ESTUDIO FITOQUÍMICO DE LA ESPECIE VEGETAL Solanum crinitipes Dunal (Solanaceae) Y EVALUACIÓN DE USO COMO AGENTE ANTIMICROBIANO
TANIA LIZETH CAÑON BUITRAGO
1.022.396.147
MIGUEL ANGEL MENCO ROMERO
1.033.770.924
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A.)
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
BOGOTÁ D.C.
2018
ESTUDIO FITOQUÍMICO DE LA ESPECIE VEGETAL Solanum crinitipes Dunal (Solanaceae) Y EVALUACIÓN DE USO COMO AGENTE ANTIMICROBIANO
TANIA LIZETH CAÑON BUITRAGO
1.022.396.147
MIGUEL ANGEL MENCO ROMERO
1.033.770.924
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO
Director de tesis Qca. MSc. DORIS GUTIERREZ HERNANDEZ
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (U.D.C.A.)
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
BOGOTÁ D.C.
2018
Agradecimientos
Para el desarrollo de este proyecto, agradecemos la oportunidad de trabajar en el Jardín Botánico José Celestino Mutis de Bogotá y haber contado con el apoyo del personal que contribuyeron con todo lo necesario para dar continuidad a cada etapa de nuestra tesis.
De manera especial queremos agradecer a Doris Gutiérrez, quien fue la persona que nos logró orientar, supervisar y dio un seguimiento durante la investigación de la tesis para poder presentar un trabajo que cumpla con las expectativas, y adicionalmente por la motivación recibida durante este tiempo transcurrido.
A nuestras familias Cañon Buitrago y Menco Romero, nuestros más sinceros agradecimientos por permanecer constante desde el inicio y culminación del proyecto, mostrándonos su interés de ayudarnos día tras día.
Tabla de contenido Resumen .................................................................................................................. 9
1. Introducción ...................................................................................................... 10
2. Objetivos .......................................................................................................... 12
2.1. Objetivo general .......................................................................................... 12 2.2. Objetivos específicos ................................................................................... 12
3. Marco teórico .................................................................................................... 13
3.1. Solanum crinitipes Dunal ............................................................................. 13 3.2. Microorganismos patógenos ......................................................................... 20
3.3. Métodos y técnicas para el estudio fitoquímico de la especie vegetal S. crinitipes
………………………………………………………………………………………………………………31 3.4. Ensayos de bioactividad ............................................................................... 34
4. Metodología ...................................................................................................... 37
4.1. Recolección y clasificación del material vegetal ............................................. 37 4.2. Secado del material vegetal ......................................................................... 37 4.3. Obtención del extracto etanólico .................................................................. 37 4.4. Estudio fitoquímico preliminar ...................................................................... 37 4.5. Bioensayo de toxicidad con Artemia salina .................................................... 38
4.6. Aislamiento y preparación de inóculos de los microorganismos a evaluar ........ 39
4.7. Bioensayo por difusión en pozos .................................................................. 40 4.8. Fraccionamiento del extracto crudo .............................................................. 42 4.9. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ........................................................ 43
5. Resultados y análisis de resultados .................................................................... 44
5.1. Extractos etanólicos obtenidos a partir de S. crinitipes ................................... 44 5.2. Análisis fitoquímico preliminar ...................................................................... 44 5.3. Bioensayo de toxicidad con Artemia salina .................................................... 49 5.4. Aislamiento de los microorganismos estudiados ............................................ 51
5.5. Inhibición extractos etanólicos frente a bacterias (Escherichia coli y
Staphylococcus aureus) ........................................................................................ 52 5.6. Evaluación del extracto etanólico frente a hongos (Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Trichoderma sp.) .............. 56
5.7. Fraccionamiento del extracto de hojas de S. crinitipes con acetona ................ 57 5.8. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ........................................................ 59
6. Conclusiones .................................................................................................... 61
7. Recomendaciones ............................................................................................ 62
8. Referencias Bibliográficas ................................................................................. 63
ANEXOS ................................................................................................................ 70 ANEXO 1. Resultado del análisis fitoquímico preliminar ........................................... 70 ANEXO 2. Bioensayo de toxicidad con Artemia salina .............................................. 74 ANEXO 3. Resultado del análisis fitoquímico preliminar del fraccionamiento con Acetona hojas de S. crinitipes ............................................................................... 76
Listado de Imágenes Figura 1. Ubicación geográfica de la especie Solanaceae (Global Biodiversity information Facility GBIF, 2018) Las zonas de color rojo (mayor presencia), anaranjado (presencia media) y amarillo (poca presencia) representan la distribución de la familia.14 Figura 2.Ubicación geográfica de la especie S. crinitipes (Global Biodiversity Information Facility GBIF, 2018). Los hexágonos representan la distribución de la especie............ 18 Figura 3.Espécie vegetal Solanum crinitipes Dunal (Jardín Botánico de Bogotá Jose Celestino Mutis, Carlos Iván Suarez) ........................................................................ 19 Figura 4. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas de la bactéria Escherichia coli .......................................................................................... 20 Figura 5. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas de la bactéria Staphylococcus aureus ............................................................................... 21 Figura 6. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Aspergillus sp. .............................................................................................. 22 Figura 7. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Botrytis sp. ................................................................................................... 24 Figura 8. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Candida sp. .................................................................................................. 25 Figura 9. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Fusarium sp.................................................................................................. 26 Figura 10. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Penicillum sp. ............................................................................................... 27 Figura 11. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Rhizopus sp.................................................................................................. 28 Figura 12. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Trichoderma sp. ............................................................................................ 30 Figura 13. Artemia salina ......................................................................................... 35 Figura 14. Metodología del análisis fitoquímico preliminar .......................................... 38 Figura 15. Procedimiento ensayo por difusión en pozos. ............................................ 41 Figura 16. Bacterias y hongos aislados: (a) Escherichia coli, (b) Staphylococcus aureus, (c) Aspergillus sp., (d) Botrytis sp., (e) Candida sp., (f) Fusarium sp., (g) Penicillium sp., (h) Rhizopus sp., (i) Trichoderma sp. ........................................................................ 51 Figura 17. Susceptibilidad de Escherichia coli frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes. .............................................................................................. 52 Figura 18. Susceptibilidad de Staphylococcus aureus frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes ................................................................................... 54 Figura 19. Resultado del bioensayo de difusión de pozos de los hongos: (a) Aspergillus sp., (b) Botrytis sp., (c) Candida sp., (d) Fusarium sp., (e) Penicillium sp., (f) Rhizopus sp., (g) Trichoderma sp. ........................................................................................... 56 Figura 20. Resultado de bioensayo del fraccionamiento de cloroformo, acetona y etanol frente Staphylococcus aureus .................................................................................. 58 Figura 21. Resultado de la CMI del fraccionamiento de Acetona frente a Staphylococcus aureus .................................................................................................................... 60
Listado de Tablas Tabla 1. Algunos componentes químicos aislados de especies Solanum. ................... 16 Tabla 2. Identificación de los extractos y controles empleados en los bioensayos de actividad antimicrobiana. ......................................................................................... 41 Tabla 3. Identificación de las fracciones del extracto de las hojas de S. crinitipes. ....... 42 Tabla 4. Identificación de los extractos y controles empleados en los bioensayos de actividad antimicrobiana. ......................................................................................... 43 Tabla 5. Cantidad de extracto etanólico obtenidos de los órganos de S. crinitipes. ...... 44 Tabla 6. Resultados de análisis fitoquímico preliminar de los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos de S. crinitipes. ......................................................................... 45 Tabla 7. Resultados del ensayo de toxicidad de los extractos de hojas, tallos y frutos de S. crinitipes. ............................................................................................................ 49 Tabla 8. Valores para la CL50 de los extractos de Hojas, Tallos y Frutos de S. crinitipes.
.............................................................................................................................. 50
Tabla 9. Susceptibilidad de Escherichia coli frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes. .............................................................................................. 53 Tabla 10. Susceptibilidad de Staphylococcus aureus frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes. .................................................................................. 55 Tabla 11. Resultados bioensayo de inhibición frente a hongos patógenos (Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Trichoderma sp.)......................................................................................................................... 57 Tabla 12. Resultados bioensayo con las fracciones de cloroformo, acetona y etanol de S. crinitipes frente a Staphylococcus aureus. ............................................................ 59
Listado de Abreviaturas CV Coeficiente de variación °C Grado Celsius µL Microlitros µg Microgramo cm Centímetro
CMI
Concentración mínima inhibitoria
DMSO
Dimetilsulfóxido FeCl3 Cloruro férrico g Gramo
JBB
Jardín Botánico de Bogotá L Litro CL50 Concentración letal 50 m Metro mg Miligramo mL Mililitro mm Milímetro ppm Partes por millón
RSD
Desviación estándar
SCA
Fraccionamiento de acetona de Solanum crinitipes hojas
SCC
Fraccionamiento de cloroformo de Solanum crinitipes hojas
SCE
Fraccionamiento de etanol de Solanum crinitipes hojas
SCF
Extracto de Solanum crinitipes frutos
SCH
Extracto de Solanum crinitipes hojas
SCT
Extracto de Solanum crinitipes tallos
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Resumen Solanum crinitipes es una especie nativa de los Andes de Colombia a Perú y fue colectada en la Vereda Mochuelo Alto de Ciudad Bolívar (Bogotá D.C). Los extractos etanólicos obtenidos de los frutos, hojas y tallos fueron sometidos al análisis fitoquímico preliminar y además fueron evaluados frente a bacterias como Escherichia coli y Staphylococcus aureus y en hongos como Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., y Trichoderma sp. Del análisis fitoquímico preliminar se estableció la presencia de metabolitos secundarios como alcaloides, triterpenoides, esteroides, fenólicos, taninos, cumarinas, compuestos lactónicos y quinonas. Los extractos mostraron una toxicidad moderada frente a Artemia salina. En los ensayos de actividad antimicrobiana, empleando la técnica de difusión por pozos, se evidenció que el extracto de hojas tiene una actividad media frente a S. aureus. El extracto de hojas por ser el de mayor actividad, fue fraccionado por extracción Soxhlet usando cloroformo, acetona y etanol como disolventes. Las fracciones obtenidas se evaluaron de nuevo con S. aureus y los resultados mostraron que la fracción en acetona presenta una actividad alta mientras que la fracción en cloroformo mostró una actividad media. La Concentración Mínima Inhibitoria de la fracción en acetona fue de 30 mg/mL a la cual se observó una disminución del crecimiento de S. aureus. La fracción en acetona contiene entre sus metabolitos alcaloides, taninos y compuestos cardiotónicos que pueden estar asociados a la actividad antimicrobiana.
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1. Introducción
Colombia es el segundo país con mayor biodiversidad, cuenta con cinco grandes regiones naturales de las cuales la región Andina presenta mayor riqueza vegetal, seguida por la Amazonia, el Chocó, la Orinoquia y la Costa Caribe (Rodriguez, 2000). La biodiversidad de especies vegetales está relacionada con la diversidad en compuestos químicos por lo que nuestro país posee un gran potencial como fuente de compuestos bioactivos que podrían ser aprovechados en diferentes campos como la salud, la agricultura y la biotecnología (Rangel, 2015).
Para las regiones de Colombia se contemplan una cantidad considerable de tipos de vegetación que se distribuyen de la siguiente manera: Andina 571, Caribe 161, Amazonia 140, Orinoquia 90 y para el Chocó 86. De lo anterior, se reportan las familias con mayor incidencia, como Orchidaceae, Asteraceae, Rubiaceae, Melastomataceae, Poaceae, Araceae, Piperaceae, Gesneriaceae, Fabaceae, Bromeliaceae, Euphorbiaceae, Solanaceae, Cyperaceae, Lauraceae y Mimosaceae, conformando una gran diversificación vegetal en Colombia (Rangel, 2015).
Una de las familias con mayor presencia en el territorio colombiano con 42 géneros y
405 especies, es la Solanaceae (Rangel, 2015); estas últimas han sido estudiadas
químicamente por sus variadas características, siendo una de ellas la composición fitoquímica como en la especie Solanum, donde se ha determinado la presencia de metabolitos secundarios como alcaloides, esteroides, esteroles, taninos, triterpenos, saponinas y sapogeninas, que han sido trabajados para desafiarlos a nivel experimental e identificar sus posibles actividades frente a bacterias, hongos, insectos o células (Niño, Correa, & Mosquera, 2006).
Uno de los componentes de la familia Solanaceae, es la especie vegetal S. crinitipes, que solamente cuenta con estudios de la actividad antioxidante obtenida de sus frutos (Orozco, Alba, Beltrán, & Orejuela, 2015); esto amerita, la ejecución de más ensayos que permitan detectar otras actividades de dicha especie.
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Por tanto, como objeto de estudio de la presente investigación, se evaluará la especie S. crinitipes debido a que es una planta nativa de nuestro país, que hasta el momento no ha sido completamente estudiada con respecto a su composición fitoquímica y tampoco hay reportes que demuestren si presenta o no actividad frente a microorganismos, con lo cual se pretende contribuir al conocimiento tanto químico como de la bioactividad del extracto etanólico de sus frutos, hojas y tallos frente a hongos y bacterias.
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2. Objetivos
2.1.
Objetivo general Realizar el estudio fitoquímico preliminar de los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos de la especie vegetal Solanum crinitipes Dunal (Solanaceae) y evaluar su actividad antimicrobiana y/o antifúngico frente a hongos y bacterias para establecer algún uso potencial de esta especie vegetal.
2.2.
Objetivos específicos o Establecer cualitativamente, a través de la marcha fitoquímica preliminar, los grupos de metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de frutos, hojas y tallos de la especie vegetal Solanum crinitipes Dunal.
o Evaluar la toxicidad del extracto etanólico de la especie Solanum crinitipes Dunal por medio de ensayos con Artemia salina.
o Evaluar el extracto etanólico y los extractos derivados del fraccionamiento con disolventes frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida sp., Fusarium sp. por medio de bioensayos in vitro, para determinar su posible acción como agente antimicrobiano.
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3. Marco teórico
3.1.
Solanum crinitipes Dunal
3.1.1. Generalidades de la familia Solanaceae
La especie S. crinitipes pertenece a la familia Solanaceae que comprende 2300 especies distribuidas en 96 géneros entre los que se encuentran: Solanum con 1500 a
1700 especies, Lycianthes con 200, Cestrum con 175, Nicotiana con 95, Physalis con
90, Capsicum con 25 y Dattura con 11 (Galindo, 1983).
La familia Solanaceae tiene una distribución cosmopolita (Figura 1) y se presenta con mayor frecuencia en regiones tropicales, subtropicales y zonas templadas entre 0 m hasta los 3000 m (Orozco, Beltrán, Porras, & Nee, 2008). En Colombia, la familia Solanaceae es una de las más diversificadas con 42 géneros y 405 especies (Rangel, 2015), entre las que se encuentran algunas tóxicas (como varias especies de Datura y Nierembergia linariaefolia), otras medicinales (varios Solanum, Atropa belladona) y alimenticias (Galindo, 1983).
Las especies se distinguen por ser plantas leñosas o herbáceas, decumbentes o trepadoras, con hojas generalmente alternas, simples o compuestas. Las flores solitarias o numerosas se disponen en cimas, umbelas, racimos o panículas, por lo común son hermafroditas y actinomorfas; el cáliz es gamosépalo, generalmente persistente y en ocasiones acrescente en el fruto, la corola es rotácea a tubular, 5 lobada, 5 estambres, y el ovario es súpero, por lo general con 5 lóculos. El fruto tiene forma de baya o capsula, dehiscente o indehiscente (Knapp, Bohs, Nee, & Spooner,
2004).
La familia Solanaceae ha sido ampliamente estudiada descubriendo varias moléculas novedosas como esteroides, saponinas, glicósidos y alcaloides en raíces, tallos y hojas. De todas las moléculas antes mencionadas, son los alcaloides a quienes se ha dado una importancia especial ya que éstos han mostrado presentar actividad en todos los casos de estudio realizados (Knapp, Bohs, Nee, & Spooner, 2004).
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Figura 1. Ubicación geográfica de la especie Solanaceae (Global Biodiversity information Facility GBIF, 2018) Las zonas de color rojo (mayor presencia), anaranjado (presencia media) y amarillo (poca presencia) representan la distribución de la familia.
3.1.2. Generalidades del género Solanum
Solanum es uno de los 10 géneros con más especies dentro de las angiospermas, con
1500 a 1700 especies distribuidas por todo el mundo (Granados, 2005; Beltrán &
Orozco, 2012). El género se ha sido subdividido en 7 subgéneros y 52 secciones teniendo en cuenta la ausencia o presencia de espinas, la forma de las anteras y la morfología de los tricomas. Dunal (1852) público el primer tratamiento de Solanum, agrupando cerca de 900 especies en dos grandes secciones, Pachistemonum y Leptostemonum, esta última a su vez subdividida en varias sucesiones y series, tres de las cuales (Melongena, Mogenoplum y Oliganthes) incluían especies de Clinutum (Beltrán & Orozco, 2012). Posteriormente, Bitter (1919) subió de posición a Leptostemonum al rango del subgénero, concepto que fue compartido por D´Arcy (1972). Más adelante Whalen (1984) organizó el subgénero en 32 grupos de especies, uno de los cuales corresponde al género de especies S. crinitrum. Finalmente, Bohs (2005) propuso para Solanum la existencia de por lo menos 12 clados mayores, entre los cuales se encuentran Leptostemonum. (Beltrán & Orozco, 2012).
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El género tiene importancia económica al contar con especies comestibles como la papa (S. tuberosum), la papa criolla (S. phureja), el tomate (S. lycopersicum) el tomate de árbol (S. betaceum), la berenjena (S. melongena) y el lulo (S. quitoense); también incluye especies ornamentales como el falso jazmín (S. laxum), la hierba mora (S. nigrum), el mirto (S. pseudocapsicum) y el lulo brasilero (S. grandiflorum) (Orozco, Beltrán, Porras, & Nee, 2008).
Además algunas especies de Solanum como S. modiflurum, S. torvum, S. tuberosum y S. americanum, tienen usos en la medicina como por ejemplo, tratar la tos, agentes tónicos, útiles en el agrandamiento hepático y del bazo, antídoto para venenos, tratamiento de fiebre, heridas, caries dentales, Inflamación de los ojos, resequedad de la piel y las mucosas, dolor de cabeza, en úlceras, golpes y chichones, prurito, salpullido, dolor de vientre, parálisis facial, culebrilla, picaduras de zancudos, moretones y algunos problemas reproductivos (Gil & Carmona, 2006; Jaiswal, 2012; Ramón, Miranda , & Infante, 1998). De igual manera, se han reportado con las especies S. incanum, S. taitense, S. argentinun y S. eleagnifolium para infecciones de garganta, dolor de estómago, artritis, malaria, tifoidea, antiarrítmico, antisárnico, antihemorroidal, sedante, antiinflamatorio y antifebril (Carrizo, Palacio , & Roic , 2002; Warui, 2006).
3.1.3. Química del género Solanum
Del género Solanum se han identificar varios compuestos como glicoalcaloides, glucósidos, saponinas esteroidales, flavonoides, esteroles y algunos componentes volátiles (Amir & Kumar, 2004). Algunos ejemplos se incluyen en la Tabla 1 e incluye la especie vegetal de la que fue aislado.
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Tabla 1. Algunos componentes químicos aislados de especies Solanum. Especie Vegetal Clases de Compuesto Nombre del Compuesto S. nigrum Glucósido esteroideo β2-solamargina Degalactotigonina.
S. platanifolum Solamargina, Solasonina, Khasianina, Ravitlolina. S. nigrum α-solamargina, α-solasonina.
S. capsicastrum Capsimina, Isocapsicastrina, Capsimina-3-o-β-D-glucósido. S. indicum Carpesterol Indiosido A S. urboreum Tomatidina, 3-o-fo-β-D-xilopiranosil-(1-6)-β-Dglucopiranosido S. sychophanta Sicofantina, 22,25-diepisicofantina 2 1-hidroxisicofantina, Solasonina, Solamargina. S. anguivi Solamargina, Anguivina, Isoanguivina. S. robustum Solamargina, Solasonina, N-hidroxirobustina, N-hidroxisolamargina.
S. umbelliferum Solasodina, o-acetilsolasodina, Solasodina-3-o-β-D-glucopranosido. S. indicum Isoanguivina, Protodioscina, Solasonina, Solamargina, Indioide A-E.
S. nigrum Quercetina-3-o-(2-α-ramnosil)- β -glucósido (I→6)-βgalactósido, Quercetina-3-o-α-ramnosil (I→2)-β-galactósido. S. lyratum Flavonoides Escopoletina.
S. dulcamara Quercetina, Kaempferol, Quercetina-3-ramnosilglucósido, Kaempferol -3-glucósido.
S. ligustrinum Esterol flavonoide Escopoletina, p-sitosterol-3-o-β-D-glucósido. S. sodomacum Alcaloides Solasodamina A, Solasodamina B.
S. panduraeforme S. spirale Soladulcidina, Colina Solaspiralidina S. arborcum Alcaloides esteroideos 22s,25s,3α-amino-5α-espirosolano, 22s,25s-3βaminoespirosolo-5-ene.
S. dulcamara Glicósidos Tigogenina-3-o-β-solatriosida, Degalactotigonina, Soladulcidina-3-o-β-chacotriosido, SoladuIcidina-3-0-β- Iicotetraosido.
S. lyratum (22R)-3P-16 β,22,26-tetrahidroxicolina-5ene,
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Especie Vegetal Clases de Compuesto Nombre del Compuesto 3-0-α-L-ramnopiranosil-( I >2)- β-Dglucuronopiranosido.
S. nigrescence Espirostanol.
S. dulcamara Saponinas esteroidales Soladulcidina, tetraósido-3β-o-(β-chacotiosil), soladucidina 3β-o-(β-licotetraosil)-26-o-(-D-glucopiranosil )-(2SR)-5αfurostano-3,22 α,26 triol.
S. toryum Torvonina B.
S. chrysotrichum 6-α-O-β-cixlopiranosil-( 1-> 3)-β-d-quinovopiranosil, (25 R)- 5-α-espirostano-3-β,23-α-Oi.
S. nigrum Nigrumninos I y II.
S. vestissimum Constituyentes volátiles Propionato de metilo, butanoato de metilo, acetato de butilo, 3-Metil butil acetato, metil hexanoato, metil benzoato, 3 hexenol, Linalool, α-Terpineol y Geraniol.
3.1.4. Estudios de actividad biológica del género Solanum
Especies de Solanum presentan actividad como insecticidas, citotóxicos y antivirales. Como, por ejemplo, S. macranthum demostró actividad insecticida sobre ninfas de Rhodnius pallescens, Rhodnius prolixus y Rhodnius colombiensis (Hernández, Florez, & Vallejo, 2010). La especie S. nigrum presento efecto insecticida produciendo la muerte en larvas Spodoptera frugiperda con una dosis de 2500 mg*L-1 (Lizarazo, Mendoza, & Carrero, 2008).
También, se han realizado estudios de la actividad citotóxica para algunas especies de Solanum como S. albidum, S. oblongifolium, S. ovalifolium, S. leucocarpun, S. deflexiflorum, S. lepidotum, S. aphyodendron, S. sycophanta y S. stellatiglandulosum (Quiroz, Smit, Espinoza, & Carmen, 2009; Niño, Correa, & Mosquera, 2008). De igual manera, para las especies S. crinitum y S. jabrense se presentó acción citotóxica con alcaloides esteroideos, flavonoides y sus glucósidos contra el carcinoma de ehrlich y células cultivadas de leucemia (Esteves, y otros, 2002). Adicionalmente, para varias plantas del género Solanum se les evaluó su citotoxicidad con activos provenientes de las mismas como lo fueron los glucósidos esteroidales, presentando acción frente a células tumorales y como tratamientos para cáncer de piel (Nakamura, y otros, 1996).
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Se han realizado estudios donde se evaluó la actividad antiviral con las especies S. globiferum y S. mammosum donde con extractos derivados de los frutos se determinó la presencia de alcaloides esteroidales ejerciendo efecto sobre la molusquicida (Nava, García, Camacho, & Vázquez, 2012).
3.1.5. Ubicación geográfica de S. crinitipes
La especie se encuentra en Suramérica, en Ecuador, Perú y Colombia. En nuestro país se han colectado especímenes de Boyacá, Cundinamarca y Magdalena (Instituto de Ciencias Naturales Universidad Nacional de Colombia, 2018; Betrán, Orejuela, Sarmiento, Vélez, & Orozco, 2015) en las zonas de transición entre la sierra y el subtrópico especialmente en los filos de las carreteras son intervenidos por el hombre y se observa en forma silvestre (Global Biodiversity Information Facility GBIF, 2018).
Figura 2.Ubicación geográfica de la especie S. crinitipes (Global Biodiversity Information Facility GBIF, 2018). Los hexágonos representan la distribución de la especie.
3.1.6. Características morfológicas de S. crinitipes
S. crinitipes es un arbusto nativo de la región andina. Se encuentra hasta una altitud de 2.200 m (valle del Río Ambato) a 3.600 metro sobre el nivel del mar (Zhaña, 2012;
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Instituto de Ciencias Naturales Universidad Nacional de Colombia, 2018; Betrán, Orejuela, Sarmiento, Vélez, & Orozco, 2015). Crece entre 14 a 23 º C, aunque es resistente a bajas temperaturas y tolera vientos fuertes. El suelo en el que habita es suelto, arenoso o pedregoso. Su tamaño alcanza una altura de 3 a 4 m. Se presenta con abundante follaje y una ramificación que casi comienza desde el suelo. Los tallos y ramas tienen pequeñas espinas de un color dorado (Alonso, 2004; Aspillaga, 2004).
Figura 3.Espécie vegetal Solanum crinitipes Dunal (Jardín Botánico de Bogotá Jose Celestino Mutis, Carlos Iván Suarez) Sus hojas presentan el limbo oblongo, aterciopelado con delgadas espinas, bordes ondulados, con coloración verde claro, con un pecíolo de 4 a 5 cm de largo y una inserción bien acentuada en el envés de la hoja (Alonso, 2004). En sus flores se presenta una inflorescencia panícula, con una corona de 5 pétalos soldados, color violeta, acampanada cuando joven, estambres cortos y blancos casi invisibles, anteras de color amarillo intenso, 5 a 6 mm de largo, el pistilo sobresale unos 2 mm (Taiz & Zeiger, 2003). Y sus frutos son bayas verdes que al madurar se ennegrece, contiene numerosas semillas y un jugo, característicamente pegajoso (Zhañay, 2012).
La especie S. crinitipes cuenta con un estudio en el que se evaluó la actividad antioxidante con el extracto hidroalcohólico (alcohol al 40%) de los frutos frente a la enzima polifenoloxidasa extraída de la manzana, la cual indico una actividad del 601% de inhibición de la oxidación. Y mediante una marcha fitoquímica se identificaron los metabolitos secundarios presentes en la especie alcaloides, saponinas, catequinas,
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taninos, triterpenos y/o esteroides, antraquinonas, flavonoides, azucares reductores, lactonas y cumarinas. De allí, dicho trabajo concluye que la presencia de flavonoides posee la propiedad antioxidante para el estudio efectuado (Zhañay, 2012). Aun así, no se cuenta con más información al respecto de dicha especie.
3.2.
Microorganismos patógenos
3.2.1. Escherichia coli (E. coli)
Es un bacilo de 1 a 3 µm por 0,5 µm, que se presenta sólo, en pares, en cortas cadenas o formando grupos. En general es móvil (por flagelos peritricos), aunque existen variantes inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general es no cápsulado y Gram negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente; en los viejos se presentan formas de una dimensión mayor (Peñaranda & Sierra, 2008).
(a)
(b) Figura 4. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas de la bactéria Escherichia coli En agar forma colonias circulares de 3 a 5 mm convexas, de borde continuo o un tanto ondulado, brillantes y de coloración blanca un poco amarillenta. Con producción de ácido y gas, fermenta la lactosa y un gran número de carbohidratos; algunas cepas son lactosa negativa. Es indol positivo, rojo de metilo positivo, Voges Proskauer (VP) negativa y no utiliza el citrato. Produce H2S en determinados medios (Peñaranda & Sierra, 2008).
Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento es
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37°C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de temperatura; el pH favorable es de 7 y algunas cepas producen hemolisina (Peñaranda & Sierra, 2008).
Se ha considerado inicialmente solo como un habitante del intestino, desde hace cerca de 3 décadas se empezó a estudiar su poder entero patógeno. Se ha visto que las sepas toxigénicas de E. coli pueden producir una enterotoxina termolábil (TL), una termoestable (TS) o ambas (Rodriguez & Uribe, 1995).
3.2.2. Staphylococcus aureus (S. aureus)
Son cocos Gram positivos de 0,5 a 1 µm de diámetro inmóviles, aerobios o anaerobios facultativos caracterizados por su agrupación en forma de racimo. Crecen a una temperatura optima de 37°C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente alcalino de 7,6 y la adición de glucosa favorece el crecimiento (Peñaranda & Sierra, 2008).
(a)
(b) Figura 5. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas de la bactéria Staphylococcus aureus La capacidad de S. aureus para fermentar los azucares como maltosa, manitol, trealosa, es positiva. La producción de una nucleasa termoestable es un buen indicador de la presencia de S. aureus, al igual que la conversión de nitratos a nitritos. En cultivo puro resisten una concentración de fenol al 1% durante 15 minutos, pero solo los mata una concentración al 2%. Soportan el calor húmedo a 60°C durante 30 minutos (Peñaranda & Sierra, 2008).
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Forma parte de la flora normal de mucosas y piel intervienen en procesos patológicos diversos como infecciones supurativas e intoxicaciones alimenticias (Arevalo & Enciso, 1996). S. aureus puede causar infección en todos los grupos de edad tanto de forma esporádica como epidémica y se ha identificado como una de las principales causas de infección de heridas quirúrgicas. Su principal forma de transmisión es por contacto (Uribe, 2003).
3.2.3. Aspergillus sp.
Aspergillus es un hongo filamentoso hialino, saprofito, perteneciente al filo Ascomycota. Se encuentra formado por hifas hialinas septadas y puede tener reproducción sexual (con formación de ascosporas en el interior de ascas) y asexual (con formación de conidios) (Martín & Sevilla, 1994). Las especies del género Aspergillus se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza lo cual facilita el aislamiento de una gran variedad de substratos. Se caracteriza por la producción de hifas especializadas, denominadas conidióforos, sobre las que se encuentran las células conidiógenas que originan las esporas asexuales o conidios (Abarca, 2000).
(a)
(b) Figura 6. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Aspergillus sp.
Las principales características macroscópicas se observan en el diámetro de las colonias, coloración del anverso y el reverso de las colonias, presencia de esclerocios, presencia de gotas de exudado, presencia de pigmento difusible y textura de las colonias (Abarca, 2000). En cuanto a las características microscópicas podemos resaltar la disposición de métulas o fiálides sobre la vesícula, longitud y anchura de los
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estipes, forma y diámetro de las vesículas, forma, diámetro y color de los conidios, de las células de Hülle y de las ascosporas (Abarca, 2000).
El sistema de identificación propuesto por Klich y Pitt (Klich, 1996; Pitt, 1985), utiliza tres medios de cultivo y dos temperaturas de incubación. Cada cepa debe sembrarse en tres puntos en dos placas de medio CYA (Czapek Yeast extract agar), una placa de CYA con 20% de sacarosa (CY20S), y una placa de MEA (agar extracto de malta). Una de las placas de CYA se incuba a 37ºC y las restantes a 25ºC. Tras siete días de incubación se procede a la observación de las características morfológicas macroscópicas y microscópicas de los cultivos (Abarca, 2000).
Se logran reproducir principalmente por esporas o conidios que se encuentran presentes en el ambiente penetrando el organismo por vía respiratoria. También es posible que se transmitan por contaminación de heridas o mucosas y por ingesta de alimentos contaminados. Son responsables de casos de infecciones asociadas a la atención en salud (Abarca, 2000).
3.2.4. Botrytis sp.
Botrytis es un hongo fitopatógeno de amplia distribución mundial. Produce abundante micelo gris y varios conidióforos largos y ramificados, cuyas celulas aplicales redondeadas producen racimos de conidios ovoides o esfericos, unicelulares, hialinos o levemente coloreados. Las colonias son de crecimiento moderado, blancas o grises dependiendo el medio de cultivo (Romero M. , 2003).
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(a)
(b) Figura 7. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Botrytis sp.
Las colonias pueden ser de tipo micelial, esclerocial o esporulante. La micelial es de crecimiento rapido, abundante, algodonosa y de color pardo. La esclerodial es de crecimiento lento, de color blanco inicialmente y luego tiende ser de color gris o pardo. Los esclerocios se caracterizan por poseer varias capas exteriores formadas por celulas de paredes oscuras con coloracion negra y son constituidas por células hialinas (Romero M. , 2003).
Los factores de crecimiento que afectan a Botrytis son la humedad, temperatura y pH. Necesitan humedad relativa alta (93-100%) para la germinacion y un 70 y 100% se genera la esporulación. Para la germinacion se requiere una temperatura entre 15 - 20°C y para la esporulación la temperatura fluctua entre 11 y 13°C. El pH que se requiere para la germinación es de 3-7 encontrandose una germinación optima a un pH de 4 (Romero, 2003).
El ciclo de infección puede ser producido sobre cualquier material vegetal y transportarse a grandes distancias por corrientes de aire. Una vez que los conidios han alcanzado la superficie del hospedero se inicia el ciclo de infeccion, donde penetra el material vegetal a traves de heridas o de aberturas naturales, causando muerte de las celulas adyacentes al punto de penetración. Transcurrido un tiempo en algunas lesiones primarias el patogeno es capaz de vencer la barrera defensiva de la planta e inicia la diseminacion en el tejido vegetal (Martínez & Moreno, 2008).
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Botrytis sp. puede atacar distintos órganos en la planta incluyendo flores, pedicelos, hojas, yemas, frutos, bulbos, cormos, tuberculos y raices. Así mismo puede atacar tejidos tiernos y suaves tales como petalos, yemas y brotes debilitando el tejido, envejeciendolo y causando su muerte (Martínez & Moreno, 2008). 3.2.5. Candida sp.
La especie patógena más frecuente en el hombre es la Candida albicans y es considerada como la más patógena de este género. Es una levadura, redonda u ovoide de 3 µm de diámetro, con o sin gemación. Forma parte de la flora normal de la boca, tubo digestivo y vagina. Estos hongos viven como saprofitos sobre la piel y las mucosas del tracto respiratorio, digestivo y genital femenino, de preferencia en pacientes diabéticos y durante el embarazo (Roncancio & Diana, 2001).
(a)
(b) Figura 8. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Candida sp.
Microscópicamente se puede observar que en el tejido se forma un micelio con hifas delgadas y pseudohifas, además de células micéticas levaduriformes pequeña. Estas células pueden formar gemación. Las hifas y pseudohifas penetran el tejido como lo hacen las raíces de una planta (Roncancio & Diana, 2001).
Las infecciones causadas por Candida producen dolor de esófago y dificultad para comer, infección del torrente sanguíneo, enfermedad diseminada normalmente con fiebre y raramente con pulmonía, osteomielitis y artritis (Roncancio & Diana, 2001).
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3.2.6. Fusarium sp.
Fusarium es un género anamórfico perteneciente a los ascomicetos del orden Hypocreales (clase Sordariomycetes) que agrupa a un gran número de especies. Es un hongo filamentoso aislado de plantas y suelos. Se encuentra como microbiota normal en arroz, frijol, soya y otros cultivos. Además de ser un contaminante común y fitopatógeno (Rattink, 1992). Las colonias se obtienen en Sabouraud, después de 1 a 5 días. Pueden ser algodonosas de color blanco, con diversos pigmentos según la especie (crema, rosado, salmón, amarillo, rojo o morado) (Rattink, 1992).
(a)
(b) Figura 9. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Fusarium sp.
Microscópicamente posee células conidiógenas tipo fialides formadas en la hifa aérea. Poseen 2 tipos de conidia: macroconidias y microconidias, que varían en forma y número según la especie:
- Macroconidias fusiformes, con septos transversales, producidas por sucesión
basipétala en los monofialides y acumuladas en pequeñas masas en la punta de la fialide (Rattink, 1992).
- Microconidias elipsoidales, ovales, subesféricas, piriformes o en forma de clava,
producidas por sucesión basipétala en mono y polifialides y acumuladas formando falsas cabezas o en cadenas (Rattink, 1992).
La mayoría de ellas son parásitas de plantas, aunque también existen especies capaces
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de infectar humanos y animales, habiendo aumentado significativamente el número de fusariosis en pacientes inmunocomprometidos. Se han podido diferenciar unas 70 especies involucradas en infecciones humanas, la mayoría de las cuales sin nombre específico ya que al no poder ser reconocibles fenotípicamente se ha preferido no asignarles binomios específicos.
Considerando la dificultad de identificar morfológicamente muchas de las cepas de especies filogenéticas implicadas en casos clínicos, con el objeto de permitir reconocer dichas cepas y poder realizar estudios epidemiológicos (Guarro, 2011).
3.2.7. Penicillum sp.
El género Penicillium son hongos filamentosos en su mayoría, están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se hallan en el suelo, la vegetación caída y el aire (Arias & Piñeros, 2008). Poseen hifas septadas hialinas 1,5-5 µm de diámetro, con conidióforos simples o ramificadas, métulas, fialides y conidias. Las métulas son ramificaciones secundarias que se forman sobre los conidióforos. Las métulas acarrean fialides en forma de frasco. Las conidias 2.5-5 µm de diámetro son redondas, unicelulares y observadas como cadenas no ramificadas en el extremo de las fialides (Arias & Piñeros, 2008).
(a)
(b) Figura 10. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Penicillum sp.
Las colonias de Penicillium son de crecimiento rápido, filamentosas y vellosas, lanosas o de textura algodonosa. Son inicialmente blancas y luego se convierten en verde azuladas, gris verdosas, gris oliva, amarillentas o rosadas con el tiempo. El reverso de
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la colonia es pálido o amarillento (Arias & Piñeros, 2008).
La única especie de Penicillum considerada patógena para el hombre y los animales es P. marneffei. Provoca un cuadro de fiebre y pérdida de peso acompañado frecuentemente de erupciones cutáneas en forma de pápula. Las infecciones producidas son frecuentes en paciente con inmunodeficiencias (Matínez, 2003). Otras patologías que pueden ocasionar los hongos son las reacciones de hipersensibilidad. Donde se han publicado casos de neumonía alérgica en trabajadores de fábricas de queso expuestos a una gran carga de conidios de P. roqueforti y P. verrucosum (Matínez, 2003).
También, se han presentado cuadros respiratorios acompañados con fatiga, dolores de cabeza y mucosas irritadas que se producen en trabajadores o personas que habitan edificios en los que existe un crecimiento fúngico masivo (Matínez, 2003). 3.2.8. Rhizopus sp.
Rhizopus sp. es un Zygomiceto, comúnmente encontrado en el polvo de las casas, suelo, frutas, nueces y semillas, también se presenta en alimentos en proceso de descomposición. La exposición prolongada a las esporas provoca problemas respiratorios principalmente en personas inmunocomprometidas (Bonifaz, 2015).
(a)
(b) Figura 11. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Rhizopus sp.
Son colonias de rápido crecimiento, las especies patógenas tienden a crecer mejor a
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37°C, su crecimiento se inhibe con Cicloheximidas. Son de tamaño ilimitado, son colonias blancas, al alcanzar la madurez comienzan a adquirir una tonalidad gris oscura, la tonalidad se debe al desarrollo de las estructuras de reproducción asexual las Endosporas, son vellosas algodonosas y secas (Bonifaz, 2015). Presenta un micelio macrosifonado entre 5-10 µm, hialino, cenocítico, en los puntos en donde se conectan los esporangióforos y los estolones que presentan, se forman rizoides (Bonifaz, 2015). Los esporangióforos son largos y no se ramifican, y culminan en esporangios de gran tamaño (40-275 µm), con esporangiosporas hialinas o ligeramente cafés (Bonifaz,
2015).
En personas normales, las esporas de mucorales que llegan a las vías respiratorias se adhieren al moco nasal y son eliminadas ya sea por deglución o estornudos; si existe alguna herida en las mucosas, los neutrófilos polimorfonucleares fagocitan y destruyen las estructuras fúngicas en unos minutos. En los diabéticos descompensados, las mucosas están secas por lo que las esporas permanecen y se adhieren al tejido. Estudios realizados con Rhizopus arrhizus han demostrado que los cuerpos cetónicos presentes en estos pacientes son metabolizados con gran facilidad y favorecen el desarrollo in situ de los agentes (Méndez, 2018).
Estudios recientes demuestran que Rhizopus sp se adhiere a células endoteliales y les causa lesiones estando muerto el hongo. La importancia de este hallazgo de investigación aún no se ha establecido en los cuadros de mucormicosis rinocerebral (Méndez, 2018).
La enfermedad que causan es de evolución aguda y se considera que sin tratamiento las personas mueren en 15 o 20 días, sin embargo, existen escasos reportes de pacientes con hasta dos años de evolución. Generalmente se afecta más intensamente una mitad de la cara, aunque en algunos casos es difícil distinguir de qué lado se inició la patología (Méndez, 2018).
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3.2.9. Trichoderma sp.
Trichoderma es un hongo, habitante natural del suelo, caracterizado por un comportamiento saprofito o parasito, propiedades que benefician su actividad antagónica. Es considerado un colonizador secundario dado su frecuente aislamiento a partir de materia orgánica en descomposición, también es aislado de las raíces de varias plantas de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patógenos (Tovar, 2008).
(a)
(b) Figura 12. (a) Características macroscópicas; (b) Características microscópicas del hongo Trichoderma sp.
Las colonias de Trichoderma presentan crecimiento rápido, que va formando una colonia delgada sobre la superficie de agar, debido a la condición que presenta a través de su desarrollo. Las colonias son lisas o casi transparentes y algunas veces blancas, posteriormente presentan penachos blancos y algodonosos, de micelio blanco, conformando una red densa, responsable del pigmento característico. Las especies del género Trichoderma presentan conidióforos complejos y altamente ramificados en forma piramidal o cónica dando origen a esterigmas, con extremos ahusados. Crecen rápidamente en cultivo artificiales y produce un largo número de pequeños conidios verdes o blancas de células conidiógenas situadas al final de conidióforos extensamente ramificados (Tovar, 2008).
La temperatura óptima para su crecimiento linear en agar y producción de micelio está entre 20 y 28 ºC, aunque crece bien entre 6 a 32 ºC. El contenido mínimo de humedad para su crecimiento vegetativo es del 92% y para su esporulación es de 93 al 95%. Tiene cierta respuesta a la luz, especialmente azul y la violeta. La luz promueve la
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formación de esporas, el crecimiento de micelio y la coloración (Romero, Huertas, Damián, Domínguez, & Arellano, 2009).
Trichoderma sp. es un eficiente controlador biológico que está siendo usado ampliamente en la agricultura como agente biocontrol debido a su habilidad para colonizar sustratos rápidamente, inducir resistencia sistémica adquirido en plantas. Promover el crecimiento vegetal y poseer actividad antagonista contra un amplio rango de hongos patógenos. El efecto inhibitorio de sus antibióticos y la degradación de componentes de la pared celular de patógenos de plantas es citado como aspecto importante de su actividad antagonista (Tovar, 2008).
Las especies de Trichoderma tiene una gran actividad antagonista sobre patógenos como Rhizoctonia solani, Pythium ultimim y Fusarium oxisporum, causantes de enfermedades importantes en cultivos de rabano, clavel, crisantemo, frijol, cafeto, haba, tomate y cítricos, entre otros. Varios investigadores y algunas empresas han mostrado gran interés en estudiar el potencial de Trichoderma como controlador biológico de patógenos de suelo (Tovar, 2008).
3.3.
Métodos y técnicas para el estudio fitoquímico de la especie vegetal S. crinitipes
3.3.1. Molienda
Este proceso tiene como objetivo la disminución del tamaño de las partículas de la droga vegetal para dirigirla a la próxima etapa del proceso de extracción. La extracción de una droga entera o dividida en fragmentos gruesos no estaría completa debido a la falta de penetración del solvente en el tejido de la especie, siendo muy lenta, una vez que las membranas celulares actúan como verdaderas barreras dificultando el proceso de extracción. Para una droga previamente dividida, las membranas se encuentran parcialmente destruidas, facilitando la disolución de los constituyentes celulares en el líquido externo. Sin embargo, la división excesiva, con formación de polvos muy finos puede causar problemas en el transcurso de la extracción (Sharapin, 2000).
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En esta operación se retiran los materiales extraños como pedazos de madera de metal o materiales de otra naturaleza. La droga molida se clasifica de acuerdo con el tamaño de las partículas, el cual debe ser adecuado para el proceso de extracción. La molienda del material vegetal, independiente de su naturaleza y del tipo de molido usado, da como resultado la producción de algunas partículas muy finas (Sharapin, 2000).
3.3.2. Maceración
La técnica de maceración consiste en colocar en contacto la droga o material vegetal con el solvente durante varios días. Se trata de un proceso cuyo resultado es un equilibrio de concentración entre los componentes presentes en la droga y el solvente, que depende de factores como la naturaleza de la droga, el tamaño de la partícula que debe ser el adecuado para que el solvente atraviese los tejidos de la droga, contenido de humedad y cantidad suficiente para una obtención necesaria del extracto y factores que están relacionados con el solvente como por ejemplo la selectividad que posea hacia los activos a extraer y la cantidad ya que se requiere un gran volumen para dicho proceso. El rendimiento del extracto disminuye cuando la relación droga/solvente aumenta, ya que para pequeñas cantidades de drogas se coloca un contenido un poco más alto para que una vez hinchadas, queden cubiertas escasamente unos centímetros por el líquido (Dobislaw, 2004; Sharapin, 2000).
Este proceso es bastante utilizado para las preparaciones en pequeña escala, ya que se puede emplear a temperatura ambiente, por tanto no hay degradación de compuestos y se puede realizar con agitación magnética o sin esta, logrando extraer todo lo que se desea macerar; el uso en una maceración industrial es limitado para la fabricación de extractos a partir de drogas vegetales ricas en mucilagos (Sharapin,
2000).
3.3.3. Concentración del extracto por evaporación
El proceso de concentración busca eliminar el exceso de disolvente empleado en la maceración, a través de un rotavapor por medio de una evaporación y condensación utilizando un matraz de evaporación rotativo bajo vacío, incrementando el rendimiento y
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protegiendo los productos. Dicho proceso se logra calentando el disolvente por medio de un baño calefactor y dentro del matraz de evaporación rotativo se va formando una fina película de disolvente, para dar lugar a una evaporación superior. Las rotaciones generan una mezcla equilibrada de la muestra evitando un sobrecalentamiento localizado en el matraz. La unidad de accionamiento asegurara que el matraz rote uniformemente y con el conducto del vapor integrado se transportara el vapor desde el inicio de la evaporación hasta el punto de refrigeración. El vapor del disolvente fluye hacia el condensador para que este se condense y el matraz receptor recoge el disolvente condensado (Sharapin, 2000 ; BUCHI, 2018).
El secado se lleva a cabo cuando se requiere obtener extractos secos ofreciendo ventajas como estabilidad química y mayor facilidad de almacenamiento y transporte (Sharapin, 2000).
Las estufas con circulación de aire funcionan a temperaturas de 60 a 80 °C, y son empleadas para pequeñas cantidades de extracto y no pueden ser utilizadas para secar productos termolábiles. El secado no es uniforme, también se han utilizado estufas al vacío (Sharapin, 2000)
3.3.4. Análisis fitoquímico preliminar
Un estudio fitoquímico preliminar tiene como objetivo determinar la presencia o ausencia de los principales grupos de metabolitos secundarios en una especie vegetal, como lo pueden ser: alcaloides, antraquinonas, naftoquinonas, cardiotónicos, cumarinas, esteroides y triterpenos, flavonoides, lactonas terpénicas, taninos y saponinas, (Carvajal, Hata, Sierra, & Rueda, 2009).
Cada uno de estos grupos de compuestos está relacionado con actividades biológicas específicas, partiendo de los resultados obtenidos de las siguientes pruebas: Wagner, Dragendorff, Erlich, Shinoda, Leucoantocianidinas, Salkowski, Liebermann-Burchard, gelatina con sal, comportamiento ácido base de quinonas, prueba de espuma, Waljet y cloruro férrico (Carvajal, Hata, Sierra, & Rueda, 2009).
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En el estudio fitoquímico preliminar es posible orientar investigaciones posteriores para determinar la actividad biológica de las especies en cuestión y los principios activos involucrados (Carvajal, Hata, Sierra, & Rueda, 2009).
Para el análisis fitoquímico preliminar se parte del extracto etanólico de los órganos de la planta como por ejemplo hojas, frutos, semillas y tallos, en los cuales se evalúa la presencia de los principales grupos de metabolitos secundarios previamente mencionados, mediante pruebas de tubo (Carvajal, Hata, Sierra, & Rueda, 2009).
3.3.5. Fraccionamiento con solventes del extracto crudo
Para la separación de productos naturales es muy utilizado el método de fraccionamiento, empleando solventes que disuelvan el componente que se desea analizar, dejándolos que sean insolubles con este solvente en la fuente natural (Ocampo, Rios, Betancur, & Ocampo, 2008).
Dicho proceso se realiza con un equipo de soxhlet conformado de un balón de destilación donde se deposita el solvente que es calentado y evaporado para pasar por el condensador, del cual cada gota que pasa, cae donde se encuentra el material solido a extraer; allí se va depositando el solvente que realiza el proceso de separación (Ocampo, Rios, Betancur, & Ocampo, 2008).
Cuando el solvente llega al nivel superior de la válvula inferior, genera un proceso de sifón cayendo al balón de destilación, allí se sitúa el solvente que arrastra el material deseado para el análisis. Dicho ciclo se repite varias veces hasta extraer todo el material, quedando depositado en el balón de destilación (Ocampo, Rios, Betancur, & Ocampo, 2008).
3.4.
Ensayos de bioactividad
3.4.1. Toxicidad de un extracto vegetal frente a Artemia salina
El bioensayo con Artemia salina es un método que permite determinar la toxicidad en la larva de este crustáceo que es altamente sensible a una gran variedad de sustancias
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químicas, y la toxicidad se expresa como CL50 (Sagastume, 2001).
Actualmente, la Artemia salina se utiliza como especie de bioensayo para una variedad de objetivos como, investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas, detección de toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de modelos de acción tóxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes (Sagastume, 2001).
Artemia salina es un crustáceo branquiopodo, de un tamaño aproximado de 1 mm (Pino & Lazo , 2010), y desprovisto de caparazón. Viven en las aguas salobres del litoral o del interior. Presentan razas anfigónicas y partenogenéticas, adaptadas a cada medio en particular. Sus huevos pueden permanecer deshidratados y de esta manera conservados por varios años lo que permite que sean de fácil adquisición (Portalpez,
2018).
Figura 13. Artemia salina (Rosetto, 2010).
3.4.2. Bioensayo para evaluación de la actividad antimicrobiana
El método de difusión en agar o el método Kirby-Bauer permite establecer la susceptibilidad antimicrobiana, es decir, proporciona resultados cualitativos del efecto de la sustancia evaluada sobre el microorganismo que puede ser susceptibles, intermedio o resistentes (Balouiri, Sadiki, & Koraichi, 2016).
Por lo tanto, este método se emplea para microorganismos de crecimiento rápido; además presenta la ventaja de ser reproducible, de bajo costo, no requiere gran
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cantidad de extracto y/o compuesto tiene capacidad para probar un gran número de microorganismos, agentes antimicrobianos y la facilidad para interpretar los resultados proporcionados (Balouiri, Sadiki, & Koraichi, 2016).
La difusión en agar permite evaluar el grado de inhibición para el crecimiento de los microorganismos y posiblemente cambios en su morfología provocados por la sustancia evaluada (Ramirez & Marin, 2009). La inhibición se establece con base en la relación entre la concentración de la sustancia que inhibe el crecimiento del microorganismo y el halo de inhibición de crecimiento o distancia alrededor del lugar de aplicación de la sustancia que permite medir la sensibilidad bacteriana (Rivas, Oranday, & Verde, 2016).
3.4.3. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Es un procedimiento denominado con frecuencia una técnica de dilución en tubo. La CMI no va a depender de un determinado agente, ya que se puede ver afectada por las características del organismo utilizado como control en la prueba, el tamaño del inoculo, la composición del medio de cultivo, el tiempo de incubación y las condiciones de incubación tales como la temperatura, el pH y la aireación. Cuando todas las condiciones están rigurosamente estandarizadas es posible comparar entre si distintos agentes antimicrobianos y determinar cuál de ellos es el más efectivo frente a un determinado organismo o valorar la actividad de un agente frente a una variedad de organismos (Brock & Madigan, 1991).
Para determinar la CMI se prepara una serie de tubos cada uno de los cuales contienen medio, luego se les ha adicionado la muestra a diferentes concentraciones y finalmente se coloca una cantidad del inoculo del microorganismo. Después de la incubación, se observa en que tubos no hay crecimiento lo cual se indica por medio de la ausencia de turbidez visible, y se determina así la CMI (Brock & Madigan, 1991) .
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4. Metodología
Los ensayos y experimentos planteados en esta investigación se realizaron en los laboratorios de la Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis.
4.1.
Recolección y clasificación del material vegetal S. crinitipes es una especie vegetal cuyo estudio ha sido priorizado por el programa de Especies y Propagación del Jardín Botánico de Bogotá que pretende realizar una caracterización integral de la especie. Esta caracterización comprende varios aspectos que buscan contribuir al conocimiento, conservación y uso sostenible de especies altoandinas.
El material vegetal fue identificado y clasificado por el botánico Carlos Ivan Suárez del Jardín Botánico de Bogotá y un espécimen reposa en el Herbario del JBB bajo el código CISB 365. La especie vegetal se colectó en la Vereda Mochuelo Alto de Ciudad Bolivar (Bogotá D.C).
4.2.
Secado del material vegetal Las hojas, tallos y frutos de S. crinitipes se sometieron a un proceso de secado en un horno con circulación de aire y a 40°C, y posteriormente, el material fue triturado para luego ser sometido a extracción con el disolvente orgánico.
4.3.
Obtención del extracto etanólico El material vegetal previamente seco y triturado se maceró con etanol al 96% por una
semana. La muestra se filtró y luego se concentró en un rotavapor (Heidolph). Los
extractos etanólicos o extractos crudos se utilizaron en las pruebas químicas y los bioensayos.
4.4.
Estudio fitoquímico preliminar Se evaluaron los extractos etanólicos de hojas, tallos y frutos realizando pruebas de coloración y precipitación cuyo objetivo fue la identificación de metabolitos secundarios presentes en la especie vegetal. Algunas de las pruebas que se llevarán a cabo son:
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Figura 14. Metodología del análisis fitoquímico preliminar: Ensayo en tubo (Galindo,
1983).
4.5.
Bioensayo de toxicidad con Artemia salina
4.5.1. Incubación de huevos de Artemia salina
Se preparó el medio donde se incubaron los huevos de Artemia salina: Se disolvieron
19 g de sal marina en 500 mL de agua de botellón y luego se filtró. Se agregó cantidad
suficiente de huevos de Artemia salina en la solución y se dejaron en incubación a 28°C con aireación por un periodo de 72 horas (Jerry, McLaughlin, Lingling, & Rogers, 1998).
4.5.2. Evaluación de la toxicidad de los extractos
En este ensayo se trabajaron concentraciones de: 0 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm,
500 ppm y 1000 ppm cada una por triplicado a partir de una solución stock de 2000
mg/L. Las soluciones se prepararon en etanol al 96% y se adicionaron las alícuotas de cada extracto a cada pozo de 5 mL en la multiplaca. Se dejó evaporar el solvente (etanol) por 24 horas y luego de este tiempo se adicionó a cada pozo la solución salina
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y 10 nauplios. Finalmente, al transcurrir un tiempo de 24 horas se realizó el conteo (Jerry, McLaughlin, Lingling, & Rogers, 1998).
4.6.
Aislamiento y preparación de inóculos de los microorganismos a evaluar Para el aislamiento de bacterias y hongos se emplearon cepas conservadas por el JBB (Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp. y Trichordema sp.), y algunas obtenidas del Cepario de la Universidad Javeriana Sede Bogotá (E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923).
Las cepas bacterianas fueron escogidas, teniendo en cuenta su influencia patológica en diferentes grupos de edad, ya que pueden crecer de forma esporádica y muy rápida por estar en flora normal de las mucosas y de la piel, de allí que su principal forma de transmisión es por contacto y algunas de ellas se han empleado en estudios de especies Solanum (Uribe, 2003; Rodriguez & Uribe, 1995).
Para la selección de los hongos se tuvo en cuenta su influencia patológica no solamente en humanos sino también en especies vegetales, como por ejemplo, el Aspergillus sp. genera infecciones asociadas a la atención en salud (Abarca, 2000), Botrytis sp. ataca órganos de las plantas como flores, hojas, yemas, frutos, raíces, pétalos, brotes hasta causar incluso la muerte de la planta (Martínez & Moreno, 2008), Candida sp. puede causar infecciones de esófago, pulmonías e infecciones vaginales (Roncancio & Diana, 2001), Fusarium sp. afecta a pacientes inmunocomprometidos pero normalmente son parásitos de las plantas (Guarro, 2011), Penicillum sp. afecta a personas que trabajen en edificios donde haya crecimiento de este moho generando dolor de cabeza y mucosas irritadas (Matínez, 2003), Rhizopus sp. afecta las vías respiratorias (Méndez, 2018), pero hay casos diferentes donde es apropiado revisar que no genere actividad sobre algunos hongos como la especie Tricoderma sp. que puede ayudar en el crecimiento de las plantas ya que posee una actividad antagonista frente a otros hongos patógenos por poseer un efecto inhibitorio de los componentes de su pared celular cuando estos se degradan (Tovar, 2008).
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Para el aislamiento de las bacterias se utilizó el agar nutritivo (Difco TM ) y de un inoculo previamente preparado, se tomó una muestra con asa redonda realizando aislamiento por agotamiento. Se incubo durante 24 horas a una temperatura 37°C. Por otra parte, para el aislamiento de los hongos se empleó el agar Sabouraud (Scharlau) y se realizó la siembra del hongo el cual se encontraba impregnado en un soporte (papel). Se dispuso a incubar por 5 días a una temperatura de 22°C.
Para la preparación de inóculos se empleó solución salina estéril y se adicionó cada microorganismo hasta una turbidez semejante al patrón de McFarland (Forbes, Sahm, & Weissfeld, 2007). Todo lo anterior se realizó en cabina de flujo laminar (Isocide).
4.7.
Bioensayo por difusión en pozos Mediante el método de difusión en pozo donde se usan dos agares, el Agar Potasio Dextrosa (PDA) marca Himedia ® para hongos y el Mueller-Hinton marca Merck KGaA para bacterias; se tomaron 200 µL de cada inóculo y se dispusieron en las cajas Petri con los respectivos agares para sembrarlos de manera masiva. Transcurridos unos minutos de la siembra se dispone a la realización de 5 pozos de 5 mm en cada caja, perforando el agar como se muestra en la Figura 14 (Sánchez, Castillo, & García,
2016).
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A B C Perforación del agar con pipeta de vidrio para formar los pozos de 5 mm.
Retirar el agar perforado con ayuda de la punta de la pipeta.
Obtención de la cantidad de pozos necesarios.
Figura 15. Procedimiento ensayo por difusión en pozos.
Por cada caja se realizaron 5 pozos y se añadieron 20 µL en cada pozo de las muestras y controles que fueron identificadas como se relaciona en la Tabla 2.
Tabla 2. Identificación de los extractos y controles empleados en los bioensayos de actividad antimicrobiana.
Muestras Identificación Extracto hojas
SCH
Extracto frutos
SCF
Extracto tallos
SCT
DMSO
Control Negativo Clotrimazol Control positivo Hongos Cloranfenicol Control Positivo Bacterias
Las soluciones de los extractos se prepararon de la siguiente manera, se pesaron 30 mg de cada extracto y se disolvieron en 1 mL de DMSO. En la preparación de los controles positivos se tomaron 25 mg de clotrimazol en 25 mL de DMSO y para el caso de cloranfenicol se pesaron 50 mg del contenido de una cápsula y se disolvieron en 25
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mL de DMSO (Sánchez, Castillo, & García, 2016). Por cada caja se sembró un control positivo, un control negativo y tres muestras correspondientes a los extractos y cada extracto por triplicado.
Finalmente, luego de colocar todas las muestras en los pozos, se sellaron las cajas y se dejaron a la temperatura de incubación (27°C hongos y 37°C bacterias) la lectura se realizó al cabo de 24 horas en bacterias y 120 horas en hongos (Sánchez, Castillo, & García, 2016).
4.8.
Fraccionamiento del extracto crudo Se realizó el montaje del extractor Soxhlet que se compone de condensador, cuerpo del extracto y un balón de 100 mL. Se pesaron 2,341 g del extracto crudo de hojas de S. crinitipes, se dispuso en papel filtro formando un cartucho que luego se colocó en el cuerpo del extractor y se sometió a extracción secuencial con cloroformo, acetona y etanol. La extracción se realizó por 3 horas.
Luego cada fracción obtenida se sometió a concentración para eliminar el exceso de solvente y una vez secos se registró el peso. Estas fracciones se evaluaron en el bioensayo de actividad antimicrobiana por difusión en pozos en las mismas condiciones de los extractos. Las fracciones se identificaron de la siguiente manera:
Tabla 3. Identificación de las fracciones del extracto de las hojas de S. crinitipes. Muestras Identificación Fracción con Cloroformo
SCC
Fracción con Acetona
SCA
Fracción con Etanol
SCE
DMSO
Control Negativo Cloranfenicol Control Positivo Bacterias
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4.9.
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) De acuerdo con los resultados anteriores donde se determinó el fraccionamiento con mayor diámetro de halo de inhibición, se dispuso a determinar cuál es la concentración mínima del extracto con la actividad para inhibir el crecimiento de una especie bacteriana.
Se tomaron 30 mg de cada fracción se disolvió en 1 mL de DMSO y a partir de esta solución se prepararon diluciones sucesivas y se obtuvieron soluciones de 15, 7,5, 3,75 y 1,87 mg/mL. Para la preparación del medio que se usó en el ensayo se pesó 1,3 g de caldo nutritivo (Difco TM) que se disolvieron en 100 mL de agua desionizada. dicho medio se dispuso en 16 tubos cada uno con un contenido de 5 mL del caldo y posteriormente fueron esterilizados.
A los tubos estériles con el medio se les agregaron 5 µL del inoculo de la bacteria; a 10 de ellos se les adicionó 5 µL de cada las concentraciones de la fracción por duplicado, 2 tubos fueron tomados como control positivo adicionándoles 5 µL de una solución de cloranfenicol, por último, se tomaron los 2 tubos restantes como control negativo donde se añadieron 5 µL de DMSO. Para completar los 16 tubos, 2 de ellos fueron el control del medio. Finalmente, se ajustaron las tapas de los tubos y se dejaron a la temperatura de incubación (37°C) y la lectura se realizó al cabo de 24 horas.
Tabla 4. Identificación de los extractos y controles empleados en los bioensayos de actividad antimicrobiana.
Muestras Identificación Fracción Acetona (hojas)
SCA
DMSO
Control Negativo Cloranfenicol Control Positivo Bacterias
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5. Resultados y análisis de resultados
5.1.
Extractos etanólicos obtenidos a partir de S. crinitipes A continuación, se reporta la cantidad obtenida de los extractos etanólicos de hojas, frutos y tallos de S. crinitipes por el proceso de maceración. El rendimiento que se obtuvo fue con relación al porcentaje de extracto obtenido/material vegetal seco con el cual se trabajó.
Tabla 5. Cantidad de extracto etanólico obtenidos de los órganos de S. crinitipes. Identificación de extractos y/o fracciones Material vegetal seco (g) Extracto (g) Rendimiento (%)
SCH
Hojas, 69.0
5.354
7.8
SCF
Frutos, 195.0
33.602
17.2
SCT
Tallos, 44.0
2.936
6.7
5.2.
Análisis fitoquímico preliminar En total se realizaron 13 ensayos de los cuales dieron positivo Dragendorff y Wagner para alcaloides en hojas y tallos, Liebermann/Burchard y Salkowski para Triterpenoides y/o esteroides donde el primero dio positivo para frutos y tallos y el segundo para hojas y tallos, Cloruro férrico para Fenólicos / Taninos, Gelatina-sal para Taninos y Erlich para Cumarinas fueron positivos en los tres extractos y finalmente Zn/HCl y Zn/NaOH para Quinonas donde el primero dio positivo para hojas y tallos y el segundo para los tres extractos. Los resultados de las diferentes reacciones se presentan en la Tabla 6.
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Tabla 6. Resultados de análisis fitoquímico preliminar de los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos de S. crinitipes.
Ensayo Metabolitos
SCF
SCH
SCT
Dragendorff Alcaloides
-
++ ++ Wagner
-
++ ++ Liebermann / Burchard Triterpenoides y/o esteroides +
-
+ Salkowski
-
+ + Espuma Saponinas
-
-
-
FeCl3 Fenólicos / Taninos ++ ++ +++ Shinoda Flavonoides
-
-
-
Leucoantocianidinas
-
-
-
Gelatina-sal Taninos + + + Erlich Cumarinas + ++ +++ Baljet Compuestos lactónicos
-
+ + Zn/HCl Quinonas
-
++ ++ Zn/NaOH +++ + +++ Convenciones: (-) Negativo; (+) Dudoso; (++) abundante; (+++) Muy abundante.
5.2.1. Alcaloides
En los ensayos realizados para los extractos etanólicos de hojas y tallos se logró evidenciar un precipitado confirmando de esta manera la presencia de alcaloides. En el género Solanum se reportan los alcaloides esteroidales o glicoalcaloides, entre los que se encuentran Solanumcapsina, Solacasina, Solacapina, Episolacapina, Isosolacapina y O-metil-isosolanocapsina, Solafinidina, Solasodina, Tomatina, Chacocina y Alfasolanina
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(Aliero, Grierson, & Afolayan, 2005; Coy, Cuca, & Orozco, 2005; Martin, 2011; Vijayan, y otros, 2004), y también se han reportado alcaloides tropánicos (Patterson & Hagan,
2002)
La presencia de este tipo de metabolitos secundarios en las plantas, cumplen diversas funciones, tales como defensa contra animales y hongos, de igual manera, presentan una amplia gama de actividades terapéuticas como antimicrobianos, antianalgésicos, antiinflamatorios, diuréticos, antioxidantes y antitumorales (Usubillaga, Aziz, Tettamanzi, Waibel, & Achenbach, 10997; Aliero, Grierson, & Afolayan, 2005; Dongre, Badami, Ashok, Ravi, & Kottani, 2007; Vijayan, y otros, 2004).
5.2.2. Triterpenoides y/o esteroides
Se confirma la presencia de triterpenos y/o esteroides en los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos presentándose levemente el desarrollo de color azul en la interfase. Los esteroides son compuestos esenciales en la estructura vegetal, y existen reportes el género Solanum de triterpenos como el Lupeol, acetato de lupeol, α-amirina, β-amirina y acetato de β-amirina y esteroides sitoesterol y estigmasterol (Pereira , Paes, Rodriguez, Kanashiro, & Vega, 2000). También, se reportan glucósidos esteroidales como βsolamargina, solasonina y α,β-solansodamina (Saijo, y otros, 1982).
5.2.3. Fenólicos / Taninos
Para los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos se observa la formación de precipitado con el reactivo gelatina-sal para la prueba de taninos, siendo un resultado positivo para la presencia de estos compuestos. Estos metabolitos secundarios abarcan a todas aquellas sustancias que poseen varios grupos fenol y cumplen diversas funciones en las plantas como defensa contra herbívoros o patógenos, además, como soporte en la atracción de polinizadores, dispersantes de frutos, además, reducen el crecimiento de las plantas competidoras vecinas (Miranda & Cuéllar , 2002).
La prueba de cloruro férrico, fue positiva para los tres extractos indicando la presencia de taninos. Ese tipo de compuestos se les atribuye la capacidad regeneradora de
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tejidos en la planta, adicionalmente son responsables de la actividad antiinflamatoria, debido a que absorben los productos irritantes de la superficie subcutánea por su acción refrescante disminuyendo el prurito y ardor, lo que contribuye con la cicatrización (Ortiz,
2000).
Los taninos son metabolitos secundarios de sabor amargo, astringentes, que precipitan las proteínas. Estos compuestos están ampliamente distribuidos en muchas especies de plantas, donde juegan un papel importante para alejar a los animales de su consumo y también en la regulación del crecimiento vegetal y se encuentran en hojas, brotes, semillas, raíces, tallos y tejidos de diversas plantas. Aunque siempre se han considerado como nocivos, diversos ensayos muestran sus beneficios a bajas dosis como antivirales, antibacterianos y antiparasitarios (González, Peña, Sánchez, & Santana, 2001; Valencia, 1995).
5.2.4. Cumarinas
Mediante la prueba de cumarinas se observa el cambio a una coloración cereza en los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos obteniendo un resultado positivo del ensayo. Se ha reportado la presencia de cumarinas (esculetina, esoescopolamina) en la especie Solanum validinervium. En relación con la esculetina se han reportado en investigaciones, que posee efectos estrogénicos y que puede ser empleada en terapia de reemplazo hormonal en mujeres postmenopáusicas (Orozco , 2010).
5.2.5. Compuestos lactónicos
Mediante la formación de precipitado en la prueba de Baljet se confirma la presencia de compuestos lactónicos en el extracto etanólico de hojas y tallos, que al comparar con los reportes de otras especies de Solanum se encontró que S. macramtum y S. americanum presentan lactonas terpénicas y lactonas sesquiterpenicas que presentan actividades insecticidas (Hernández, J.; Florez, Y.; Adolfo, G., 2010; Chang , Rosabal , & Morales , 2013).
5.2.6. Quinonas
Al realizar la prueba de Zn el medio ácido y básico con los extractos de S. crinitipes se
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presentó un cambio de coloración a amarillo en todos siendo un resultado positivo para estos metabolitos. La presencia de quinonas y otros principios activos varía de acuerdo con la especie y a otros factores ambientales, además de la calidad de los sitios donde provienen dichas especies, como por ejemplo en la especie S. multifidum los resultados arrojados en su estudio fueron negativos para la identificación de quinonas, lo cual puede concluir que este tipo de metabolitos no se encuentran en todas las especies del género Solanum. Las quinonas son utilizadas en la actualidad como laxantes y/o catárticos. Se hallan presentes en drogas como la cascara sagrada, frangula, aloe, ruibarbo y sen (Soto, 2014).
Otros metabolitos como flavonoides y saponinas no fueron detectados en los ensayos con los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos. Aunque se ha reportado en varias la presencia de flavonoides en S. lycopersicum (Tokusoglu, Unal, & Yildirim , 2003), S. quitoense (Gancel , Alter , & Ruales, 2008), S. tuberosum (Peña & Restrepo , 2013), S. sessiliflorum (Cardona , 2011), S. validinervium (Suarez , Muñoz , & Orozco , 2006), y antocianidinas en S. melongena (Sadilova, Stintzing , & Carle , 2006), S. nigrum (Ramos , Lupetti, Cavalheiro , & Fatibello, 2000) S. nitidum (Villar, 1999).
Las saponinas esteroidales se encuentran ampliamente distribuidas en la familia Solanaceae, estos metabolitos se han encontrado en las hojas y flores de S. multifidum (Vásquez, 2014). Las saponinas tienen una amplia capacidad de formar espuma con el agua, siendo poderosos surfactantes; también causan hemólisis y son potentes toxinas plasmáticas, venenosas para los peces, pero sin efectos tóxicos para los hombres al ser ingeridos (Vásquez, 2014). Adicionalmente, tienen propiedades antiinflamatorias, antialérgicas antivirales y moluscosidas (Lacaille-Dubois & Wagner , 1996). Las saponinas esteroidales, son materia inicial para la preparación de varios productos muy potentes y ampliamente usados como productos farmacéuticos, entre ellos: cortisona, anticonceptivos, estrógenos, testosterona (Vásquez, 2014).
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5.3.
Bioensayo de toxicidad con Artemia salina
5.3.1. Artemia salina (Hojas, Tallos y Frutos)
Los resultados obtenidos de los extractos evaluados en las diferentes concentraciones frente a A. salina se resumen en la Tabla 5. Los datos fueron corridos en Probit del programa estadístico Statgraphics, para conocer la concentración letal para el 50% de la población expuesta (CL50) con una confiabilidad del 95%:
Tabla 7. Resultados del ensayo de toxicidad de los extractos de hojas, tallos y frutos de S. crinitipes.
Dosis Extracto de Hojas Extracto de Tallos Extracto de Frutos mg/L E M/E E M/E E M/E
0
11
0
10
0
10
0
10
0
11
0
12
0
11
0
10
0
10
0
50
12
0,3
10
0,1
10
0,1
10
0,4
10
0
10
0,3
12
0,4
10
0,1
11
0,1
100
12
0,4
10
0
10
0,6
12
0,4
10
0,1
10
0,6
10
0,4
11
0,1
10
0,6
200
10
0,5
11
0,5
11
0,5
10
0,5
10
0,5
10
0,6
10
0,6
10
0,5
10
0,6
500
11
0,6
11
0,6
10
0,9
11
0,5
11
0,6
11
0,9
10
0,4
10
0,7
10
0,8
1000
10
0,8
11
0,6
10
1
10
0,6
10
0,6
11
0,9
10
0,7
10
0,6
11
0,9
Convenciones: E(Expuestos) M(Muertos)
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Las predicciones inversas calculadas para la concentración con el modelo permitieron establecer los valores CL50 para los extractos evaluados y se relacionan en la Tabla 8:
Tabla 8. Valores para la CL50 de los extractos de Hojas, Tallos y Frutos de S. crinitipes. Extracto CL50 (mg/L) Limite Superior (mg/L) Límite Inferior (mg/L) Hojas
460,056
690,277
311,737
Tallos
608,373
786,723
488,659
Frutos
237,432
317,327
169,123
El análisis Probit arrojó gráficas que representan la regresión lineal de la dosis (Línea azul), límite superior y límite inferior (Líneas rojas) y una segunda grafica con valores ajustados. Esta es análisis utilizado para seleccionar extractos crudos con potencial biológico, debido a que se ha demostrado que el crustáceo es sensible a un amplio rango de compuestos con actividad biológica (Meyer, y otros, 1982).
Los resultados se interpretan de la siguiente manera:
CL50 > 1000 ppm: Extracto no toxico CL50 < 1000 y > 200 ppm: Extracto activo CL50 < 200 ppm: Extracto toxico CL50 < 5 ppm: Extracto altamente toxico (Lagarto Parra , Silva Yhebra , Guerra Sardiñas , & Iglesias Buela , 2001).
De igual manera, de acuerdo con lo reportado con Meyer (1982) cualquier compuesto y extracto con un CL50 < 1000 ppm es considerado tóxico. Teniendo en cuenta la anterior escala, los extractos se pueden organizar de acuerdo con el grado de toxicidad de la siguiente manera:
Frutos > Hojas > Tallos
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Según la concentración arrojada en el análisis probit la toxicidad de los extractos estaría entre 1000 y 200 ppm, indicando que son extractos activos. Es decir, que en los extractos hay presencia de compuestos responsables de dicha actividad. Que de acuerdo con los resultados de la marcha fitoquímica es posible que la presencia de fenoles, cumarinas, triterpenoides y taninos se relacionen con la toxicidad para las Artemias (Mirzaei & Mirzaei, 2013).
5.4.
Aislamiento de los microorganismos estudiados
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i) Figura 16. Bacterias y hongos aislados: (a) Escherichia coli, (b) Staphylococcus aureus, (c) Aspergillus sp., (d) Botrytis sp., (e) Candida sp., (f) Fusarium sp., (g) Penicillium sp., (h) Rhizopus sp., (i) Trichoderma sp.
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5.5.
Inhibición extractos etanólicos frente a bacterias (Escherichia coli y Staphylococcus aureus)
5.5.1. Escherichia coli
La evaluación de los extractos frente a la bacteria E. coli fueron positivos para tallos presentando un promedio de halo de 7 mm, para hojas la actividad se presentó en menor proporción que la anterior, y el extracto de frutos no mostro actividad, los halos de inhibición y los porcentajes se presentan en la Tabla 9.
Figura 17. Susceptibilidad de Escherichia coli frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes.
La especie bacteriana E. coli es una bacteria Gram negativa, que tiene una pared compuesta de peptidoglicanos y lipopolisacáridos. Los lipopolisacáridos representan la segunda capa lipídica, que no cuenta solamente de fosfolípidos, sino que también contienen polisacáridos y proteínas. Los lípidos y polisacáridos están estrechamente unidos formando estructuras lipopolisacáridos específicas (Grosvenor, Supriono, & Gray, 1995).
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Tabla 9. Susceptibilidad de Escherichia coli frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes.
Extracto/control Diámetro del Halo (mm) Promedio (mm)
RSD
% CV Sensibilidad
SCT
10
7
2,5
34,5
Baja
7
5
SCH
6
4
4
86,6
Baja
6
0
SCF
0
0
0
0
No Detectada
0
0
Control Positivo
32
33
1,5
4,6
Alta
35
33
Control Negativo
0
0
0
0
No Detectada
0
0
De acuerdo con lo anterior, los mecanismos de resistencia de estas bacterias se pueden generar por la alteración del sitio blanco o diana de antimicrobianos, disminución de la permeabilidad de la pared por tener una pequeña capa de peptidoglicano, la cual es más sensible, adquisición de mecanismos de eflujo y cambios de la vía metabólica externa (Grosvenor, Supriono, & Gray, 1995). Es decir, que el extracto de hojas y tallos de S. cinitipes contiene sustancias capaces de contrarrestar los mecanismos de resistencia del microorganismo, ya que algunos metabolitos secundarios actúan sobre los lípidos de la membrana ocasionando alteraciones y provocando muerte celular (Lizcano & Vergara, 2007).
5.5.2. Staphylococcus aureus
La evaluación de los extractos frente a la bacteria S. aureus fueron positivos para hojas
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presentando un promedio de halo de 9 mm, para frutos la actividad se presentó en menor proporción que la anterior, y la actividad que presento el extracto de tallos fue baja, los halos de inhibición y los porcentajes se presentan en la Tabla 10:
Figura 18. Susceptibilidad de Staphylococcus aureus frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes De acuerdo con la revisión bibliográfica, se encontraron estudios realizados a otras especies del género Solanum donde demostraron la inhibición del crecimiento de S. aureus causándole daños morfológicos, pérdida de la integridad estructural de la pared, membrana y matriz intracelular (Lacombe, Wu, Tyler, & Edwar, 2010; Wu, Qiu , Bushway, & Harper, 2008).
Complementando lo anterior, también se reportan ensayos antimicrobianos, donde se plantea la posible acción de flavonoides y otros compuestos fenólicos para desestabilizar la membrana citoplasmática, permeabilizar la membrana plasmática, inhibir las enzimas microbianas extracelulares y privarlas de los sustratos necesarios para crecer (Puupponen, Nohynek, Alakomi , & Oksman , 2005; Puupponen , y otros, 2005). Según lo detectado en la marcha fitoquímica de los tres extractos de S. crinitipes es posible que la presencia de taninos y compuestos fenólicos se pueden relacionar con el daño de la membrana bacteriana inhibiendo dicho crecimiento (Tavares, 2000).
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Tabla 10. Susceptibilidad de Staphylococcus aureus frente a los extractos de tallos, hojas y frutos de S. crinitipes.
Extractos/Control Diámetro del Halo (mm) Promedio (mm)
RSD
% CV Sensibilidad
SCT
7
6
0,6
8,7
Baja
7
6
SCH
9
9
1
11,1
Baja
10
8
SCF
9
7
2,1
28,5
Baja
8
5
Control Positivo
36
33
2,5
7,5
Alta
31
34
Control Negativo
0
0
0
0
No Detectada
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5.6.
Evaluación del extracto etanólico frente a hongos (Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Trichoderma sp.)
(a) (b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g) Figura 19. Resultado del bioensayo de difusión de pozos de los hongos: (a) Aspergillus sp., (b) Botrytis sp., (c) Candida sp., (d) Fusarium sp., (e) Penicillium sp., (f) Rhizopus sp., (g) Trichoderma sp.
Después de haber realizado el bioensayo de difusión de pozos se obtuvo los siguientes valores para los halos de inhibición:
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Tabla 11. Resultados bioensayo de inhibición frente a hongos patógenos (Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Trichoderma sp.).
Extracto/ Control Aspergillius sp.
Botrytis sp.
Candida sp.
Fusarium sp.
Penicillium sp..
Rhizopus sp.
Trichoderma sp.
SCT
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
SCH
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
SCF
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Control Positivo
33
25
10
14
15
30
10
35
27
15
16
12
29
8
33
30
13
13
14
33
7
Control Negativo
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
De acuerdo con la lectura de los bioensayos de las especies fúngicas (Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Trichoderma sp.), no se presentó actividad inhibitoria de los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos que se emplearon. Teniendo en cuenta los metabolitos secundarios identificados en el análisis fitoquímico preliminar no se logran detectar compuestos que presenten alguna actividad antifúngica, ya que los reconocidos tienden a generar un efecto o actividad en microorganismos como bacterias.
5.7.
Fraccionamiento del extracto de hojas de S. crinitipes con acetona La evaluación de los fraccionamientos frente a la bacteria S. aureus fueron positivos para la fracción de acetona presentando un promedio de halo de 10 mm, para la
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fracción de cloroformo la actividad se presentó en menor proporción que la anterior, y la actividad de la fracción de etanol fue casi nula, los halos de inhibición y los porcentajes se presentan en la Tabla 12.
Figura 20. Resultado de bioensayo del fraccionamiento de cloroformo, acetona y etanol frente Staphylococcus aureus Para el caso del cloroformo, las sustancias que se pueden obtener durante un fraccionamiento son las de baja polaridad como lo son los ácidos grasos y sus derivados o triterpenos y esteroides, seguido se empleó acetona como un segundo disolvente con posibilidad de separar compuestos de mediana y alta polaridad como lo pueden ser los flavonoides, taninos y algunos terpenoides, y por último el etanol puede arrastre los metabolitos que queden en el extracto (Ocampo, 2011).
De acuerdo con estudios realizados de la especie S. nigrum a partir de extracto metanólico de las hojas y diferentes fracciones (n-butanol, acetato de etilo, cloroformo y n-hexano) se determinó el potencial antimicrobiano de la fracción de cloroformo que demostró una buena actividad contra S. aureus (Zubair, y otros, 2011). Adicionalmente, otra investigación donde se aislaron catequinas que es un tipo de flavonoide a partir del fraccionamiento etanólico de la especie S. multifidum obtenido mediante la extracción sucesiva de solventes (éter de petróleo, etanol y agua) (Vásquez, 2014).
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Tabla 12. Resultados bioensayo con las fracciones de cloroformo, acetona y etanol de S. crinitipes frente a Staphylococcus aureus.
Extractos/Control Diámetro del Halo (mm) Promedio (mm)
RSD
CV Sensibilidad
SCC
8
7
0,6
8,2
Baja
8
7
SCA
9
10
1,2
11,5
Baja
11
11
SCE
0
2
1,5
76,4
Baja
3
2
Control Positivo
21
19
1,5
8,0
Alta
18
19
Control Negativo
0
0
0
0
No Detectada
0
0
En relación con el presente proyecto se puede denotar la semejanza para la actividad antibacteriana sobre S. aureus, ya que, en el fraccionamiento con cloroformo, también se presentó inhibición de la especie bacteriana. Aun así, quien presenta mayor halo de inhibición, es el fraccionamiento con acetona que de acuerdo con estudios anteriores se demuestra que compuestos altamente polares, poseen actividad antimicrobiana (Ocampo, 2011).
5.8.
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) De acuerdo con los resultados anteriores se decidió trabajar el fraccionamiento que género el mayor halo de inhibición, en este caso fue con la solvente acetona. Los resultados obtenidos concretan que la actividad antibacteriana del extracto de hojas que pasó por fraccionamiento con solvente inhibe el crecimiento de S. aureus a una
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concentración mínima de 30 mg/mL.
Figura 21. Resultado de la CMI del fraccionamiento de Acetona frente a Staphylococcus aureus Obteniendo lo anterior, se decidió corroborar por medio de una marcha fitoquímica del fraccionamiento con acetona, la presencia de los posibles metabolitos que estén generando dicha actividad, cuyo resultado fue la presencia de alcaloides, taninos y cardiotónicos que, de acuerdo con bibliografía ya mencionada anteriormente, dichos compuestos como por ejemplo los taninos tienen gran actividad antibacteriana frente a esta cepa bacteriana.
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6. Conclusiones
Los metabolitos secundarios identificados en los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos de S. crinitipes mediante el análisis fitoquímico preliminar fueron alcaloides, triterpenos, esteroides, compuestos fenólicos, taninos, cumarinas y quinonas.
La concentración letal media de los extractos de frutos, hojas y tallos de S. crinitipes determinada sobre Artemia salina fue de 237, 460, 608 mg/L respectivamente, siendo el más tóxico de los tres el extracto de frutos.
El extracto etanólico de hojas de S. crinitipes presentó actividad baja sobre Staphylococcus aureus, inhibiendo el crecimiento de dicho microorganismo, y no mostró actividad frente a los hongos Aspergillius sp., Botrytis sp., Candida sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Rhizopus sp. y Trichoderma sp.
Las fracciones de cloroformo y acetona derivadas del extracto etanólico de hojas de S. crinitipes mostraron actividad frente a S. aureus, siendo mayor el halo de inhibición con la fracción de acetona.
La concentración mínima inhibitoria para la fracción de acetona proveniente del extracto etanólico de hojas de S. crinitipes, fue de 30 mg/mL frente a S. aureus, cuya actividad se relaciona por la presencia de alcaloides y compuestos fenólicos como metabolitos presentes en dicha fracción.
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7. Recomendaciones
Evaluar la actividad de los extractos etanólicos de frutos, hojas y tallos de S. crinitipes frente a otras bacterias para establecer si hay mayor incidencia sobre bacterias Gram positivas o Gram negativas, ya que presentó un potencial antimicrobiano.
Continuar con el estudio que permita identificar los componentes activos responsables de la actividad antimicrobiana.
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8. Referencias Bibliográficas
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ANEXOS
ANEXO 1. Resultado del análisis fitoquímico preliminar Resultado del análisis fitoquímico preliminar del extracto etanólico de frutos de S. crinitipes Ensayo de alcaloides: Prueba de Wagner Ensayos de alcaloides:
Reactivo de Dragendorff Ensayo de cumarinas: Prueba de Erlich
No se observo la formación de precipitado café.
No se observo la formación de precipitado café.
Cambio de tonalidad a cereza. Ensayo de flavonoides:
Shinoda Ensayo de flavonoides: Prueba de leucoantocianidinas Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba de Salkowski
No se presenta coloración rojiza. No se evidencio coloración roja. Se evidencio interfase en la reacción. Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba Liebermann-Burchard Ensayo de taninos:
Gelatina con sal Prueba de quinonas:
Comportamiento ácido/base
Ácido
Base
Se evidencia cambio en la coloración cambiando de amarillo a casi incoloro.
Se observa la formación de precipitado.
No se logra cambio en la tonalidad.
No se logra cambio en la coloración.
Ensayo de saponinas:
Prueba de espuma Ensayos de cardiotónicos: Reactivo de Baljet Ensayo de Taninos:
Prueba de FeCl3
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No se forma espuma después de agitar.
No se evidencia precipitado. Se evidencia coloración verde. Resultado del análisis fitoquímico preliminar del extracto etanólico de hojas de S. crinitipes Ensayo de alcaloides: Prueba de Wagner Ensayos de alcaloides:
Reactivo de Dragendorff Ensayo de cumarinas: Prueba de Erlich
Se observa formación de precipitado café.
Se observa la formación de precipitado café.
Se logra observar coloración naranja. Ensayo de flavonoides:
Shinoda Ensayo de flavonoides:
Prueba de leucoantocianidinas Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba de Salkowski
No se logró observar coloración rojiza.
No se logró observar coloración rojiza intensa. Se observa coloración azul en la interfase. Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba Liebermann-Burchard Ensayo de taninos:
Gelatina con sal Prueba de quinonas: Comportamiento ácido/base
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Ácido
Base
No se observa cambio en la coloración, se mantiene el color verde.
Se observa formación de precipitado.
Se observa una coloración amarilla.
Se observa una coloración amarilla.
Ensayo de saponinas:
Prueba de espuma Ensayos de cardiotónicos:
Reactivo de Baljet Ensayo de Taninos:
Prueba de FeCl3
Luego de la agitación no se evidencia la formación de espuma.
Se evidencia formación de precipitado.
Se observó coloración verde. Resultado del análisis fitoquímico preliminar del extracto etanólico de tallos de S. crinitipes Ensayo de alcaloides: Prueba de Wagner Ensayos de alcaloides: Reactivo de Dragendorff Ensayo de cumarinas: Prueba de Erlich
Se evidencia abundante precipitado Se evidencia abundante precipitado Cambio de color a naranja. Ensayo de flavonoides: Shinoda Ensayo de flavonoides: Prueba de leucoantocianidinas Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba de Salkowski
Página | 73
No se evidencia coloración rojiza. No se logra obtener coloración rojiza.
Se observó levemente la formación de interfase de color azul. Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba Liebermann-Burchard Ensayo de taninos:
Gelatina con sal Prueba de quinonas:
Comportamiento ácido/base
Ácido
Base
Se observó de manera inmediata el cambio de color, se evidencio un aclaramiento.
Se presento formación de precipiado.
Se resenta coloración amarilla.
Se resenta coloración amarilla.
Ensayo de saponinas:
Prueba de espuma Ensayos de cardiotónicos: Reactivo de Baljet Ensayo de Taninos:
Prueba de FeCl3
Después de la agitación no se presenta formación de espuma. Se presento formación de precipitado.
Se observó coloración verde.
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ANEXO 2. Bioensayo de toxicidad con Artemia salina
Siembra Artemia salina con concentraciones de 0, 50, 100, 200, 500 y 1000 ppm con los extractos de frutos, hojas y tallos de S. crinitipes. Regresión lineal Modelo Probit (a) (b) (c)
Modelo ajustado con intervalo de confianza del 95% de hojas (a), tallos (b) y frutos (c) de S. crinitipes.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
(X 1000,0) Dosis con intervalos de confianza del 95,0%
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Muertos/Expuestos
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
(X 1000,0) Dosis
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Muertos/Expuestos
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
(X 1000,0) Dosis
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Muertos/Expuestos
Página | 75
(a) (b)
(c)
Representación Muertos/Expuestos con intervalos de confianza del 95% de hojas (a), tallos (b) y frutos (c) S. crinitipes.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
(X 1000,0) Dosis
0,1
1
5
20
50
80
95
99
99,9
porcentaje acumulado
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
(X 1000,0) Dosis
0,1
1
5
20
50
80
95
99
99,9
porcentaje acumulado
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
(X 1000,0) Dosis
0,1
1
5
20
50
80
95
99
99,9
porcentaje acumulado
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ANEXO 3. Resultado del análisis fitoquímico preliminar del fraccionamiento con Acetona hojas de S. crinitipes Ensayo de alcaloides: Prueba de Wagner Ensayos de alcaloides:
Reactivo de Dragendorff Ensayo de cumarinas: Prueba de Erlich
Se observa la formación de precipitado café.
Se observa la formación de precipitado café.
No se observa coloración naranja. Ensayo de triterpenos/esteroides Prueba de Salkowski Ensayo de taninos:
Gelatina con sal Ensayos de cardiotónicos: Reactivo de Baljet
No se observa coloración azul en la interfase.
No se observa formación de precipitado.
Se evidencia formación de precipitado.
Ensayo de Taninos:
Prueba de FeCl3 Prueba de quinonas:
Comportamiento ácido/base
Ácido
Base
No se observó coloración verde. No se observa una coloración amarilla.
No se observa una coloración amarilla.
Cita: Cañón Buitrago, Tania Lizeth, Menco Romero, Miguel Angel (2018), Estudio fitoquímico de la especie vegetal Solanum crinitipes Dunal (Solanaceae) y evaluación de uso como agente antimicrobiano, Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, p. N. https://repository.udca.edu.co/handle/11158/993