas húmedas y abiertas, matorrales, rastrojos, potreros, bosque de cañada o valle húmedo. (Díaz et al., 2014)

5.4.5 Distribución

En Colombia se registra en la región Andina en los departamentos de Antioquia, Boyacá, Caldas, Cauca, Cundinamarca, Huila, Nariño, Norte de Santander, Putumayo, Quindío, Risaralda, Santander, Tolima y Valle, entre los 1503-3500 m. Un registro aislado se presenta en la región Caribe en el departamento del Magdalena, sobre los

2600 m. (Universidad Nacional de Colombia , 2016)

5.5 PREPARACIÓN DE EXTRACTOS

Para analizar las propiedades de la planta en estudio se utilizó la extracción por soxhlet que es un proceso de extracción continua de un material solido que contiene algunos de los compuestos deseados, se coloca dentro de un dedal de papel filtro grueso, que se carga en la cámara principal del extractor soxhlet donde se hace pasar el solvente, este ciclo puede repetirse muchas veces, durante horas o días. (Nuñez , 2008 )

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5.6 RADICALES LIBRES

Los radicales libres (RL) o más modernamente llamados especies reactivas de oxígeno (ERO) son átomos o moléculas que contienen uno o más electrones no pareados en el orbital más externo, lo que produce una gran reactividad en dicha estructura. De hecho, esto da lugar a que estos RL intervengan con gran eficacia y rapidez en un sinnúmero de procesos bioquímicos a nivel celular. Su gran reactividad es al final de cuentas la causante de su toxicidad. Normalmente las ERO no son más que metabolitos fisiológicos, pero en ciertas condiciones o estados propios de la actividad del hombre en relación con su medio, la producción de estos compuestos puede incrementarse en forma considerable, rompiéndose entonces el equilibrio que debe existir entre estos y sus rivales o contrapartes los antioxidantes corporales. (Lima, 2010) 5.6.1 Clases RL.

Los más estudiados en el momento son:

• El radical hidroxilo: OH*

• El radical superóxido: O2*

• El radical Óxido nítrico: NO*

5.6.2 Consecuencias de la acumulación de radicales libres. Las consecuencias del exceso de radicales libres en el organismo, afectan directamente nuestro estado de salud de la siguiente forma:

• Envejecimiento

• Problemas en el sistema cardiovascular

• Problemas en el sistema nervioso

• Cáncer

5.7 ESTRÉS OXIDATIVO

No hay que confundir este mecanismo celular con el estrés cotidiano derivado de las problemáticas que enfrenta el organismo humano en su vida diaria (trabajo, familia,

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trámites, entre otras). El estrés oxidativo es un término asociado a las células y a la acción de un radical libre que le afecta, así en condiciones normales se da un equilibrio entre la producción de radicales libres u otras especies reactivas con los mecanismos antioxidantes (exógeno y endógeno). Este equilibrio permite que la toxicidad por oxidación sea menor y con menos daño celular. Cuando se rompe el equilibrio, éste se podrá asociar con un déficit en el sistema antioxidante o por la proliferación descontrolada de los radicales libres. (Coronado et al., 2015)

Ilustración 1. Causas y consecuencias del estrés oxidativo. (Fuente: Benito et al., 2014)

5.8 ANTIOXIDANTES

Son sustancias que cuando están presentes retardan o inhiben la oxidación de sustratos susceptibles al ataque de las ERO. Los agentes antioxidantes exógenos son aquellos que se ingieren a través de la alimentación y desde el punto de vista práctico son los más importantes de todos, ya que son los únicos que pueden ser introducidos al organismo de forma voluntaria por cada persona. (Festy, 2007)

Los antioxidantes pueden actuar por distintos mecanismos y a distintos niveles de la cadena de oxidación:

• Disminuyendo la cantidad de oxígeno.

• Previniendo el inicio de reacciones en cadena mediante la inactivación de

radicales libres (OH*).

• Por unión de iones metálicos.

• Por descomposición de peróxidos a productos no–radicales.

• Interfiriendo en las reacciones en cadena (ej. fenoles).

• Reparación del daño (ej. reparación del ADN).

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• Por varios mecanismos de acción.

5.8.1 Clases de antioxidantes.

5.8.1.1 Antioxidantes de la membrana celular.

Debido a la doble característica de la membrana celular, hidrofóbica en el interior e hidrofilica en el exterior, se requiere de diferentes tipos de antioxidantes: moléculas liposolubles en el interior de la membrana e hidrosolubles en la parte externa. (Anonimo , s.f)

5.8.1.2 Antioxidantes extracelulares.

Se han descrito en los líquidos celulares algunas variantes de enzimas que actúan a este nivel. Diferentes proteínas atrapadoras de iones metálicos y compuestos de bajo peso molecular, y proteínas con actividad oxidación-reducción (redox). (Anonimo , s.f)

Ilustración 2. Clasificación de los sistemas antioxidantes. (Fuente: Anonimo , S.f)

5.9 MÉTODOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlado. Según Clarkson en el año 1995, la medición de una muestra oxidante, pueden usarse intermediarios o productos finales para valorar la actividad antioxidante. (Tovar del Rio ,

2013)

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Con base a las reacciones químicas, la gran mayoría de los ensayos para determinar de capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categorías:

Ilustración 3. Mecanismos de reacción por transferencia de electrones y transferencia de átomos de hidrogeno (Fuente: Tovar del Rio , 2013) Los ensayos basados en la transferencia de electrones (ET) involucran una reacción redox con el oxidante como un indicador del punto final de reacción. La mayoría de los ensayos basados en HAT monitorean una reacción cinética competitiva, generalmente están compuestos de un generador de radical libre sintético, una prueba molecular oxidable y un antioxidante. Los ensayos basados en HAT y ET fueron desarrollados para medir la capacidad de atrapar radicales libres, en lugar de la capacidad preventiva antioxidante de una muestra.

ENSAYO

CATEGORÍA

Ácido 2,2′-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico Ph(ABTS*+) Ensayos basados en la transferencia de electrones (ET) 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH*) Poder de reducción antioxidante del hierro (FRAP) N, N- dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CUPRAC) Capacidad de absorción del radical oxígeno (ORAC.) Ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP). Inhibición de la oxidación del ácido linoleico. Inhibición de la oxidación de los lípidos de baja densidad

(LDL).

Tabla 3. Clasificación de los modelos de ensayo in vitro según su modo de reacción ET o HAT. (Fuente: Tovar del Rio , 2013)

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5.10 MÉTODO DPPH* (2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo)

Ilustración 4. Estructura química del radical libre meta estable DPPH*. (Fuente: Londoño, 2012)

Este ensayo fue propuesto originalmente por Brand–Williams. El DPPH* es uno de los pocos radicales orgánicos estable, presenta una fuerte coloración violeta, es comercialmente disponible y no tiene que ser generado in situ como el ABTS*+. El ensayo se fundamenta en la medición de la capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical DPPH*, esta medición puede hacerse espectrofotométricamente siguiendo el decaimiento de la absorbancia a 517 nm. La reacción de estabilización se considera que transcurre principalmente mediante un mecanismo TE, con un aporte marginal de TAH. (Londoño, 2012)

.

Ilustración 5. Estructura del DPPH* antes y después de la reacción con el antioxidante. (Fuente: Tovar del Rio , 2013)

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Los resultados del ensayo DPPH* se han presentado de diferentes maneras. La mayoría de los estudios expresan los resultados como el valor de la concentración máxima de la media inhibitoria (IC50), definido como la cantidad de antioxidante necesario para disminuir la concentración inicial de DPPH* al 50%. Este valor se calcula graficando el porcentaje de inhibición contra la concentración del extracto. Para extractos de plantas o compuestos puros el valor IC50 cambia de acuerdo a la concentración final del DPPH* usado. (Tovar del Rio , 2013)

5.11 MÉTODO ABTS (AZINOBIS 3-ETILBENZOTIAZOLINA-6-ACIDO SULFÓNICO)

Ilustración 6. Estructura química del ABTS*+. (Fuente: Londoño, 2012)

Este método fue reportado inicialmente por Miller y colaboradores, y se fundamenta en la capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical catión coloreado ABTS*+, el cual es formado previamente por la oxidación del ABTS (2,2´-azinobis (3etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico)) por meta mioglobina y peróxido de hidrógeno. Los resultados son expresados como equivalentes de Trolox o TEAC (por su nombre en inglés, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). (Londoño, 2012)

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Ilustración 7. Estructura del ABTS*+ antes y después de la reacción con el antioxidante. (Fuente: Tovar del Rio , 2013)

La capacidad antioxidante se calcula como el porcentaje de captación DPPH* y ABTS*+, por la siguiente formulada:

Ecuación 1. % Captación DPPH* Y ABTS*+ Donde A inicial es la absorbancia de control a tiempo 0 min y A final es la absorbancia del antioxidante a tiempo 10 min.

5.12 DETERMINACIÓN ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

A través del ensayo con plantas que se han realizado en los últimos años se ha podido corroborar la existencia de propiedades químicas las cuales ayudan frente a inhibición de crecimiento de algunos agentes externo al cuerpo humano, a continuación, presentamos la información de los microorganismos que se utilizaron para este trabajo junto con la revisión bibliográfica.

% Captación = A inicial−A final A inicial x 100

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5.13 MICROORGANISMOS EMPLEADOS ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA.

5.13.1 Staphylococcus aureus.

Ilustración 8. Microscopia Staphylococcus aureus (Fuente: Cervantes et al,, 2014) Es una bacteria anaerobia (no utiliza oxígeno en su metabolismo), Gram positiva, que es capaz de producir coagulasa y catalasa. Esta bacteria está ampliamente distribuida por todo el mundo y puede producir una amplia gama de enfermedades que van desde infecciones cutáneas y de las mucosas a otras como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis. En algunos casos pueden llegar a producir enfermedades de riesgo vital como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía. (Cervantes et al., 2014)

Se considera un patógeno con gran potencial para causar múltiples infecciones en el ser humano y en los animales. Es considerada la más virulenta, responsable de un amplio espectro de enfermedades, que van desde infecciones de la piel y tejidos blandos hasta infecciones graves que pueden amenazar la vida. El impacto de las cepas de Staphylococcus aureus sobre la salud es la resistencia que puede presentar a múltiples antibióticos, sobre todo a la meticilina. (Instituto de Higiene , 2006 )

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5.13.1.1

Taxonomía

Reino: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Bacillales Familia: Staphylococcaceae Género: Staphylococcus.

5.13.2 Eschericha coli.

Ilustración 9. Microscopia Eschericha coli (Fuente: Cervantes et al., 2014)

La Escherichia coli, es una bacteria Gram negativa que habita en el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente. Existen muchas cepas de esta bacteria, pero tan sólo algunas de ellas pueden causar enfermedades en el ser humano. Existen muchas cepas de E. coli, muchas de ellas inofensivas, pero algunas como la E. coli O157:H7 produce una poderosa toxina, llamada Shiga, que puede originar enfermedades graves. (Instituto de Higiene , 2006 )

La cubierta de E. coli consta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico constituido por péptidoglucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su forma y rigidez, lo que le

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permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente elevadas. (Fundación vasca para la seguridad agroalimentaria, 2015)

5.14 MICROORGANISMOS EMPLEADOS ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA.

5.14.1 Aspergillus niger

Ilustración 10. Microscopia Aspergillus niger (Fuente: González et al., 2013) Es un hongo que produce un moho negro en vegetales muy común en la lechuga, el tomate, acelga y limón.

Es una de las especies más corrientes del género Aspergillus. El Aspergillus es un género de alrededor de 200 hongos. Puede existir en dos formas básicas: levaduras e hifas. El Aspergillus es filamentoso (compuesto de cadenas de células, llamadas hifas, el tipo de hongos opuesto a las levaduras, que se componen de una sola célula redonda). En 1729 los catalogó por primera vez el biólogo italiano Micheli. (Atlas de identificación Micológica, 2016) El Aspergillus niger frecuentemente aparece luego de infecciones en el oído humano y a veces infecta los pulmones en personas que tienen su sistema inmunológico debilitado. La infección por Aspergillus, también llamada aspergilosis, puede aparecer ocasionalmente en cualquier órgano o sistema de órganos del cuerpo humano.

La correcta identificación de la infección, ya sea por A. niger o cualquier otro hongo invasor, es importante para determinar cómo tratarlo. El A. niger es tóxico al ingerirlo y las frutas, vegetales o granos infectados pueden producir intoxicación alimentaria si se

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ingiere en dosis únicas, o cáncer cuando el consumo es crónico. También algunas personas son alérgicas al A. niger. (Atlas de identificación Micológica, 2016)

5.14.2 Penicillium digitatum.

Ilustración 11. Microscopia Penicillium digitatum (Fuente: González et al., 2013)

Es un patógeno típico de heridas, saprofito y ataca al fruto en el campo, predominantemente, puede comenzar su desarrollo, inicialmente como una tenue vegetación esponjosa con aspecto de filtro, los esporangios, de color blanco, pero que cambia rápidamente a una coloración entre verde amarillenta y verde oliva.

5.14.2.1

Características Macroscópicas

• Las colonias de Penicillium son de crecimiento rápido filamentoso, vellosas,

lanosas o de textura algodonosa.

• Son inicialmente blancas y luego se convierten en verde azuladas, gris verdosas,

gris oliva, amarillentas o rosadas con el tiempo.

• El reverso de la colonia es pálido o amarillento.

• Pueden presentar exudados en la superficie. (Sistema nacional Argentino de

Vigilancia y Monitoreo de plagas, 2010 )

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5.15 MEDIOS DE CULTIVOS UTILIZADOS PARA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

5.15.1 Agar PDA.

Medio de cultivo Agar de Dextrosa y Papa es conocido como PDA por sus siglas en inglés, tiene la infusión de papa como fuente de almidones y la dextrosa son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. El bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando se va a usar para el recuento de hongos y levaduras, se agrega al medio de cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a 45ºC, 14 ml de una solución estéril de ácido tartárico al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. (Productos y Equipos Biotecnológicos, S.A. DE C.V , 2017) 5.15.2 Agar MUELLER HINTON.

El medio Mueller Hinton posee una concentración baja de iones divalentes y debe ser suplementado para obtener concentraciones fisiológicas (20 a 35 µg/litro de Mg2+ y 50 a

100 µg/litro Ca2+). Este medio es el recomendado por la NCCLS porque en él crecen

bien la mayor parte de las bacterias patógenas, El pH del medio debe ajustarse entre 7,2-7,4, debe almacenarse a 2-8ºC y utilizarse dentro de los 7 días siguientes a su preparación. El medio debe dejarse a temperatura ambiente unas dos horas antes de utilizarlo. Si existe agua en la superficie del agar, las placas pueden colocarse en la incubadora a 35ºC durante unos 30 minutos con la tapa ligeramente entreabierta. (Rodríguez, 2013)

5.16 MÉTODO DE DIFUSIÓN EN PLACA

Como procedimientos de ensayo se recurre a los métodos de dilución y de difusión en placa, en los que este último ha sido el método más comúnmente utilizado para este tipo de pruebas, empleando la técnica de cilindros, pocillos, o pequeños discos con determinadas concentraciones del antibiótico. Dicha técnica se fundamenta en lo siguiente:

Como se observa en la ilustración 12 el medio de cultivo se siembra con la correspondiente cepa microbiana de ensayo vertido en cajas, sobre el medio de cultivo,

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en puntos adecuadamente distanciados a ensayar y del antibiótico se utilizan pequeños cilindros, pocillos o perforaciones practicadas en el medio de cultivo. Durante la incubación se produce alrededor de los puntos de aplicación del antibiótico, unos halos de inhibición exentos de crecimiento microbiano y cuyo diámetro constituye una medida relativa de la actividad del antibiótico en cuestión. Comparando el diámetro de los halos de inhibición del patrón de antibióticos con el del antibiótico sometido a ensayo, puede calcularse la actividad de este último. (Castellanos & Pedraza, 2009)

Ilustración 12. Esquema de los halos de inhibición formados por el método de difusión en gel. (Fuente: Castellanos & Pedraza, 2009)

De acuerdo a la medida del diámetro del halo de inhibición se puede, entonces, establecer si la cepa bacteriana en estudio es sensible o resistente a ese antibiótico o al extracto. Los halos de inhibición y su relación con la clasificación en sensible y resistente se establecen mediante la realización de una curva de regresión que relaciona las CIM.

Una vez se realicen las lecturas se grafica el logaritmo natural de la masa del extracto o antibiótico utilizado contra el cuadro del diámetro de inhibición, se traza la recta y el

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punto de intersección con el eje de las ordenadas que corresponde al valor de la masa crítica como se observa en la ilustración 13. (Castellanos & Pedraza, 2009) Ilustración 13. Grafica log concentración vs Longitud del halo (x2) (Fuentes: Castellanos & Pedraza, 2009)

6

OBJETIVOS

6.1 General

Establecer la actividad antioxidante y antimicrobiana de los extractos de Hojas y Flores de la especie Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob.

6.2 Específicos

Determinar la actividad antioxidante de hojas y flores de la especie Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob por método de Barrido de Radicales Libres – DPPH* y Decoloración del Radical ABTS*+.

Determinar la actividad antibacteriana de los extractos de hojas y flores de la especie Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob frente a las bacterias S. aureus y E. Coli.

Determinar la actividad antifúngica de los extractos de hojas y flores de la especie Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob frente a los hongos Aspergillus niger y Penicillium digitatum.

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7

METODOLOGÍA

La presente investigación se desarrolló en diferentes etapas nombradas a continuación:

7.1 RECOLECCIÓN Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Diagrama 1. Resumen de trabajo para el estudio del material vegetal C.scabra (Fuente: Autores)

Como se muestra en el diagrama 1 se realizó la salida de campo para la respectiva recolección del material vegetal en la vía entre Sibaté y Fusagasugá exactamente en la vereda conocida como la aguadita, se toman dos muestras de plantas diferentes en estado de floración para corroborar la muestra objetivo, se envía al Herbario Nacional de Colombia una muestra de cada planta para su debida identificación taxonómica, donde una de las muestras fue identificada como Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob., con número de colecta 592820. Con la respectiva identificación se procedió a secar el material vegetal a temperatura ambiente (20°C), luego se realiza separación de hojas-flores y se trituraron en molino de cuchillas obteniendo el tamaño de partícula óptimo para su extracción por el método Soxhlet (solido-liquido).

Selección material vegetal:

Chromolaena scabra (L. f.) R.M. King & H. Rob Recolección manual:

Municipio Sibaté (Cundinamarca) Se separa una muestra testigo que se envió al Herbario para obtener el registro taxonómico y un código de la planta.

Las hojas y flores fueron las partes de la planta que se seleccionaron para los diferentes ensayos.

Se secaron las hojas y flores de la planta a temperatura ambiente.

Después de obtener el respectivo secado del material vegetal se paso por un molino de cuchillas en el cual se obtuvo un tamaño de partícula adecuado.

Se realiza Extracción (Soxhlet) Solido – Liquido con solventes de polaridad creciente (éter de petróleo, diclorometano y etanol) Extractos listos para iniciar los diferentes ensayos.

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A continuación, se adjuntan imágenes representativas para el trabajo:

Imagen 4. Material vegetal C. scabra (Flores) en su respectivo proceso de molienda (Fuentes: Autores)

Imagen 5. Extracción de hojas equipo Soxhlet (Fuente: Autores)

Imagen 2. Material vegetal C. scabra (Hojas) previamente separado. (Fuente Autores) Imagen 3. Material vegetal C. scabra (Flores) previamente separado. (Fuente Autores)

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7.2 Obtención de los extractos de éter de petróleo, etanol y diclorometano de

hojas y flores de C. scabra.

Los extractos de la planta en estudio fueron obtenidos en los laboratorios de la Pontificia Universidad Javeriana. La extracción se inició con el material vegetal previamente secado y molido, teniendo una cantidad inicial de 600g de hojas y 400g de flores secas molidas de C. scabra, este material vegetal se ingresó al equipo Soxhlet, donde se realizó la extracción Sólido-Líquido, durante 8 días, a temperatura de ebullición según el solvente (Éter de petróleo, diclorometano y etanol) y, al completar los ciclos correspondientes de este proceso, se pasan los extractos a concentrar en el rotavaporador donde se recuperó el solvente y se obtuvo el extracto deseado.

En el diagrama 2 se ilustran los pasos que se desarrollaron para la obtención final de los extractos.

Diagrama 2. Descripción del proceso para obtención de extractos de C. scabra (Fuente: Autores)

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A partir de los extractos obtenidos se procede a realizar los diferentes ensayos, a continuación, se describirá de qué forma se realizó cada una de las determinaciones tanto de actividad antioxidante como de actividad antimicrobiana.

7.3 ENSAYOS ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Se analizó la actividad antioxidante de C. scabra por el método de decoloración con el radical catiónico ABTS*+ (Acido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) y por el ensayo de decoloración de radicales DPPH* (método del radical 1,1-difenil- 2−picrilhidrazilo).

7.3.1 Metodología desarrollada para el ensayo DPPH*

7.3.1.1 Preparación de soluciones patrón.

Para la preparación del radical DPPH*: Se disolvieron 2 mg de DPPH* Sigma-Aldrich, en 100 mL de metanol grado reactivo, la solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 24 horas en la oscuridad. Posteriormente fueron preparadas soluciones de trabajo hasta obtener una absorbancia de 0.750 ± 0.050 para todos los casos, a una longitud de onda de 517 nanómetros.

Para la preparación del ácido ascórbico, se preparó una solución stock de 100 miligramos por litro de Metanol disolviendo 10 mg de ácido ascórbico, en 100 mL de metanol, luego se prepararon diluciones de concentraciones de 2, 3, 3.5, 7 y 8 mg/Litro de metanol con el fin de realizar la curva de referencia.

Preparación de rutina, Se preparó una solución stock 100 miligramos por litro de metanol disolviendo 10 mg de rutina, en 100 mL de metanol, luego se prepararon diluciones con rangos de concentración de 3, 5, 10, 20 y 30 mg/Litro de metanol, con el fin de realizar la curva de referencia.

7.3.1.2 Preparación de la curva de referencia.

A una celda de vidrio de volumen reducido se agregó un volumen final de 1 mL de los patrones utilizados (ácido ascórbico y rutina) más radical DPPH* necesario para llegar a

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porcentajes de captación entre 10% y 95%, la medición se realizó a 517 nm; el porcentaje de captación se calculó con base en la siguiente ecuación:

Ecuación 2. % Captación DPPH*

El porcentaje de captación representa el cambio de color purpura a amarillo del radical DPPH*, cuando le es agregado un compuesto antioxidante, disminuyendo así la absorbancia de la solución, que es medida a 517 nm; la absorbancia inicial se toma en el minuto cero sin adición del antioxidante patrón, la toma de datos de absorbancia se realiza cada 30 segundos durante 10 minutos después de agregar el antioxidante patrón.

7.3.1.3 Medición de la actividad antioxidante de los extractos de hojas y flores C. scabra.

Para realizar la evaluación de la actividad antioxidante de cada una de los extractos de hojas de C. scabra, se siguieron los pasos descritos a continuación:

A una celda de vidrio de 1,5 mL se mezcló cada uno de los extractos de la planta C. scabra más radical DPPH* para un volumen final de 1 ml y lectura en espectrofotómetro a 517 nm. Para ello se preparan soluciones stock, a una concentración de 1000 miligramos por litro de metanol. De cada muestra se realizaron diluciones de 10, 25, 50,

100 150 y 200 miligramos por litro de metanol para determinar las concentraciones

necesarias para obtener porcentajes de captación del 10% al 95%.

Se procede a medir la absorbancia del DPPH* (solo), la cual se conoce como absorbancia inicial, luego se procedió a realizar la mezcla entre el DPPH* y los diferentes extractos, se mide la absorbancia cada 30 segundos por 10 minutos de la mezcla anterior para determinar la capacidad antioxidante. % Captación DPPH*= A inicial−A final A inicial x 100

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7.3.2 Metodología desarrollada para el ensayo ABTS*+.

7.3.2.1 Preparación de soluciones patrón.

En la Preparación del radical ABTS*+, Se disolvieron 50 mg de (ABTS*+) la sal diamonica del 2,2-Azino-bis(3-etIlbenzotiazolina-6-sulfonico) de Sigma-Aldrich, en 50 mL de agua desionizada, luego se adicionaron 2,45 mg de persulfato de potasio (K2S2O8), la solución se dejó reaccionar a una temperatura de 3°C durante 48 horas en la oscuridad posteriormente fueron preparadas soluciones de trabajo hasta obtener una absorbancia de 0.750 ± 0.050 para todos los casos, a una longitud de onda de 754 nanómetros.

Para el Trolox: Se preparó una solución stock 100 miligramos por litro de metanol disolviendo 10 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carboxílico 97% (Trolox) de ACRŌS ORGANIC, en 100 mL de metanol, luego se prepararon diluciones con rangos de concentración entre 1, 2, 2.5 y 3 miligramos por litro de metanol, con el fin de realizar la curva de referencia.

Preparación de Rutina, Se preparó una solución stock 100 miligramos por litro de Metanol disolviendo 10 mg de rutina, en 100 mL de metanol, luego se prepararon diluciones con rangos de concentración entre 3, 5, 10 y 20 miligramos por litro de metanol, con el fin de realizar la curva de referencia.

Preparación de ácido ascórbico, se preparó una solución stock 100 miligramos por litro de metanol disolviendo 10 mg de ácido ascórbico (Vitamina C), en 100 mL de metanol, luego se prepararon diluciones de 1, 2, 2.5 y 3 miligramos por litro de metanol, con el fin de realizar la curva de referencia.

7.3.2.2 Preparación de la curva de referencia.

A una celda de vidrio de 1,5 mL se agrega de forma independiente para un volumen final de 1 ml (ácido ascórbico, rutina y trolox) más radical ABTS*+ y lectura en

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espectrofotómetro a 754 nm, necesario para obtener porcentaje de captación entre 10% y 95%,

% de captación de ABTS = A inicial −A final A inicial x 100 Ecuación 3. % captación ABTS.

El porcentaje de captación representa el cambio de color azul-verde del radical ABTS*+, cuando le es agregado un compuesto antioxidante, disminuyendo así la absorbancia de la solución, que es medida a 754 nm; la absorbancia inicial se toma en el minuto cero sin adición de ningún patrón, la toma de datos de absorbancia se realiza cada 30 segundos durante 10 minutos después de agregar el antioxidante patrón.

7.3.2.3 Medición de la actividad antioxidante de los extractos de hojas y flores de

C. scabra

Para realizar la evaluación de la actividad antioxidante de cada una de los extractos de hojas de C. scabra, se siguieron los pasos descritos a continuación: A una celda de vidrio de 1,5 mL se agrega para un volumen final de 1 mL mezcla de cada uno de los extractos de la planta C. scabra más radical ABTS*+ la medición se realiza a 517 nm. Para ello se preparan soluciones stock, a una concentración de 1000 miligramos por litro de metanol. De cada muestra se realizaron diluciones de 50, 100

150 y 200 miligramos por litro de metanol para determinar las concentraciones

necesarias para obtener porcentajes de captación del 10% al 95%.

Se procede a medir la absorbancia del ABTS*+, la cual se conoce como absorbancia inicial. Después se procedió a realizar la mezcla entre el ABTS*+ y el extracto, sobre la cual se realizó la evaluación de la capacidad antioxidante. Las absorbancias de la mezcla del ABTS*+ y el extracto de C. scabra, se midieron cada 30 segundos durante 10 minutos.

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7.4 ENSAYO ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

7.4.1 Actividad antibacteriana.

Los microorganismos empleados en la determinación de la actividad antibacteriana en este estudio proceden de las denominadas cepas de control, de acuerdo a la clasificación de la American Type Culture Collection (ATCC). Para bacterias Grampositivas se utilizó como microorganismo indicador Staphylococcus aureus (ATCC 6538); y para Gram-negativas, Escherichia coli (ATCC 8739).

Se empleó el método de difusión en gel por perforación en placa, utilizando como medio de crecimiento bacteriano el agar Mueller Hinton, para la preparación del agar se pesaron 34 gramos agar, luego se diluyeron en 1,0 L de agua estéril, se envía la mezcla más los demás instrumentos a autoclave durante 1 hora.

Para la preparación del inóculo fueron transferidos con asa bacteriológica de ocho a diez colonias del microorganismo, a un tubo con 3 – 4 mL con solución salina 0.85% p/v, formando una suspensión de la bacteria en el caldo, que debe tener una turbidez similar a la del patrón 5 en el nefelómetro de Mac Farland (1,5 x 109 u.f.c/mL). El inóculo obtenido por este procedimiento fue sembrado masivamente con hisopo en cajas de Petri con el agar Mueller Hinton preparado anteriormente, que luego fue perforado realizando 4 pozos para la evaluación del extracto.

Como control positivo del ensayo realizado con Staphylococcus aureus se utilizó el antibiótico rifampicina, preparado con 1 mg disuelto en 2 mL de DMSO (equivalente a 0,5 mg/ mL DMSO), para la prueba se utilizaron volúmenes de 10 l (0,005 mg de rifampicina), 20 l (0.01 mg de rifampicina), 30 l (0.015 mg de rifampicina) y 50 l (0,025 mg de rifampicina).

Para preparar las muestras de los extractos se toman 200 mg de extracto y se disuelve en 1 mL de DMSO (200 mg/mL DMSO), para evaluar la actividad se tomaron

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 50

volúmenes de 20 µL (4 mg de extracto), 30 µL (6 mg de extracto), 40 µL (8 mg de extracto) y 60 µL (12 mg de extracto).

Como se observa en la ilustración 14 las muestras del control positivo y los diferentes extractos fueron depositadas en los pozos realizados en el agar Mueller Hinton. Se incubaron las cajas de Petri a 37° C, durante un periodo de 24 horas. La medición de los halos se realizó al final del periodo de incubación para obtener los datos y de esta manera realizar las diferentes gráficas para analizar los resultados del ensayo.

Ilustración 14. Distribución de las muestras en la caja de Petri para la determinación de la actividad antibacteriana. (Fuente: Autores)

Imagen 6. Agar Mueller Hinton. (Fuente:

Autores) Imagen 7. Cajas de Petri para ensayos antimicrobianos. (Fuente: Autores)

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7.4.2 Actividad antifúngica.

Los microorganismos empleados en la determinación de la actividad antifúngica en este estudio proceden de las denominadas cepas de control, de acuerdo a la clasificación de la American Type Culture Collection (ATCC). Para hongos Aspergillus niger y Penicillium digitatum se empleó el método de difusión en gel por perforación en placa, utilizando como medio de crecimiento el agar PDA (dextrosa papa), para la preparación del agar se pesaron 39 gramos que se diluyeron en 1,0 L de agua estéril, se envía la mezcla más los demás instrumentos a autoclave durante 1 hora.

Para la preparación del inóculo se tomó una parte del hongo la cual fue transferida a un tubo con 3 – 4 mL con solución salina 0.85% p/v. El inóculo obtenido por este procedimiento fue sembrado masivamente con hisopo en cajas de Petri con el agar PDA preparado anteriormente, que luego fue perforado realizando 1 pozos para la evaluación del extracto y 4 pozos para los controles positivos.

Como control positivo del ensayo realizado con A. niger y P. digitatum se utilizó el antimicótico fluconazol y ketoconazol que se preparó empleando 2 mg disueltos en 5 mL de DMSO (equivalente a 0,4 mg/mL DMSO), se utilizaron en los pozos volúmenes de 10 µL (0,004 mg de fluconazol o ketoconazol), 20 µL (0,008 mg fluconazol o ketoconazol), 30 µL (0,012 mg de fluconazol o ketoconazol) y 40 µL (0,016 mg fluconazol o ketoconazol)

Se evaluó la actividad de extractos de hojas y flores obtenidos con solvente de polaridad creciente (éter de petróleo, diclorometano y etanol), estos se prepararon con

200 mg disueltos en 1 mL de DMSO (200 mg/mL DMSO), se evaluaron volúmenes de

50 µL (10 mg de extracto) y 100 µL (20 mg de extracto).

Los volúmenes del control positivo fueron depositados según la ilustración 14 y los diferentes extractos fueron depositados según la ilustración 15. Se incubaron las cajas

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 52

de Petri a 22° C, durante un periodo de 10 días. La medición de los halos se realizó al final del periodo de incubación para obtener los datos y de esta manera realizar las diferentes gráficas para analizar los resultados del ensayo.

Ilustración 15. Distribución de las muestras en la caja de Petri para la determinación de la actividad antifúngica. (Fuente: Autores)

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Diagrama 3. Resumen metodología. Fuente: (Autores)

Se muestra en el diagrama 3 un resumen de la metodología empleada para esta investigación referente a los ensayos de determinación antioxidante y antimicrobiana de los extractos de hojas y flores de C. scabra como lo explicamos detalladamente en la metodología.

8

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para la elaboración de gráficas y curvas se realizaron 5 ensayos por cada determinación y finalmente se graficaron solo los datos relevantes para nuestra investigación a continuación se encontrarán los resultados de cada uno de los ensayos elaborados.

Para determinar el rendimiento de cada uno de los extractos se aplicó la siguiente ecuación:

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% 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜= 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑀𝑎𝑠𝑎 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙∗100 Ecuación 4 % Rendimiento extracto. Los porcentajes de rendimiento de los extractos por cada solvente se relacionan en la siguiente tabla:

Parte de la planta Extracto Peso Final (Gramos) %Rendimiento extracto Hojas Éter de petróleo

34,57

5,76

Diclorometano

37,68

6,28

Etanol

31,07

5,18

Extracto Peso Final (Gramos) %Rendimiento extracto Flores Éter de petróleo

33,51

8,38

Diclorometano

51,09

12,77

Etanol

33,40

8,35

Tabla 4. Cantidad obtenida de extracto por cada Solvente. (Fuente: Autores)

8.1 RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS DIFERENTES

EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES DE C. scabra.

Imagen 8. Ensayo ABTS*+ (Fuentes: Autores)

Imagen 9. Ensayo DPPH* (Fuentes: Autores)

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8.1.1 Ensayo de decoloración del radical 1-1-Difenil-2-Picrilhidrazilo (DPPH*).

La actividad antioxidante de decoloración del radical DPPH* se determinó de acuerdo a los parámetros establecidos en el numeral 7.3.1.

8.1.1.1 Preparación de la curva de referencia.

Los resultados de la medición del % de captación de DPPH* se encuentran en la tabla 5 y 6.t 5 y 6

Concentración mg/ L MeOH A inicial A final % de captación de DPPH*

2

0,776

0,485

37,51 +/-0,191

3

0,786

0,349

55,53 +/-0,142

3,5

0,786

0,299

61,97 +/-0,122

7

0,790

0,110

86,08 +/-0,043

8

0,836

0,050

94,02 +/-0,021 Tabla 5. Porcentaje de Captación del radical DPPH* empleando Ácido ascórbico (Fuente: Autores)

Partiendo de los datos obtenidos del porcentaje de captación del radical DPPH* causado por el ácido ascórbico, se construyó una curva de referencia (Grafica 1) que permite verificar la dependencia logarítmica del % de captación del radical DPPH* Vs la concentración del ácido ascórbico obteniéndose un R2 de 0,9962, el cual nos permite calcular el porcentaje de concentración efectiva 50 (IC50) por medio de la ecuación de la gráfica 1.

Al igual que con el ácido ascórbico se realizó la curva de referencia con la rutina, siguiendo los datos de la tabla 6, y se realizó la curva de referencia (Grafica 2) que permite verificar la dependencia logarítmica del porcentaje de captación del radical vs la concentración de la rutina en miligramos por litro de metanol, obteniéndose un R2 de 0,9825, el cual nos permite calcular el porcentaje de captación por medio de la ecuación de la gráfica 3.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 56

Concentración mg/ L MeOH A inicial A final % de captación de DPPH*

3

0,698

0,513

26,50 +/-0,092

5

0,690

0,432

37,39 +/-0,134

10

0,692

0,254

63,29 +/-0,221

20

0,673

0,137

79,64 +/-0,272

30

0,692

0,106

84,68 +/-0,294 Tabla 6. Porcentaje de captación del radical DPPH* empleando Rutina (Fuente: Autores)

8.1.2 Ensayo de decoloración del radical 2,2-Azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-

sulfonico (ABTS*+).

La metodología desarrollada para el método de decoloración del radical ABTS*+, se determinó de acuerdo a los parámetros establecidos en el numeral 7.3.2 de este documento.

8.1.2.1 Preparación de la curva de referencia

Los resultados de la medición del % de captación de ABTS*+se encuentran en la tabla 7, 8 y 9.

Concentración mg/ L MeOH A inicial A final % de captación de

ABTS*+

1

0,651

0,594

8,76 +/-0,029

2

0,653

0,339

48,09 +/-0,157

2,5

0,642

0,167

73,99 +/-0,238

3

0,647

0,044

93,20 +/-0,302 Tabla 7. Porcentaje de captación del radical ABTS*+ empleando Ácido Ascórbico (Fuente: Autores)

Debido a que se va a evaluar la capacidad antioxidante de extractos vegetales, se realiza la curva de referencia con ácido ascórbico (Grafica 3), que permite verificar la dependencia logarítmica del % de captación del radical ABTS*+ vs la concentración del ácido ascórbico obteniendo un R2 de 0,9683.

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Concentración mg/ L MeOH A inicial A final % de captación de

ABTS*+

3

0,698

0,413

40,83 +/-0,143

5

0,690

0,332

51,88 +/-0,179

10

0,692

0,154

77,75 +/-0,269

20

0,673

0,037

94,50 +/-0,318 Tabla 8. Porcentaje de captación del radical ABTS*+ empleando Rutina (Fuente: Autores)

Al igual que con el ácido ascórbico se realizó la curva de referencia grafica 4 con la rutina, partiendo de los datos de la (tabla 8), que permite verificar el porcentaje de captación del radical ABTS*+ vs la concentración de la rutina obteniéndose un R2 de

0,9903.

Concentración mg/ L MeOH A inicial A final % de captación de

ABTS*+

1

0,643

0,537

16,49 +/-0,053

2

0,643

0,393

38,88 +/-0,125

2,5

0,647

0,291

55,02 +/-0,178

3

0,646

0,222

65,63 +/-0,212 Tabla 9. Porcentaje de captación del radical ABTS*+ empleando Trolox (Fuente: Autores)

Al igual que con el ácido ascórbico y la rutina se realizó la curva de referencia (grafica

5) con el trolox, partiendo de los datos de la (tabla 9), que permite verificar el porcentaje

de captación del radical ABTS*+ vs la concentración del trolox obteniéndose un R2 de

0,9644.

8.1.3 Coeficiente de inhibición (IC50) DPPH* Y ABTS*+.

El coeficiente de Inhibición (IC50) se calcula con la ecuación de la recta, la cual se obtiene de la curva de referencia de cada patrón analizado (ácido ascórbico y rutina) para el método de decoloración del radical DPPH*. Para el método de decoloración del radical ABTS*+ se utilizaron ácido ascórbico, rutina y trolox. Para calcular el IC50 se sustituye (y) por 50, y así calculamos la concentración, o mediante un análisis de regresión del porcentaje de captación de DPPH* o porcentaje de inhibición del radical

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ABTS*+, vs la concentración necesaria de los extractos, para inhibir el 50% del radical DPPH* o ABTS*+

8.1.3.1 IC50 Ácido Ascórbico DPPH*.

Según la curva de referencia del ácido ascórbico (Gráfica 1) da una ecuación: y= 39,254 ln(x) + 11,518 y un R2 = 0,9962.

Grafica 1. Curva de referencia del porcentaje de captación de DPPH* vs concentración de ácido ascórbico (Fuente: Autores) 𝑒𝑥= 50−(11,518)

39,254

Debido a que la curva se basa en el logaritmo de la concentración, el resultado obtenido el ácido ascórbico es de 0,980 mg/L MeOH.

8.1.3.2 IC50 Rutina DPPH*.

Según la curva de referencia de la Rutina (Gráfica 2), da una ecuación: y= 26,707lnx - 2,63 y un R2 = 0,9825.

y = 39,254ln(x) + 11,518 R² = 0,9962

25

35

45

55

65

75

85

95

105

1

2

3

4

5

6

7

8

% Captación DPPH* Concentración (mg/L MeOH)

CURVA DE REFERENCIA DEL PORCENTAJE DE CAPTACIÓN DE

DPPH* VS CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO

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Grafica 2. Curva de referencia del porcentaje de captación de DPPH* vs concentración de Rutina (Fuente: Autores)

𝑒𝑥= 50−(−2,63)

26,707

Debido a que la curva se basa en el logaritmo de la concentración, el resultado obtenido para la de Rutina es: 1,970 mg/L MeOH.

8.1.3.3 IC50 Ácido Ascórbico ABTS*+.

Según la ecuación de la recta, de la (gráfica 3) y = 74,746lnx + 5,4029 y un R2: 0,9683.

Grafica 3. Curva de referencia del porcentaje de captación del radical ABTS*+ vs concentración de Ácido ascórbico (Fuente: Autores)

y = 26,707ln(x) - 2,63 R² = 0,9825

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1

6

11

16

21

26

31

% Captación DPPH* Concentración (mg/L MeOH)

CURVA DE REFERENCIA DEL PORCENTAJE DE CAPTACIÓN DE

DPPH* VS CONCENTRACIÓN RUTINA

y = 74,746ln(x) + 5,4029 R² = 0,9683

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

% Captación ABTS*+ Concetración (mg/L MeOH)

CURVA DE REFERENCIA DEL PORCENTAJE DE CAPTACIÓN DEL

RADICAL ABTS *+ VS CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO

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En la gráfica anterior se observa el comportamiento del acido ascorbico, 𝑒𝑥= 50−(5,4029)

74,746

Debido a que la curva se basa en el logaritmo de la concentración, el resultado obtenido del ácido ascórbico es de 0,596 mg/L MeOH.

8.1.3.4 IC50 Rutina ABTS*+.

Según la gráfica 4, la curva de referencia de la rutina da la ecuación de la recta: y= 29,361lnx + 7,472, y un R2 de 0,9903.

Grafica 4. Curva de referencia del porcentaje de captación del radical ABTS*+ vs concentración de Rutina (Fuente: Autores)

𝑒𝑥= 50−(7,472)

29,361

Debido a que la curva se basa en el logaritmo de la concentración, el resultado para el IC50 de la rutina es de 1,45 mg/L MeOH.

8.1.3.5 IC50 Trolox ABTS*+.

Según la gráfica 5 la curva de referencia de la rutina da la ecuación de la recta: y= 43,69lnx + 14,427 y un R2 de 0,9644 y = 29,361ln(x) + 7,472 R² = 0,9903

35

45

55

65

75

85

95

105

1

3

5

7

9

11

13

15

17

19

21

% Captación de ABTS *+ Concentración (mg/L MeOH)

CURVA DE REFERENCIA DEL PORCENTAJE DE CAPTACIÓN DEL

RADICAL ABTS*+ VS CONCENTRACIÓN RUTINA

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Grafica 5. Curva de referencia del porcentaje de captación del radical ABTS*+ v/s concentración de Trolox (Fuente: Autores) 𝑒𝑥= 50−(14,427)

43,69

Debido a que la curva se basa en el logaritmo de la concentración, el resultado para el IC50 del Trolox es de 0,814 mg/L MeOH.

8.1.4 Actividad antioxidante de los extractos de hojas de C. scabra

La actividad antioxidante fue evaluada para los extractos de hojas obtenidos de los solventes de diferentes polaridades (éter de petróleo, diclorometano y etanol), en diferentes concentraciones 10, 25, 50, 100, 150 y 200 mg/L MeOH), mediante la aplicación del método decoloración del radical DPPH*. Para este método observamos que hay tendencia de mayor actividad antioxidante a medida que aumenta la concentración en las soluciones de trabajo de los extractos. Concentración Hojas de Chromolaena Scabra Extracto Petrol Hojas de Chromolaena scabra Extracto Diclorometano Hojas de Chromolaena Scabra Extracto Etanol mg/ L MeOH

10

-

24,14 +/-0,092 29,22 +/-0,109

25

-

48,93 +/-0,184 46,39 +/-0,174

50

17,81 +/-0,070 65,23 +/-0,242 66,13 +/-0,248

100

27,87 +/-0,106 75,67 +/-0,283 83,95 +/-0,319

150

34,77 +/-0,133

-

-

200

45,27 +/-0,182

-

-

Tabla 10. Porcentaje de Captación del radical DPPH* de extractos de hojas C. scabra (Fuente: Autores) y = 43,69ln(x) + 14,427 R² = 0,9644

10

20

30

40

50

60

70

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

% Captación ABTS*+ Concentración (mg/L MeOH)

CURVA DE REFERENCIA DEL PORCENTAJE DE CAPTACIÓN DEL

RADICAL ABTS*+ VS CONCENTRACIÓN DE TROLOX

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 62

Comparando los resultados del ensayo realizado para el extracto de hojas por el método DPPH* (Gráfica 6) podemos evidenciar que a concentraciones de 50 y 100 mg/L MeOH (Tabla 10) el extracto éter de petróleo tiene menor % de captación del radical DPPH* obteniendo un % de 17,8 y 28 mg/L MeOH, se observa que el extracto diclorometano y etanol presentaron un comportamiento mayor a concentración de 50 y

100 mg/L MeOH arrojando el % de captación de diclorometano en 65,2% y de etanol

en 66,1% a concentración de 50 mg/L MeOH, a concentración de 100 mg/L MeOH obtuvo un % de captación de 75,7% diclorometano y 83,9% etanol siendo este el extracto con mayor actividad frente al radical DPPH*

Grafica 6. % captación DPPH* vs extracto hojas C. scabra (Fuente: Autores) 8.1.5 Actividad antioxidante de los extractos de flores de C. scabra.

La actividad antioxidante fue evaluada para los extractos de flores obtenidos de los solventes de diferentes polaridades (éter de petróleo, diclorometano y etanol) en diferentes concentraciones 10, 25, 50, 100, 150 y 200 miligramos por litro MeOH, mediante la aplicación del método decoloración del radical DPPH*. Para este método observamos que hay tendencia de mayor actividad antioxidante a medida que aumenta la concentración en las soluciones de trabajo de los extractos.

17,8

28,0

65,2

75,7

66,1

83,9

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

50ppm 100ppm % Captación DPPH* Concentración (mg/L MeOH) % CAPTACIÓN RADICAL DPPH* vs CONCENTRACIONES EXTRACTOS HOJAS DE C. scabra Extracto éter de petróleo Extracto diclorometano Extracto etanol

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Concentración mg/ L MeOH Flores de Chromolaena Scabra Extracto Petrol Flores de Chromolaena scabra Extracto Diclorometano Flores de Chromolaena scabra Extracto Etanol

10

-

17,20 +/-0,064 18,48 +/-0,068

25

-

23,66 +/-0,088 29,57 +/-0,110

50

12,87 +/-0,048 32,10 +/-0,121 40,92 +/-0,151

100

23,67 +/-0,089 45,44 +/-0,170 61,79 +/-0,228

150

31,72 +/-0,122 62,90 +/-0,234

-

200

34,28 +/-0,127

-

-

Tabla 11. Porcentaje de Captación del radical DPPH* de extractos de flores C. scabra (Fuente: Autores) Comparando los resultados del ensayo realizado para el extracto de flores por el método DPPH* (Grafica 7) podemos evidenciar que a concentraciones de 50 y 100 mg/L MeOH (Tabla 11) el extracto éter de petróleo tiene menor % de captación del radical DPPH* obteniendo un % de 12, 9% y 23,7% mg/L MeOH ,se observa que el extracto diclorometano y etanol presentaron un comportamiento mayor a concentración de 50 y 100 mg/L MeOH arrojando el % de captación de diclorometano en 32,1% y de etanol en 45,4% a concentración de 50 mg/L MeOH, a concentración de 100 mg/L MeOH se obtuvo un % de captación de 40,9% diclorometano y 61,8% etanol siendo este el de mayor actividad frente al radical DPPH*

También se observa (tabla 11) que a concentracion de 150 mg/L MeOH el extracto diclorometano obtiene un % de captacion de DPPH* de 62,9% y eter de petroleo un 31, 7% , comparando estos dos extractos se observa que el extracto diclorometano tiene un mayor % de captacion de DPPH*.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 64

Grafica 7. % captación DPPH* vs extractos flores de C. scabra (Fuente: Autores)

8.1.6 Actividad antioxidante de los extractos de hojas de C. scabra.

La actividad antioxidante fue evaluada para los extractos obtenidos con los solventes de diferentes polaridades (éter de petróleo, diclorometano y etanol) en diferentes concentraciones (50, 100, 150 y 200 mg/L MeOH), mediante la aplicación del método decoloración del radical ABTS*+. Para este método observamos que hay tendencia de mayor actividad antioxidante a medida que aumenta la concentración en las soluciones de trabajo de los extractos.

Concentración mg/L MeOH Hojas de Chromolaena scabra Extracto Petrol Hojas de Chromolaena scabra Extracto Diclorometano Hojas de Chromolaena scabra Extracto Etanol

50

6,78 +/-0,023 33,43 +/-0,115 31,83 +/-0,110

100

21,63 +/-0,073 51,16 +/-0,176 60,36 +/-0,216

150

36,02 +/-0,123 66,13 +/-0,228 83,61 +/-0,304

200

43,27 +/-0,148 77,02 +/-0,267 94,04 +/-0,324 Tabla 12. Porcentaje de Captación del radical ABTS*+ de extractos de hojas C. scabra (Fuente: Autores)

12,9

23,7

32,1

45,4

40,9

61,8

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

50ppm 100ppm % Captación DPPH* Concentración (mg/L MeOH)

% CAPTACIÓN RADICAL DPPH * VS CONCENTRACIONES

EXTRACTOS FLORES C. Scabra.

Extracto éter de petróleo Extracto diclorometano Extracto etanol

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Comparando los resultados del ensayo realizado para el extracto de hojas por el método ABTS*+ (Grafica 8) podemos evidenciar que los extractos diclorometano y etanol presentaron mayor % de captación de dicho radical, a diferencia del extracto éter de petróleo el cual presento menor % de captación a las mismas concentraciones es decir que este presenta baja actividad antioxidante frente al radical ABTS*+(Tabla 12), en este caso el extracto con mayor actividad es etanol hojas a concentración de 200 mg/L MeOH y obteniendo 94,0 % de captación ABTS*+.

Grafica 8. % captación ABTS*+ vs extractos hojas de C. scabra (Fuente: Autores)

8.1.7 Actividad antioxidante de los extractos de flores de C. scabra.

La actividad antioxidante fue evaluada para los extractos de flores C. scabra obtenidos de los solventes de diferentes polaridades (éter de petróleo, etanol y diclorometano), en diferentes concentraciones (50, 100, 150 y 200 mg/L MeOH), mediante la aplicación del método decoloración del radical ABTS*+. Para este método observamos que hay tendencia de mayor actividad antioxidante a medida que aumenta la concentración en las soluciones de trabajo de los extractos.

6,8

21,6

36,0

43,3

33,4

51,2

66,1

77,0

31,8

60,4

83,6

94,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

50

100

150

200

% Captación ABTS*+ Concentración (mg/L MeOH) % CAPTACIÓN RADICAL ABTS *+ vs CONCENTRACIONES EXTRACTOS HOJAS C. Scabra Extracto éter de petróleo Extracto diclorometano Extracto etanol

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Concentración mg/ L MeOH Flores de Chromolaena scabra Extracto Petrol Flores de Chromolaena scabra Extracto Diclorometano Flores de Chromolaena Scabra.

Extracto Etanol

50

5,65 +/-0,021 15,86 +/-0,059 22,98 +/-0,086

100

10,78 +/-0,040 27,01 +/-0,101 39,33 +/-0,148

150

17,02 +/-0,060 46,60 +/-0,172 56,62 +/-0,210

200

23,59 +/-0,088 53,59 +/-0,202 70,56 +/-0,263 Tabla 13. Porcentaje de Captación del radical ABTS*+ de extractos de Flores C. scabra (Fuente: Autores) Comparando los resultados del ensayo realizado para el extracto de flores por el método ABTS*+ (Grafica 9) podemos evidenciar que los extractos diclorometano y etanol presentaron mayor captación de dicho radical, a diferencia del extracto éter de petróleo el cual presento menor % de captación a las mismas concentraciones, en este caso el extracto con mayor actividad fue etanol flores a concentraciones de 150 y 200 mg/L MeOH y obteniendo 56,6% y 70,6 % de captación ABTS*+.

Grafica 9. % captación ABTS*+ vs extractos flores de C. scabra (Fuente: Autores)

5,6

10,8

17,0

23,6

15,9

27,0

46,6

53,6

23,0

39,3

56,6

70,6

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

50

100

150

200

% Captación ABTS*+ Concentración (mg/L MeOH)

% CAPTACIÓN RADICAL ABTS *+ VS CONCENTRACIONES

EXTRACTOS FLORES C. Scabra Extracto éter de petróleo Extracto diclorometano Extracto etanol

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8.1.8 Concentración inhibitoria 50 (IC50) de extractos hojas y flores de C. scabra, por el ensayo de decoloración del radical 1-1-Difenil-2-Picrilhidrazilo

(DPPH*)

Partiendo de las gráficas dé % captación de DPPH* vs concentración de extractos de hojas y flores de C. scabra, se obtuvo las ecuaciones de las curvas las cuales se utilizaron para calcular el IC50 de cada extracto (hojas y flores) y de esta manera comparar cual extracto tubo un mayor coeficiente de inhibición. En la tabla 14 se observa los IC50 de los extractos evaluados.

Extracto IC50 (Miligramos / Litro MeOH) Éter de petróleo hojas

296,85

Diclorometano hojas

28,66

Etanol hojas

25,60

Éter de petróleo flores

509,09

Diclorometano flores

106,85

Etanol flores

65,42

Ácido ascórbico

2,67

Rutina

7,18

Tabla 14. IC50 de extractos de hojas y flores C. scabra, calculados por el método de decoloración del radical DPPH*. (Fuente: Autor)

Analizando los resultados obtenidos de IC50 se observó que los extractos de hojas presentaron mayor concentración inhibitoria 50, dando como resultado, para el extracto diclorometano 28,66 mg/L MeOH y para etanol 25,60 mg/L MeOH siendo este el de mejor resultado para este ensayo.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 68

Grafica 10. IC50 de extractos hojas y flores de C. scabra y patrones calculados por el método de decoloración DPPH* (Fuente: Autores) 8.1.9 Concentración inhibitoria 50 (IC50) de extractos hojas y flores de C. scabra, por el ensayo de decoloración con el radical catiónico 2,2-Azino-bis-3etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS*+).

Partiendo de las gráficas dé % captación de ABTS*+ vs concentración de extractos de hojas y flores de C. scabra, se obtuvo las ecuaciones de las curvas las cuales se utilizaron para calcular el IC50 de cada extracto (hojas y flores) y de esta manera comprar cual extracto tubo un mayor coeficiente de inhibición. En la tabla 15 se observa los IC50 de los extractos evaluados.

Extracto IC50 (mg/ L MeOH) Éter de petróleo hojas

262,49

Etanol hojas

75,58

Diclorometano hojas

88,67

Éter de petróleo flores

1927,86

Etanol flores

119,59

Diclorometano flores

183,41

Ácido ascórbico

1,82

Rutina

4,26

Trolox

2,26

Tabla 15. IC50 de extractos hojas y flores C. scabra y patrones calculados por el método de decoloración del radical ABTS*+ (Fuente: Autores)

28,66

25,60

106,85

65,42

2,67

7,18

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Diclorometano hojas Etanol hojas Diclorometano flores Etanol flores Ácido Áscorbico Rutina Concentración (mg/L MeOH) IC50 C. scabra DE EXTRACTOS HOJAS, FLORES Y PATRONES POR

EL MÉTODO DPPH*

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 69

Grafica 11. IC50 de extractos hojas y flores de C. scabra y patrones calculados por el método de decoloración ABTS*+ (Fuente: Autores)

Analizando los resultados obtenidos de IC50 se observó que los extractos de hojas presentaron mayor concentración inhibitoria 50, dando como resultado, para el extracto diclorometano 88,67 mg/L MeOH y para etanol 75,58 mg/L MeOH siendo este el de mejor resultado para este ensayo.

8.1.10 Actividad antioxidante relativa (AAR)

La actividad antioxidante relativa (AAR), de extractos de hojas y flores de C. scabra frente al método decoloración del radical DPPH* se calculó con la siguiente ecuación: 𝐴𝐴𝑅= IC 50 Muestra Analizada IC 50 Muestra Patron

Ecuación 5. Actividad antioxidante relativa.

75,58

88,67

119,59

183,41

2,26

1,82

4,26

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

Concentración (mg/L) MeOH IC50 C. scabra DE EXTRACTOS HOJAS, FLORES Y PATRONES POR EL

MÉTODO ABTS*+

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 70

Observando los datos de la tabla 16 se tiene como resultado que para los extractos de hojas la mejor actividad antioxidante relativa es etanol hojas con un valor de 9,6 AAR comparado con el ácido ascórbico, y comparado con la rutina el valor es de 3,6 AAR; para los extractos de flores la mejor actividad antioxidante relativa es etanol flores presentando un 24,5 AAR comparado con ácido ascórbico y 9,1 AAR comparado con rutina.

Extracto AAR Ácido Ascórbico AAR Rutina Éter de petróleo hojas

111,4

41,4

Diclorometano hojas

10,8

4,0

Etanol hojas

9,6

3,6

Éter de petróleo flores

191,0

70,9

Diclorometano flores

40,1

14,9

Etanol flores

24,5

9,1

Tabla 16. AAR de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método de decoloración del radical DPPH* (Fuente: Autores)

Grafica 12. Actividad antioxidante relativa de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método DPPH* (Fuente: Autores)

10,8

9,6

40,1

24,5

1,0

2,7

4,0

3,6

14,9

9,1

0,4

1,0

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

Diclorometano hojas Etanol hojas Diclorometano flores Etanol flores Ácido Áscorbico Rutina AAR DE EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES DE C. Scabra

CALCULADOS POR EL MÉTODO DPPH*

AAR Ácido ascórbico AAR Rutina

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 71

En la gráfica 12 podemos observar que por el método de decoloración de DPPH* para el patrón ácido ascórbico los extractos que presentaron mayor actividad antioxidante relativa son: etanol hojas con 9,6 AAR y diclorometano hojas con 10,8 AAR, el extracto que presento menor actividad antioxidante relativa fue diclorometano flores con 40,1

AAR.

Para el patrón Rutina los extractos que presentaron mayor actividad antioxidante relativa son: etanol hojas con 3,6 AAR y diclorometano hojas con 4,0 AAR, el extracto que presento menor actividad antioxidante relativa fue diclorometano flores con 14,9

AAR.

Comparando los dos patrones empleados se observa en la gráfica 12 que los resultados que se obtienen por rutina son más bajos respecto a ácido ascórbico. El AAR de una sustancia a menor valor presenta mayor capacidad antioxidante. 8.1.11 Actividad antioxidante relativa (AAR).

La actividad antioxidante relativa de los extractos para el método de decoloración del radical ABTS*+, se calculó con la formula anteriormente descrita. Observando la tabla

17 se tiene como resultado, para los extractos de hojas, etanol presentó mejor actividad

antioxidante relativa con resultados de 41,6 AAR comparado con ácido ascórbico, 17,8 AAR comparado con rutina y 33,5 AAR comparado con trolox; para los extractos de flores etanol presento resultados de 65,9 AAR comparado con ácido ascórbico, 28,1 AAR comparado con rutina y 53,0 AAR comparado con trolox.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 72

Extracto AAR Ácido Ascórbico AAR Rutina AAR Trolox Éter de petróleo hojas

144,5

61,7

116,3

Diclorometano hojas

48,8

20,8

39,3

Etanol hojas

41,6

17,8

33,5

Éter de petróleo flores

1.061,6

452,9

854,0

Diclorometano flores

101,0

43,1

81,2

Etanol flores

65,9

28,1

53,0

Tabla 17. AAR extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método de decoloración del radical ABTS*+ (Fuente: Autores)

Grafica 13. Actividad antioxidante relativa de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por el método ABTS*+ (Fuente: Autores)

41,6

48,8

65,9

101,0

1,2

1,0

2,3

33,5

39,3

53,0

81,2

1,0

0,8

1,9

17,8

20,8

28,1

43,1

0,5

0,4

1,0

-

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

AAR DE EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES DE C. Scabra

CALCULADOS POR EL MÉTODO ABTS*+

AAR Ácido ascórbico AAR Trolox AAR Rutina

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 73

En la gráfica 13 podemos observar que por el método de decoloración ABTS*+ para el patrón ácido ascórbico el extracto que presento mayor actividad antioxidante relativa: es etanol hojas con 41,6 AAR, el extracto que presento menor actividad antioxidante relativa fue diclorometano flores con 101,0 AAR.

Para el patrón trolox el extracto que presento mayor actividad antioxidante relativa: es etanol hojas con 33,5 AAR, el extracto que presento menor actividad antioxidante relativa fue diclorometano flores con 81,2 AAR.

Para el patrón rutina el extracto que presento mayor actividad antioxidante relativa: es etanol hojas con 17,8 AAR, el extracto que presento menor actividad antioxidante relativa fue diclorometano flores con 43,1 AAR.

Comparando los tres patrones empleados se observa en la gráfica 13 que los resultados que se obtienen por rutina son más bajos respecto a ácido ascórbico y trolox. El AAR de una sustancia a menor valor presenta mayor capacidad antioxidante.

8.1.12 Comparación del IC50 de extractos de hojas y flores de C. scabra por los

métodos DPPH* y ABTS*+.

Se realiza la comparación de la concentración inhibitoria 50 (IC50) de la actividad antioxidante mediante los ensayos empleados para la presente investigación (tabla18), de los extractos de hojas y flores de C. scabra , para los extractos de hojas se determinó que el extracto que presenta mayor valor de IC50 por el método DPPH* es etanol teniendo 25,6 mg/L MeOH y para el método ABTS*+ es etanol teniendo 75,6 mg/L MeOH, de igual forma para los extractos de flores se determinó que el extracto que presenta mayor valor de IC50 por el método DPPH* es etanol teniendo 65,4 mg/L MeOH y para el método ABTS*+ es etanol teniendo 119,6 mg/L MeOH.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 74

Extracto

IC50 ABTS*+

(mg / L MeOH)

IC50 DPPH*

(mg / L MeOH) Éter de petróleo hojas

262,5

296,8

Diclorometano hojas

88,7

28,7

Etanol hojas

75,6

25,6

Éter de petróleo flores

1927,9

509,1

Diclorometano flores

183,4

106,9

Etanol flores

119,6

65,4

Tabla 18. Datos IC50 extractos hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ (Fuente: Autores)

Grafica 14. Comparación datos IC50 extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ (Fuente: Autores)

En la gráfica 14 se observa que los IC50 calculados por el método de decoloración del radical DPPH* presentan mayor concentración que los calculados por el método de decoloración del radical ABTS*+, siendo el método de ABTS*+ el más sensible. Se evidencia que el extracto con mejor actividad antioxidante es etanol hojas y diclorometano hojas por el método DPPH*.

88,7

75,6

183,4

119,6

28,7

25,6

106,9

65,4

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

Diclorometano hojas Etanol hojas Diclorometano flores Etanol flores Concentraciòn (mg/L MeOH) IC50 EXTRACTOS HOJAS Y FLORES C. scabra CALCULADOS POR LOS MÉTODOS DPPH* y ABTS*+

IC50 ABTS*+

IC50 DPPH*

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 75

8.1.13 Comparación de la actividad antioxidante relativa (AAR) de extractos de

hojas de C. scabra, calculados por los ensayos de DPPH* y ABTS*+ frente a ácido ascórbico.

Los resultados de actividad antioxidante relativa (AAR) comparado con el ácido ascórbico se relacionan en la siguiente tabla:

Extracto AAR Ácido ascórbico

ABTS*+

AAR Ácido ascórbico DPPH* Éter de petróleo hojas

144,5

111,4

Diclorometano hojas

48,8

10,8

Etanol hojas

41,6

9,6

Éter de petróleo flores

1061,6

191,0

Diclorometano flores

101,0

40,1

Etanol flores

65,9

24,5

Tabla 19.Datos Actividad Antioxidante Relativa (AAR) de extractos de hojas y flores C. scabra calculados por los ensayos DPPH* y ABTS*+ con respecto al ácido ascórbico (Fuente: Autores) En la gráfica15 se evidencia que el método de decoloración de radical DPPH* obtuvo mayores porcentajes de actividad antioxidante con respecto al método de decoloración del radical catiónico ABTS*+ con respecto al ácido ascórbico. Como lo mencionamos anteriormente el extracto etanol hojas y flores presenta mejor comportamiento frente a los otros extractos traduciendo esto como una actividad relativa excelente.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 76

Grafica 15.Comparación actividad antioxidante relativa (AAR) de extractos de hojas y flores de C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ frente ácido ascórbico (Fuente: Autores)

8.1.14 Comparación de la actividad antioxidante relativa (AAR) de extractos de

hojas de C. scabra, calculados por los ensayos de DPPH* y ABTS*+ frente rutina.

Los porcentajes de actividad antioxidante relativa (AAR) comparado con rutina se relacionan en la siguiente tabla:

Extracto AAR Rutina ABTS*+ AAR Rutina DPPH* Éter de petróleo hojas

61,7

41,4

Diclorometano hojas

20,8

4,0

Etanol hojas

17,8

3,6

Éter de petróleo flores

452,9

70,9

Diclorometano flores

43,1

14,9

Etanol flores

28,1

9,1

Tabla 20. Datos Actividad Antioxidante Relativa (AAR) de extractos de hojas y flores C. scabra calculados por los ensayos DPPH* y ABTS*+ con respecto a rutina (Fuente: Autores)

48,8

41,6

101,0

65,9

10,8

9,6

40,1

24,5

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

Diclorometano hojas Etanol hojas Diclorometano flores Étanol flores AAR DE EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES C. scabra CALCULADOS

POR LOS MÉTODOS DPPH* Y ABTS*+ FRENTE A ÀCIDO ASCORBICO

Ácido ascórbico ABTS*+ Ácido ascórbico DPPH*

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 77

En la grafica16 se evidencia que el método de decoloración de radical DPPH* obtuvo mayor actividad antioxidante relativa con respecto al método de decoloración de radical catiónico ABTS*+. Como lo mencionamos anteriormente el extracto de etanol hojas y flores presenta mejor comportamiento frente a los otros extractos traduciendo esto como una actividad relativa excelente.

Grafica 16.Comparación de los datos de actividad antioxidante relativa de extractos de hojas y flores de

C. scabra calculados por los métodos de DPPH* y ABTS*+ frente rutina (Fuente: Autores)

8.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE HOJAS Y FLORES DE C. scabra.

8.2.1 Actividad Antibacteriana.

Se relaciona a continuación los resultados de los extractos más representativos para los ensayos realizados para la determinación de la actividad antibacteriana de la planta en estudio. Se determinó que los extractos con alto potencial en la inhibición del crecimiento del microorganismo S. aureus fueron los extractos éter de petróleo flores y etanol hojas.

A continuación, se adjuntan algunas imágenes de las inhibiciones:

20,8

17,8

43,1

28,1

4

3,6

14,9

9,1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Diclorometano hojas Etanol hojas Diclorometano flores Etanol flores AAR DE EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES C. scabra CALCULADOS

POR LOS MÉTODOS DPPH* Y ABTS*+ FRENTE A RUTINA

AAR Rutina ABTS*+ AAR Rutina DPPH*

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 78

Imagen 10. Actividad antibacteriana del extracto diclorometano hojas frentes a S. aureus (Fuente: Autores)

.

Grafica 17. Masa crítica del extracto diclorometano hojas frente a S. aureus (Fuente: Autores)

y = 1,4048ln(x) - 8,1632 R² = 0,9634

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Ln masa del extracto X2 (mm2)

MASA CRÍTICA, EXTRACTO DICLOROMETANO HOJAS DE LA

ESPECIE C. scabra FRENTE A LA INHIBICIÓN DE S. aureus

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 79

mg Ln Diámetro Halo mm Halo X2 (mm2)

4

1,39

30

900

6

1,79

34

1156

8

2,08

40

1600

12

2,49

43

1849

Tabla 21. Diámetro de inhibición de crecimiento en milímetros con el extracto diclorometano hojas (Fuente: Autores)

Imagen 11. Actividad antibacteriana del extracto diclorometano flores frente a S. aureus (Fuente: Autores)

Grafica 18. Masa crítica del extracto diclorometano flores frente a S. aureus (Fuente: Autores)

y = 3,2692ln(x) - 20,181 R² = 0,9957

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

700

750

800

850

900

950

1000

1050

Ln masa del extracto X2 (mm2)

MASA CRÍTICA EXTRACTO DICLOMETANO FLORES DE LA

ESPECIE C. scabra FRENTE A LA INHIBICIÓN DE S. aureus

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 80

mg Ln Diámetro Halo mm Halo X2 (mm2)

4

1,39

27

729

6

1,79

29

841

8

2,08

30

900

12

2,49

32

1024

Tabla 22. Diámetro de inhibición de crecimiento en milímetros con el extracto diclorometano flores (Fuente: Autores)

Imagen 12. Actividad antibacteriana del extracto éter de petróleo flores frente a S. aureus (Fuente: Autores)

.

Grafica 19. Masa crítica del extracto éter de petróleo flores frente a S. aureus (Fuente: Autores)

y = 1,1042ln(x) - 5,5609 R² = 0,9385

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

450

550

650

750

850

950

1050

1150

1250

1350

Ln masa del extracto X2 (mm2)

MASA CRÍTICA EXTRACTO ÉTER DE PETRÓLEO FLORES DE LA

ESPECIE C. scabra FRENTE A LA INHIBICIÓN DE S. aureus

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 81

mg Ln Diámetro Halo mm Halo X2 (mm2)

4

1,39

23

529

6

1,79

28

784

8

2,08

34

1156

12

2,49

36

1296

Tabla 23. Diámetro de inhibición de crecimiento en mm con el extracto éter de petróleo flores (Fuente: Autores)

Grafica 20. IC50 extractos de hojas y flores de C. scabra frente a S. aureus (Fuente: Autores)

Como se observa en la gráfica 20 los extractos que presentan mejor actividad son el extracto etanolico de hojas con un valor de 85,8 mg y éter de petróleo de flores con un valor de 50,3 mg, esto quiere decir que estos extractos poseen una concentración significativa para la inhibición del microorganismo en estudio. Hay que tener en cuenta que son extractos y estos presentan muchos metabolitos en baja concentración en su composición, y así presentan actividad.

36,7

50,3

45,5

85,8

21,5

41,4

-

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Éter de petróleo hojas Éter de petróleo flores Etanol flores Etanol hojas Diclorometano flores Diclorometano hojas IC50 IC50 DE EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES DE C. scabra FRENTE A S. aureus

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 82

Grafica 21. ABR extractos hojas y flores de C. scabra y patrón frente a S. aureus (Fuente: Autores)

Como se observa en la gráfica 21 cuando comparamos con un patrón los extractos que tiene mayor concentración de inhibición frente al microorganismo S. aureus son: etanol hojas que equivale a 197,5 mg y el segundo extracto que posee un valor relevante en cuanto a inhibición es éter de petróleo flores que equivale a 336,7 mg cuando la concentración de la rifampicina es 1,0 mg, se realiza esta comparación para determinar qué cantidad de extracto se requiere para causar inhibición del crecimiento bacteriano del microorganismo equivalente al del patrón del cual se requiere menos cantidad por ser una sustancia pura con uso específico para el tratamiento de S. aureus.

461,4

336,7

372,6

197,5

789,2

409,2

1,0

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

800,0

900,0

1/IC50

ACTIVIDAD BACTERIANA RELATIVA DE EXTRACTOS DE HOJAS Y

FLORES DE C. scabra FRENTE A S. aureus

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 83

Realizando la comparación de los datos obtenidos en esta investigación con el escrito de García (2000) que expresa que, cuando la rifampicina tiene un halo de inhibición menor 16 mm es resistente a S.aureus y cuando tiene un halo de inhibición mayor a 20 mm es sensible a S.aureus, se expresa que cuando tenemos la rifampicina a concentración de 5 mg se obtiene un halo de inhibición de 34 mm obteniendo como resultado que el microorganismo S.aureus es sensible a esta concentración de ensayo.

Para los extractos de hojas de C. scabra, se obtienen datos de inhibición del crecimiento bacteriano en un rango de: éter de petróleo 18 mm a 25 mm, etanol 7mm a

17 mm y diclorometano 30 mm a 43 mm, dando como resultado que dichos extractos

que presentan gran cantidad de metabolitos en baja concentración este posee capacidad intermedia y sensible para la inhibición del crecimiento para el microorganismo en estudio.

Para los extractos de flores de C. scabra se obtienen datos de inhibición del crecimiento bacteriano en un rango de: éter de petróleo 23 mm a 36 mm, etanol 11 mm a 17 mm y diclorometano 27mm a 32 mm, dando como resultado que dichos extractos poseen una actividad intermedia y sensible para la inhibición del crecimiento para el microorganismo en estudio.

Se realizó este estudio con E. coli para determinar la inhibición del crecimiento, pero los extractos de hojas y flores de Chromolaena scabra (L.f.) R.M King & H. Rob frente a este microorganismo no presentaron actividad.

8.2.2 Actividad antifúngica.

Se relaciona a continuación las tablas 24 y 25 con los resultados de IC50 para cada uno de los extractos frente A. niger y P. digitatum.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 84

Extractos C. scabra frente A. niger IC50 Éter de petróleo hojas

64

Diclorometano hojas

43

Etanol hojas

60

Éter de petróleo flores

45

Diclorometano flores

36

Etanol flores

23

Tabla 24. IC50 extractos de hojas y flores C. scabra frente A. niger (Fuente: Autores)

Extractos C. scabra frente P. digitatum IC50 Éter de petróleo hojas

59

Diclorometano hojas

47

Etanol hojas

69

Éter de petróleo flores

190

Diclorometano flores

120

Etanol flores

74

Tabla 25. IC50 extractos de hojas y flores C. scabra frente P. digitatum (Fuente: Autores)

Grafica 22. IC50 de extractos de C. scabra frente A. niger (Fuente: Autores)

Como se observa en la gráfica 22 los extractos que tienen mejor concentración 50 son: éter de petróleo hojas con un valor de 64 mg y éter de petróleo flores con un valor de

64

45

60

23

43

36

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Éter de petroleo hojas Éter de petroleo flores Etanol hojas Etanol flor Diclorometano hojas Diclorometano flor IC50 IC50 EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES DE C. scabra FRENTE A. niger

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 85

45 mg, esto quiere decir que estos extractos poseen una concentración significativa

para la inhibición del microorganismo en estudio.

Grafica 23. IC50 extractos de C. scabra frente P. digitatum (Fuente: Autores)

Como se observa en la gráfica 23 los extractos que tienen mejor concentración 50 son: éter de petróleo flores con un valor de 190 mg y diclorometano flores con un valor de

120 mg, esto quiere decir que estos extractos poseen una concentración significativa

para la inhibición del microorganismo en estudio.

59

190

69

74

47

120

0

50

100

150

200

250

Éter de petroleo hojas Éter de petroleo flores Etanol hojas Etanol flores Diclorometano hojas Diclorometano flores IC50 IC50 EXTRACTOS HOJAS Y FLORES DE C. scabra FRENTE A P.

digitatum

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 86

Grafica 24. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (fluconazol) frente A. niger (Fuente: Autores)

Se observa en la gráfica 24 los extractos que tiene mayor concentración de inhibición frente al microorganismo A.niger : éter de petróleo hojas que equivale a 459,51 mg cuando la concentración del fluconazol es 1,0 mg, el segundo extracto que posee un valor relevante en cuanto a inhibición es etanol hojas que equivale a 490,14 mg cuando la concentración del fluconazol es 1,0 mg, se realiza esta comparación para determinar qué cantidad de extracto se requiere para causar inhibición del crecimiento del hongo referente al patrón.

459,51

653,52

490,14

1278,59

683,91

816,89

0,88

1,00

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1/IC50

ACTIVIDAD FUNGICA RELATIVA DE EXTRACTOS DE HOJAS Y

FLORES DE C. Scabra FRENTE A. niger RESPECTO A FLUCONAZOL

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 87

Grafica 25. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (ketoconazol) frente A. niger (Fuente: Autores)

Se observa en la gráfica 25 los extractos que tiene mayor concentración de inhibición frente al microorganismo A. niger éter de petróleo hojas que equivale a 520,90 mg cuando la concentración del ketoconazol es 1,0 mg, el segundo extracto que posee un valor relevante en cuanto a inhibición es etanol hojas que equivale a 555,63 mg cuando la concentración del ketoconazol es 1,0 mg, se realiza esta comparación para

520,90

740,84

555,63

1449,42

775,28

926,03

1,00

1,13

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

1200,00

1400,00

1600,00

1/IC50

ACTIVIDAD FUNGICA RELATIVA DE EXTRACTOS DE HOJAS Y FLORES

DE C. scabra FRENTE A.niger RESPECTO A KETOCONAZOL

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 88

determinar qué cantidad de extracto se requiere para causar inhibición del crecimiento del hongo referente al patrón

Grafica 26. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (fluconazol) frente P. digitatum (Fuente: Autores)

Se observa en la gráfica 26 los extractos que tiene mayor concentración de inhibición frente al microorganismo P. digitatum : éter de petróleo flores que equivale a 87,72 mg cuando la concentración del fluconazol es 1,0 mg, el segundo extracto que posee un valor relevante en cuanto a inhibición es diclorometano flores que equivale a 138,88 mg cuando la concentración del fluconazol es 1,0 mg, se realiza esta comparación para determinar qué cantidad de extracto se requiere para causar inhibición del crecimiento del hongo referente al patrón.

282,48

87,72

241,53

225,22

354,60

138,88

0,09

1,00

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

400,00

1/IC50

ACTIVIDAD FUNGICA RELATIVA DE EXTRACTOS DE HOJAS Y

FLORES DE C. scabra FRENTE A P.digitatum RESPECTO A

FLUCONAZOL

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 89

Grafica 27. AFR de extractos hojas y flores de C. scabra y patrón (ketoconazol) frente P. digitatum (Fuente: Autores)

Se observa en la gráfica 27 los extractos que tiene mayor concentración de inhibición frente al microorganismo P. digitatum : éter de petróleo flores que equivale a 941,18 mg cuando la concentración del fluconazol es 1,0 mg, el segundo extracto que posee un valor relevante en cuanto a inhibición es diclorometano flores que equivale a 1490,21 mg cuando la concentración del fluconazol es 1,0 mg, se realiza esta comparación para determinar qué cantidad de extracto se requiere para causar inhibición del crecimiento del hongo referente al patrón.

Para los extractos de hojas de C. scabra, se obtienen datos de inhibición del crecimiento fúngico frente A. niger de: éter de petróleo 40 y 46 mm, etanol 16 y 27 mm y diclorometano19 y 25 mm. Para los extractos de flores de C. scabra, se obtienen datos de inhibición del crecimiento fúngico frente A. niger de: éter de petróleo 21 y 27 mm, etanol 11 y 14 mm y diclorometano 20 y 24 mm.

3030,99

941,18

2591,57

2416,62

3804,80

1490,21

1,00

10,73

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

3500,00

4000,00

4500,00

1/IC50

ACTIVIDAD FÚNGICA RELATIVA DE EXTRACTOS DE HOJAS Y

FLORES DE C. scabra FRENTE A P.digitatum RESPECTO A

KETOCONAZOL

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 90

Para los extractos de hojas de C. scabra, se obtienen datos de inhibición del crecimiento fúngico frente P. digitatum de: éter de petróleo 31 y 38 mm, etanol 21 y 33 mm y diclorometano 31 y 35 mm. Para los extractos de flores de C. scabra, se obtienen datos de inhibición del crecimiento fúngico frente P. digitatum de: éter de petróleo 26 y 67 mm, etanol 46 y 63 mm y diclorometano 40 y 60 mm.

Tomando como referencia los artículos de Cuenca, 2002 y catalán, 2006 donde se expresa que los antigunficos fluconazol y ketoconazol presentan baja inhibicion de creciemiento frente a hongos como A.niger y P.digitatum demostramos con los ensayos realizados que estos antimicoticos presentan inhibicion significativa frente al crecimiento de los hongos empleados para este trabajo.

9

CONCLUSIONES

• Se determinó que los extractos etanolicos por el método DPPH* tienen mayor %

de captación obteniendo resultados para etanol hojas de 25,6 mg/L metanol y para etanol flores de 65,4 mg/L metanol, teniendo en cuenta que a menor % de captación mayor es la inhibición del radical empleado.

• Los extractos de éter de petróleo no presentan una actividad antioxidante

significativa, concluyendo que la capacidad antioxidante expresada en términos de AAR es baja, esto debido a la presencia mínima de sustancias donadoras de protones en la composición química.

• La actividad antioxidante obtenida por el ensayo DPPH* fue mayor a la obtenida

por el ensayo ABTS*+, estos valores son significativamente diferentes, sin embargo, se encontró una buena correlación entre ambos métodos.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 91

• Se determina que los extractos éter de petróleo flores con valor de 50,3mg y

etanol hojas con valor de 85,8mg presentan una IC50 mayor para la inhibición del crecimiento de S. aureus comparado con los diferentes extractos.

• Se determina que para la inhibición del crecimiento de S. aureus comparado

cuando el patrón rifampicina equivale a 1mg debe emplearse el extracto etanol hojas con un valor de 197,5 mg el cual presenta mayor inhibición del crecimiento comparado con los otros extractos.

• Al comparar la literatura con los resultados obtenidos para la inhibición del

crecimiento de S. aureus se concluye que este microorganismo es sensible a los diferentes extractos empleados en este ensayo, logrando halos de inhibición frente al crecimiento bacteriano.

• Se determina que para los extractos de hojas el éter de petróleo con valor de 64

mg y para los extractos de flores el éter de petróleo con valor de 45 mg presentan una IC50 representativa para la inhibición del crecimiento de A. niger.

• Se determina que el extracto de etanol hojas con valor de 69 mg y para los

extractos de flores el éter de petróleo con un valor de 190mg presentan una IC50 representativo para la inhibición del crecimiento de P. digitatum.

• Se determina que para la inhibición del crecimiento de A. niger comparado

cuando los patrones fluconazol y ketoconazol equivalen a 1mg se debe emplear el extracto de éter de petróleo hojas con valores de 459,51 mg y 520,90 mg los cuales presentan mayor inhibición del crecimiento fúngico comparado con los otros extractos.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 92

• Se determina que para la inhibición del crecimiento de P. digitatum comparado

cuando los patrones fluconazol y ketoconazol equivalen a 1mg se debe emplear el extracto de éter de petróleo hojas con valores de 87,72 mg y 941,18 mg los cuales presentan mayor inhibición del crecimiento fúngico comparado con los otros extractos.

• Se realizaron los ensayos para determinar la actividad bacteriana que presenta

los extractos frente a E. coli, pero dichos extractos no presentan ninguna inhibición significativa para este microorganismo.

• Los antimicóticos empleados para este trabajo según la literatura no presentan

inhibición para el crecimiento de A. niger y P. digitatum, pero realizando los ensayos se demostró que si logran tener una inhibición para estos dos hongos.

10 RECOMENDACIONES

• Realizando los ensayos anteriormente descritos en esta investigación se

determinó que los extractos etanolicos fueron los que presentaron actividad antioxidante y antimicrobiana, por ende, se recomienda determinar cuáles son los principios activos que generan dichas actividades por técnicas cromatografías e identificar por técnicas espectroscópicas UV, IR, MS,1HRMN y 13CRMN los metabolitos secundarios presentes en hojas y flores de Chromolaena scabra (L.F) R.M. King & H. Rob.

Vicerrectoría de Investigaciones U.D.C.A Página 93

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12 ANEXOS

ANEXO 1. Certificado taxonómico de planta.