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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Caracterización de especies de Candida aisladas de pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos y sus factores asociados a la colonización.

María Carolina Gutiérrez Galvis

Trabajo de Grado para Optar al Título de Magíster en Microbiología

Director Clara Inés Sánchez Suárez Doctora en Microbiología y Genética Molecular

Codirector Yeny Zulay Castellanos Domínguez Magíster en Epidemiología

Universidad Industrial de Santander Facultad de Salud Escuela de Microbiología Maestría en Microbiología Bucaramanga

2025

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Dedicatoria

A Dios, por estar siempre presente y hacerlo posible.

A mi familia, por apoyarme siempre, por su amor incondicional y confianza.

A Daniel, por su compañía, amor y apoyo constante.

A los pacientes en Unidad de Cuidados Intensivos, quiénes son la razón que soporta esta investigación, para quiénes espero con este trabajo contribuir a la mejora en su atención y tratamiento.

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Agradecimientos

A mi mamá por siempre apoyarme, por sus consejos y palabras de aliento cuando siempre lo necesitaba. Gracias por no dejarme caer.

A mi directora Clara Inés Sánchez Suárez, por la oportunidad y la confianza para realizar mis estudios de maestría, por su colaboración y sus enseñanzas.

A mi codirectora Yeny Zulay Castellanos, por su apoyo y asesoría en el diseño metodológico, análisis estadístico y ajustes en el documento.

Al Ministerio de Ciencias, por los recursos y el apoyo económico para realizar mi posgrado a través del proyecto 86269 de la convocatoria 897-2021 para proyectos de CTEI.

Al Hospital Universitario de Santander, a los investigadores del proyecto “Desarrollo de una estrategia de medicina personalizada para el manejo preventivo, diagnóstico y tratamiento de candidiasis en Unidades de Cuidados Intensivos de adultos en el área metropolitana de Bucaramanga” y a mis compañeros de laboratorio 404, por toda la colaboración y contribución para el desarrollo del trabajo.

Al profesor Enrique Mejía e Ian, por su apoyo y asesoría en el montaje e identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF.

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Tabla de Contenido

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Introducción ........................................................................................................................................ 12

Descripción del proyecto ............................................................................................... 13

1.1

Planteamiento del problema y justificación ................................................................. 13

Objetivos ........................................................................................................................ 17

2.1

Objetivo General ............................................................................................................ 17

2.2

Objetivos Específicos .................................................................................................... 17

Cuerpo del trabajo .......................................................................................................... 18

3.1

Marco conceptual ........................................................................................................... 18

3.1.1

Generalidades de Candida spp. ..................................................................................... 18

3.1.2

Unidad de Cuidados Intensivos y colonización por Candida spp. .............................. 19

3.1.3

Colonización e infección por Candida spp. .................................................................. 19

3.1.4

Factores de riesgo para colonización e infección por Candida spp. ........................... 21

3.1.5

Índices de predicción de colonización por Candida spp. ............................................ 21

3.1.6

Métodos para la identificación de Candida spp. .......................................................... 23 3.1.6.1 Métodos para la identificación presuntiva de Candida spp. ................................................ 23 3.1.6.2 Métodos para la identificación definitiva de Candida spp. ................................................. 24

3.2

Antecedentes .................................................................................................................. 25

3.3

Metodología ................................................................................................................... 29

3.3.1

Diseño del estudio .......................................................................................................... 29

3.3.2

Población y muestra ....................................................................................................... 29

3.3.3

Criterios de selección..................................................................................................... 30

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3.3.3.1 Criterios de inclusión: ............................................................................................................ 30 3.3.3.2 Criterios de exclusión: ........................................................................................................... 30

3.3.4

Variables de estudio ....................................................................................................... 31

3.3.5

Instrumento de recolección de datos............................................................................. 31

3.3.6

Caracterización de los participantes del estudio .......................................................... 31

3.3.7

Procesamiento de muestras clínicas.............................................................................. 32

3.3.8

Determinación de la colonización por Candida spp. ................................................... 33

3.3.9

Criopreservación de los aislamientos ........................................................................... 36

3.3.10

Identificación de los aislamientos de Candida spp. ..................................................... 36 3.3.10.1 Identificación por bioquímica y pruebas complementarias. .............................................. 36 3.3.10.1.1 Identificación por RapID Yeast Plus. .............................................................................. 36 3.3.10.1.2 Crecimiento en CHROMagar Candida. ........................................................................... 37 3.3.10.1.3 Agar tabaco........................................................................................................................ 37 3.3.10.2 Identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF................................................ 37 3.3.10.3 Identificación molecular por secuenciación de región ITS ............................................... 39 3.3.10.3.1 Extracción ADN de levaduras. ......................................................................................... 39 3.3.10.3.2 Amplificación de región ITS por técnica de PCR. ......................................................... 39 3.3.10.3.3 Secuenciación de región ITS ............................................................................................ 41 3.3.10.3.4 Análisis de secuencias. ..................................................................................................... 41

3.3.11

Análisis estadístico ........................................................................................................ 42

3.4

Aspectos éticos ............................................................................................................... 43

Resultados ...................................................................................................................... 46

4.1

Descripción sociodemográfica y clínica de los participantes del estudio .................. 46

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4.2

Determinación de la colonización por Candida spp. en pacientes en Unidad de Cuidados intensivos. ........................................................................................................................... 50

4.3

Distribución de especies de Candida colonizante ....................................................... 54

4.4

Asociación de los factores sociodemográficos y clínicos con la colonización por Candida spp. en los participantes del estudio ................................................................................... 59

4.4.1

Análisis bivariado .......................................................................................................... 59

4.4.2

Análisis multivariado ..................................................................................................... 62

Discusión de resultados ................................................................................................. 64

Conclusiones .................................................................................................................. 77

Recomendaciones .......................................................................................................... 78 Referencias Bibliográficas ................................................................................................................. 79 Apéndices ............................................................................................................................................ 94

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Lista de Tablas

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Tabla 1 Estimación del tamaño de muestra del estudio .................................................................. 30 Tabla 2 Composición de la reacción de PCR ................................................................................... 40 Tabla 3 Condiciones de la PCR ......................................................................................................... 41 Tabla 4 Características sociodemográficas de los participantes del estudio................................. 46 Tabla 5 Primera parte, características clínicas de los participantes del estudio .......................... 47 Tabla 6 Segunda parte, características clínicas de los participantes del estudio .......................... 48 Tabla 7 Colonización y tipo de colonización por Candida spp. en los participantes del estudio . 51 Tabla 8 Colonización por Candida spp. según el sitio anatómico. ................................................. 53 Tabla 9 Estimación del índice de colonización en pacientes con siete días de estancia en UCI .. 54 Tabla 10 Distribución de Candida spp. en general y por sitio anatómico ..................................... 55 Tabla 11 Distribución de levaduras general y por sitio anatómico ................................................ 57 Tabla 12 Concordancia de aislamientos identificados por RapID, MALDI-TOF y secuenciación ITS ........................................................................................................................................................ 59 Tabla 13 Análisis bivariado de variables sociodemográficos entre pacientes no colonizados y colonizados.......................................................................................................................................... 60 Tabla 14 Análisis bivariado de variables clínicas entre pacientes no colonizados y colonizados61 Tabla 15 Modelo de regresión propuesto ........................................................................................ 63 Tabla 16 Interpretación de las pruebas del sistema RapID Yeast Plus: ....................................... 122

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Lista de Figuras

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Figura 1 Técnicas de siembra empleadas para el procesamiento de muestras clínicas ............... 33 Figura 2 Sello replicador, placa primaria de SDAC con crecimiento (izquierda) y CHROMagar ™ Candida (derecha). ........................................................................................................................ 34 Figura 3 Impronta del cultivo primario utilizando sello replicador ............................................... 35 Figura 4 Colonización mixta por dos especies diferentes de Candida spp. usando el sello replicador ............................................................................................................................................ 51 Figura 5 Colonización mixta por tres especies diferentes de Candida spp. usando el sello replicador ............................................................................................................................................ 52 Figura 6 Colonización por única especie de Candida spp. usando el sello replicador ................. 52 Figura 7 Dendrograma construido en MBT Compass Explorer utilizando componentes principales (PCA). .................................................................................................................................................. 58 Figura 8 Formato de registro de resultados del sistema RapID Yeast Plus: ................................ 122 Figura 9 Crecimiento en agar tabaco de C. albicans ATCC 14053 (izquierda) y C. dubliniensis NCPF ATCC 3949 (derecha) ........................................................................................................... 123 Figura 10 Observación del agar tabaco a 40x con azul de lactofenol: Ausencia de clamidoconidas (izquierda) y presencia de clamidoconidias (derecha) .................................................................. 124 Figura 11 Muestras en gradilla magnética para recolección de las perlas magnéticas. ............... 129

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Lista de Apéndices

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Apéndice A. Consentimiento informado del macroproyecto........................................................... 94 Apéndice B Tabla de operacionalización de variables ..................................................................... 99 Apéndice C Instrumento de recolección de datos clínicos y sociodemográficos. ........................ 116 Apéndice D Instrumento de recolección de datos microbiológicos .............................................. 117 Apéndice E Agar Sabouraud 2%. (SDA-Merck) ............................................................................ 118 Apéndice F CHROMagarTM Candida .............................................................................................. 119 Apéndice G. Procedimiento para el montaje del panel RapID Yeast Plus (ThermoFisher Scientific,

2004). ................................................................................................................................................. 120

Apéndice H Agar tabaco (Girish Kumar & Menon, 2005) ............................................................ 123 Apéndice I Extracción total de proteínas y montaje para identificar por MALDI-TOF .............. 125 Apéndice J Preparación y montaje del Bacterial Test Standard (BTS – Bruker Daltonik) ......... 127 Apéndice K Protocolo de extracción de ADN utilizando el kit MagMaxTM Viral Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit ............................................................................................................................. 128 Apéndice L Aval del Comité de ética en investigación CEINCI. ................................................. 131

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Resumen

Título: Caracterización de especies de Candida aisladas de pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos y sus factores asociados a la colonización.* Autor: María Carolina Gutiérrez Galvis ** Palabras Clave: Levaduras, Candida, Pacientes, Unidades de Cuidados Intensivos, Colombia. Introducción: La colonización por Candida spp. es considerada uno de los principales factores de riesgo asociado al desarrollo de candidiasis invasiva en los pacientes críticos. Por lo tanto, es fundamental estudiar a nivel local la prevalencia de colonización, distribución de especies y factores asociados para orientar la toma de decisiones clínicas. Objetivo: Determinar las especies de Candida que colonizan a los pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos, así como su asociación con las características sociodemográficas y clínicas. Metodología: Estudio observacional, analítico de corte transversal. Se determinó la colonización por Candida spp. en adultos al momento de ingreso a UCI en muestras de orina, hisopado de piel en axila, ingle, frotis faríngeo y aspirado traqueal. Se sembraron en SDAC 2% y CHROMagarTM Candida para determinar colonización mixta. Los aislamientos fueron identificados mediante RapID Yeast Plus, MALDI TOF y pruebas complementarias. Se realizó un análisis estadístico univariado, bivariado y multivariado determinando la prevalencia de colonización y factores asociados. Resultados: Se estudiaron 114 pacientes, el 73,7% (n=84) presentó colonización por Candida spp., siendo colonización monofocal en el 51,2%(n=43). La zona inguinal correspondió al sitio más colonizado (34,04%, n=48). En total se obtuvieron 183 aislamientos de Candida con predominio de C. albicans (43,7%, n=80) y un 56% de especies no albicans (n=103). La presencia de sepsis (RP=1,34 IC 95% 1,11-1,61, p= 0,020), infección bacteriana localizada (RP=1,31 IC 95% 1,08- 1,58, p= 0,028) y cirugía reciente (RP=0,69 IC 95% 0,51-0,93, p= 0,004) se asoció a la colonización por Candida. Conclusiones: Se generaron los primeros datos en Santander sobre la colonización por Candida en pacientes críticos, evidenciando una alta prevalencia de colonización al ingreso a la UCI, con presencia diferencial de especies de Candida, y encontrando como factores asociados de mayor probabilidad de colonización la presencia de sepsis e infección bacteriana y de menor probabilidad de colonización la cirugía reciente.

* Trabajo de Grado

** Facultad de Salud. Escuela de Microbiología. Maestría en Microbiología. Directora: Clara Inés Sánchez Suárez. Doctora en Microbiología y Genética Molecular. Codirectora: Yeny Zulay Castellanos Domínguez. Magíster en Epidemiología.

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Abstract

Title: Characterization of Candida Species Isolated from Adult Patients admitted in Intensive Care Units and Their Factors Associated with Colonization* Author(s): María Carolina Gutiérrez Galvis** Key Words: Yeasts, Candida, Patients, Intensive Care Units, Colombia

Introduction: Candida spp. colonization is recognized as a major risk factor for the development of invasive candidiasis in critically ill patients. Therefore, it is crucial to assess the local prevalence of colonization, species distribution, and associated risk factors to guide clinical decision-making and improve patient outcomes. Objective: To identify the Candida species colonizing adult patients in the Intensive Care Unit (ICU) and to examine the association of colonization with sociodemographic and clinical characteristics. Methodology: This was an observational, analytical, cross-sectional study. Colonization by Candida spp. was assessed upon admission to adult ICU using urine samples, skin swabs from the axilla and groin, pharyngeal swabs, and tracheal aspirates. Samples were cultured on SDAC 2% and CHROMagar™ Candida to detect mixed colonization. Species identification was performed using RapID Yeast Plus, MALDI-TOF, and supplementary tests. Univariate, bivariate, and multivariate statistical analyses were conducted to determine colonization prevalence and associated factors. Results: A total of 114 patients were included, 73,7% (n=84) of whom exhibited Candida colonization at ICU admission, with monofocal colonization detected in 51,2%(n=43) of cases. The groin was the most frequently colonized site (34,04%, n=48), and 183 isolates were obtained in total, predominantly C. albicans (43,7%, n=80), with 56% isolates identified as non-albicans species n=103. Sepsis (PR=1,34 CI 95% 1,11-1,61, p= 0,020), localized bacterial infection (PR=1,31 CI 95% 1,08-1,58, p= 0,028), and recent surgery (PR=0,69 CI 95% 0,51-0,93, p= 0,004) were found to be significantly associated with Candida colonization. Conclusions: This study provides the first local data on Candida colonization in critically ill patients in Santander, revealing a high prevalence of colonization at ICU admission and highlighting species-specific patterns. The presence of sepsis and localized bacterial infection were associated with an increased likelihood of colonization, while recent surgery was identified as a protective factor.

* Degree Work

**Faculty of Health. School of Microbiology. Master’s in Microbiology. Director: Clara Inés Sánchez Suárez. Ph.D. in Microbiology and Molecular Genetics. Co-director: Yeny Zulay Castellanos Domínguez. Master's Degree in Epidemiology.

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Introducción

Las especies de Candida son levaduras comensales que forman parte integral de la microbiota por su capacidad de adaptación a cambios adversos en el hospedero, colonizando diferentes nichos como la piel, cavidad oral, tractos gastrointestinal, respiratorio y urogenital. Sin embargo, ante cambios en el ambiente promovidos por alteraciones en la microbiota o en el sistema inmune, Candida spp. tiene la capacidad de sobrecrecer, cruzar las barreras epiteliales y causar infección grave (Alves Id et al., 2020).

La candidiasis invasiva es una de las principales enfermedades causadas por el género en pacientes en Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), se asocia con una alta mortalidad atribuible del 49%, pero puede aumentar hasta el 98% en pacientes con shock séptico con retraso en la instauración de terapia antimicótica (Liew et al., 2015; Thomas-Rüddel et al., 2022). Se ha reconocido que la colonización por Candida spp. tiene un impacto significativo en el desarrollo de candidiasis invasiva, junto con factores clínicos relacionados a la condición crítica base del paciente y a procedimientos médicos invasivos a los cuales son sometidos (Cortes et al., 2020; Logan et al., 2020; Thomas-Rüddel et al., 2022).

En nuestro medio, no se han realizado estudios relacionados a la colonización por Candida spp. en pacientes adultos en UCI ni se conoce la distribución de especies implicadas y los factores sociodemográficos y clínicos asociados, por lo tanto, el presente estudio proporciona los primeros resultados en la región para aportar a la epidemiología local que sirva de guía a los clínicos para el manejo de la conducta clínica y terapéutica del paciente.

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1. Descripción del proyecto

1.1 Planteamiento del problema y justificación

La UCI es un escenario clínico donde se presta el cuidado a pacientes que sufren enfermedades que amenazan la vida o corren el riesgo de desarrollarlas, ofreciendo provisión de soporte y monitoreo avanzado de órganos, con un abordaje médico multidisciplinar para minimizar la morbilidad y mortalidad de los pacientes (Jackson & Cairns, 2021). La candidiasis invasiva es reconocida como la principal micosis asociada al cuidado crítico, con una mortalidad entre el 40 al 55%, asociada a factores que constituyen un riesgo para adquirir la infección como el uso de antibióticos de amplio espectro, el tratamiento inmunosupresor, la administración de nutrición parenteral total y la colonización por Candida spp., entre otros; con impactos en la morbilidad, mortalidad, prolongación de la estancia hospitalaria y aumento de los costos asociados a la atención en salud (Logan et al., 2020).

Considerando el impacto que la candidiasis invasiva genera en los pacientes críticamente enfermos, se han desarrollado estrategias encaminadas a la identificación de pacientes en alto riesgo que pueden beneficiarse de una terapia profiláctica para evitar la progresión a infección grave y mejorar la supervivencia de los pacientes.

El desarrollo de estas estrategias está basado en estudios de asociación entre las características sociodemográficas y clínicas de los pacientes con colonización e infección por Candida spp., así como asociación con la distribución de especies y los patrones de susceptibilidad a los antifúngicos, teniendo como objetivo el desarrollo de modelos predictivos que puedan aplicarse en los servicios de UCI. Sin embargo, dada la diversidad epidemiológica de la candidiasis y las diferencias inherentes de los grupos de pacientes críticos a nivel global, se imposibilita la

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generalización de estas estrategias para implementar aplicaciones clínicas realmente eficaces (Lau et al., 2015).

El diagnóstico de infecciones fúngicas ha aumentado principalmente en los pacientes en la UCI por la presencia de factores de riesgo intrínsecos y extrínsecos. Entre ellos se destacan las condiciones críticas asociadas con estados severos y continuos de inmunosupresión, así como la práctica de procedimientos invasivos, lo cual permite la colonización por Candida spp., considerada el primer paso hacia una infección grave (Caggiano et al., 2011). En los pacientes en la UCI, la colonización por Candida spp. se considera uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de candidiasis invasiva (Eggimann et al., 2014); con una estimación de colonización al ingreso a la UCI del 5% al 15%, aumentando esta proporción hasta al 50 - 80% de los pacientes conforme a la prolongación de su estancia en esta área hospitalaria, donde del 5 al 30% de ellos desarrollan candidiasis invasiva (León et al., 2014). Así, un estudio prospectivo multicéntrico realizado en Lisboa reportó un 27,3% de colonización al ingreso al servicio de UCI y aumenta al 42.9% y 52,7% al quinto y octavo día de estancia, respectivamente (Nascimento et al., 2024). La colonización en la mayoría de los casos es de origen endógeno por la presencia de Candida spp. como parte de la microbiota, aunque se sugiere una transmisión alternativa a partir de fuentes exógenas como el medio ambiente o los trabajadores de la salud (Jacobs et al., 2015).

La alta proporción de pacientes colonizados por Candida spp. y la distribución de especies en UCI se ha asociado a factores clínicos y sociodemográficos de los pacientes (Eggimann et al., 2003; Eggimann & Pittet, 2014; Gloeckner & Abel, 2010; Van Bang et al., 2020). A nivel mundial, el 90% de los aislamientos corresponden a especies de Candida albicans, Nakaseomyces glabratus (anteriormente Candida glabrata), Candida tropicalis, Candida parapsilosis y Pichia kudriavzevii

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(anteriormente Candida krusei), siendo Candida albicans la especie más común (abarcando del 38 al 70% de los casos) a pesar de que su incidencia ha disminuido con el tiempo mientras se ha evidenciado un aumento en la detección de especies de Candida no albicans (Colombo et al., 2006, 2017; Oñate et al., 2019; Quindós, 2014).

Resulta importante evaluar la colonización y distribución de especies de Candida en estos pacientes con el fin de guiar un tratamiento oportuno, reduciendo el riesgo de candidiasis invasiva, la cual es considerada la principal causa de micosis intrahospitalaria, con la candidemia como la forma clínica que ocurre con mayor frecuencia. Según Nucci et al. 2013 y Cortés et al, 2020 en Colombia se presenta hasta en el 88% de las infecciones fúngicas en pacientes hospitalizados, con una mortalidad que oscila entre el 36% y el 40% (Cortes et al., 2020; Nucci et al., 2013). Considerando lo anterior, es necesario determinar los factores asociados a la colonización por Candida spp. en este ambiente hospitalario en el Hospital Universitario de Santander. Esta necesidad también se justifica dada la escasa información disponible de la epidemiología de candidiasis en Colombia y en específico en el departamento de Santander, teniendo en cuenta que no se han realizado estudios previos en la región que documenten el estado de colonización por Candida spp. de los pacientes críticamente enfermos.

La identificación de estos factores aportará a la epidemiología regional que orienta a la toma de decisiones clínicas en torno al manejo de los pacientes. Finalmente, la ejecución del proyecto aporta al desarrollo del trabajo de los profesionales de la salud al mejorar el cuidado de los pacientes, teniendo en cuenta la generación de datos específicos sobre prevalencia y factores asociados a la colonización por Candida a nivel local, contribuyendo también al conocimiento científico permitiendo el desarrollo profesional y la formación de habilidades de investigación.

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En el contexto planteado, surge la pregunta de investigación: ¿Cuáles son las características sociodemográficas y clínicas de pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos asociadas a la colonización por Candida spp?, generando como hipótesis de investigación que la colonización por Candida spp. en pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos está asociada a la edad, el sexo, y la presencia de infección bacteriana concurrente.

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2. Objetivos

2.1 Objetivo General

Determinar las especies de Candida que colonizan a los pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos, así como su asociación con las características sociodemográficas y clínicas.

2.2 Objetivos Específicos

Caracterizar sociodemográfica y clínicamente pacientes adultos que ingresan al servicio de Unidad de Cuidados Intensivos en el Hospital Universitario de Santander. Determinar la frecuencia y el tipo de colonización por Candida en la población de estudio. Establecer el perfil de distribución de especies de Candida en la población de estudio, mediante la identificación a nivel de especie con métodos convencionales y MALDI-TOF. Determinar los factores sociodemográficos y clínicos asociados a la colonización por Candida spp. en la población de estudio.

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3. Cuerpo del trabajo

3.1 Marco conceptual

3.1.1 Generalidades de Candida spp.

Las levaduras son organismos unicelulares, ubicuos, que en su mayoría se reproducen por gemación formando blastoconidias y otras estructuras como pseudohifas, hifas verdaderas y clamidoconidias las cuales permiten orientar su identificación presuntiva a nivel de género y especie a través de microscopía y pruebas bioquímicas. Los géneros Candida y Cryptococcus son considerados los de mayor importancia clínica (Walsh et al., 2018). Las levaduras del género Candida pertenecen a la familia Saccharomycetaceae de las cuales se han identificado cerca de 200 especies. Sin embargo, en los últimos años los avances en los estudios moleculares han provocado re-arreglos taxonómicos separando especies del género Candida en géneros diferentes tales como Nakaseomyces glabratus (antes C. glabrata), Pichia kudriavzevii (antes C. krusei), Meyerozyma guilliermondii (antes C. guilliermondii), Clavispora lusitaniae (antes C. lusitaniae) y Kluyveromyces marxianus (antes C. kefyr), entre otros (Kidd et al., 2021; Takashima & Sugita, 2022). Se reconoce a Candida albicans, Nakaseomyces glabratus, C. parapsilosis, C. tropicalis y Pichia kudriavzevii como las especies más comúnmente asociadas a enfermedad infecciosa y otras como C. auris, Meyerozyma guilliermondii, Clavispora lusitaniae y C. metapsilosis son consideradas especies emergentes de interés particular por su rápida expansión a nivel global, con reporte de brotes (Alves Id et al., 2020). En los humanos, se han identificado diversas especies como comensales y colonizadoras del tracto gastrointestinal, tracto respiratorio superior, piel, boca y mucosa vaginal. Sin embargo, se consideran los patógenos oportunistas más comunes en humanos causando morbilidad y mortalidad en los hospederos,

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representando aproximadamente el 80% de todas las infecciones nosocomiales por hongos las cuales son de rápida progresión, frecuentemente graves y difíciles de diagnosticar (Campos Junqueira et al., 2020; Magalhães et al., 2015).

3.1.2 Unidad de Cuidados Intensivos y colonización por Candida spp. La Unidad de Cuidados Intensivos se define como un servicio interdisciplinario especializado, los cuáles prestan atención a pacientes críticamente enfermos con mayor capacidad de seguimiento y múltiples estrategias de soporte para mantener la vida durante un período crítico de salud que puede ser potencialmente mortal (Asociación Colombiana de Medicina Critica y Cuidado Intensivo. AMCI, 2022). En particular, el Hospital Universitario de Santander (HUS) es una institución pública de salud de orden departamental de tercer nivel de atención que cuenta con tres pisos de UCI adultos polivalente con 53 camas plenas, ubicados en el tercer, cuarto y noveno piso, con una relación de atención de tres pacientes para una enfermera y auxiliar de enfermería y en total cuenta con 64 enfermeras y 64 auxiliares de enfermería. Teniendo en cuenta el estado crítico de salud de este grupo de pacientes, junto con el uso extendido de antibióticos de amplio espectro y la práctica de procedimientos invasivos, la colonización por Candida ha adquirido relevancia como un predictor del desarrollo de candidiasis invasiva, considerada la enfermedad fúngica más prevalente en las Unidades de Cuidados Intensivos (Alenazy et al., 2021), debido a que el estado de colonización antecede la infección, siendo incorporada este factor dentro de herramientas predictivas para la candidiasis invasiva.

3.1.3 Colonización e infección por Candida spp.

Las especies de Candida son colonizadoras tempranas formando parte del microbioma del hospedero. Principalmente, colonizan el tracto gastrointestinal, dada la capacidad de adherirse a las células epiteliales y mucosas, de resistir e interactuar con la respuesta inmune y de competir y

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cooperar con otros miembros de la microbiota. Además, el polimorfismo de algunas especies, que permite cambiar de la forma levaduriforme a filamentosa, considerada patogénica, le otorga la posibilidad de invadir tejidos y favorecer la formación de biopelículas en el hospedero y en dispositivos médicos (Romo & Kumamoto, 2020).

La distinción entre colonización e infección por Candida spp. es compleja. Según el proyecto EPCAN (Estudio de prevalencia de Candidiasis) (León et al., 2009), la colonización por Candida spp. es definida como la presencia de la levadura en muestras control de vigilancia como las obtenidas de orina, aspirados traqueales, orofaringe, tracto gastrointestinal o heces. Se puede considerar monofocal cuando se aísla de un solo sitio corporal y multifocal cuando es aislada simultáneamente de varios focos. Otros autores definen la colonización por Candida spp. como el crecimiento repetido de la levadura en al menos dos sitios diferentes (Caggiano et al., 2011). En contraste, la infección por Candida spp. es definida como el aislamiento de la levadura de acuerdo con los siguientes criterios (León et al., 2009):

Crecimiento de la levadura en muestras estériles como hemocultivos, líquidos intraoculares, pleural o pericárdico, muestras obtenidas de la cavidad abdominal durante procedimiento quirúrgico u otro tipo de muestra no considerada de vigilancia.

Fondoscopia compatible con endoftalmitis por Candida spp. en paciente con sepsis clínica.

Candidiasis histológicamente documentada.

El panel de expertos del proyecto FUNDICU (Invasive Fungal Diseases in Adult Patients in Intensive Care Unit) (Bassetti et al., 2024) presentó las definiciones consenso de diagnóstico comprobado de Candidemia y Candidiasis Invasiva en pacientes no neutropénicos en UCI: Candidemia comprobada: Aislamiento de Candida spp. de al menos un hemocultivo obtenido por venopunción (No de un catéter).

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Candidiasis invasiva: La identificación de Candida spp. proveniente de sitios estériles mediante técnicas de microscopía directa, cultivo o histología define la candidiasis invasiva (ya sea candidemia o candidiasis profunda). La evidencia histológica de células en gemación compatibles con Candida spp. define directamente la candidiasis invasiva comprobada. Sin embargo, la observación de hifas o pseudohifas requiere la identificación de especies mediante PCR o cultivo, teniendo en cuenta que pueden observarse estas estructuras en otras levaduras. 3.1.4 Factores de riesgo para colonización e infección por Candida spp. Los factores de riesgo o determinantes se definen como una característica, condición o variable que está asociada con el incremento del riesgo de una enfermedad o infección (Definition of Microorganism - NCI Dictionary of Cancer Terms - NCI). Pueden considerarse intrínsecos cuando están presentes durante el tiempo de estancia hospitalaria y estén relacionados con la condición clínica del paciente o enfermedad previa, tales como el tiempo de hospitalización, la microbiota colonizadora, inmunosupresión, falla renal y hepática y, extrínsecos cuando son debidos a intervenciones realizadas para el control o tratamiento de enfermedades agudas o crónicas como la realización de procedimientos médicos invasivos entre los que se incluyen las cirugías, la nutrición parenteral, el uso de catéter intravascular, entre otros (León et al., 2009). Con respecto a los factores asociados a infección y colonización por Candida spp., el principal factor de riesgo es la gravedad de la condición base del paciente que conlleva a factores adicionales de riesgo descritos previamente (Cortés et al., 2020; Logan et al., 2020). 3.1.5 Índices de predicción de colonización por Candida spp.

Teniendo en cuenta que la colonización por Candida spp. es el primer paso para el desarrollo de infección invasiva se han establecido reglas de predicción clínica que incorporan

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factores del hospedero junto con la colonización para identificar a los pacientes críticos en riesgo de desarrollar candidiasis invasiva.

La colonización por Candida puede ser estimada a través de índices de predicción: Índice de Colonización (Colonization index CI): Propuesto por Pittet (Pittet et al., 1994) como una herramienta clínica de uso periódico para evaluar el riesgo temprano de desarrollar candidiasis invasiva en pacientes de riesgo y que puedan beneficiarse de un tratamiento antifúngico temprano. Se define como la proporción entre el número de sitios, diferentes a sangre, colonizados por Candida spp. con respecto al total de sitios cultivados. Su punto de corte es 0,5, dado que se encontró que este valor permite la identificación de todos los pacientes infectados días antes del diagnóstico propio de infección.

𝐶𝐼= 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑡𝑖𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝐶𝑎𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑠𝑝𝑝.

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑡𝑖𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑎𝑑𝑜𝑠

Candida Score: Es una herramienta clínica basada en un sistema de puntuación propuesto por León et al. (2006) para identificar pacientes con estancia en UCI no neutropénicos en riesgo de desarrollar candidiasis invasiva, basada en la combinación de varios factores de riesgo clínicos y microbiológicos probados mediante análisis de regresión logística: Cirugía previa, colonización multifocal, nutrición parenteral total y sepsis severa, asignando un punto a cada uno de los tres primeros factores si están presentes y dos puntos a sepsis severa si está presente. Un Candida score mayor o igual a 3 se asocia con un riesgo elevado de candidiasis invasiva, sugiriendo que el paciente podría beneficiarse de una terapia antifúngica empírica (León et al., 2006, 2009).

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3.1.6 Métodos para la identificación de Candida spp.

Es necesario el uso de métodos que permitan la identificación precisa de la levadura para garantizar un tratamiento efectivo, prever el pronóstico de la enfermedad, comprender la epidemiología de las infecciones fúngicas y prevenir recurrencias. Dentro de los métodos de identificación, se describen los siguientes:

3.1.6.1 Métodos para la identificación presuntiva de Candida spp. Basados en la

observación y descripción de las características macroscópicas y microscópicas en medios de cultivo sólidos o líquidos enriquecidos como el agar Sabouraud Dextrosa, agar harina de maíz, y en el uso de agares cromogénicos para la detección cualitativa de las especies de Candida de mayor importancia clínica y de ciertas pruebas como prueba del tubo germinal, prueba de agar tabaco, ureasa y crecimiento a 37ºC (Identificación y Sensibilidad a Los Antifúngicos En Levaduras Del Género Candida - 2021 | Campus Virtual de Salud Pública (CVSP/OPS), n.d.). CHROMagarTM Candida: Es un medio cromogénico selectivo para la detección cualitativa, diferenciación e identificación presuntiva de especies de C. albicans, C. tropicalis, P. kudriavzevii y N. glabrata mediante la coloración diferencial que adquieren las colonias en el medio de cultivo (CHROMagarTM, 2022). Resulta útil en la determinación de colonización e infección mixta. Existen diferentes marcas que producen medios de cultivo cromogénico para la identificación y diferenciación de especies de Candida tales como HiCromeTM Candida Differential Agar (HiMedia, n.d.), BrillianceTM Candida Agar (ThermoFisher Scientific, n.d.) que permite la identificación de C. albicans y C. tropicalis de otras especies de Candida y otros medios que permiten la identificación presuntiva de C. auris como el CHROMagarTM Candida Plus (CHROMagarTM, n.d.) y el HardyCHROMTM Candida + auris (Hardy Diagnostics, n.d.) que permite la diferenciación por la morfología de las colonias, el color y la fluorescencia con luz UV.

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3.1.6.2 Métodos para la identificación definitiva de Candida spp. Basados en las

características fisiológicas y bioquímicas de las levaduras tales como la fermentación de azúcares, asimilación de compuestos carbonados, nitrogenados o, la acción enzimática sobre diferentes sustratos. Corresponden a kits comerciales manuales (API 20C AUX, RapID Yeast Plus, entre otros) o automatizados (Vitek, Phoenix o Microscan) de uso en la rutina del laboratorio de microbiología al identificar las especies de Candida más comunes en la clínica. Sin embargo, su habilidad de identificar especies muy relacionadas filogenéticamente (complejo de especies crípticas) puede ser limitado, siendo necesario confirmar la identificación con métodos como MALDI-TOF o técnicas basadas en biología molecular (Ceballos-Garzón et al., 2019.; Marklein et al., 2009).

Sistema RapIDTM Yeast Plus (Remel): Es un micro método cualitativo que utiliza 18 sustratos convencionales y cromogénicos para la identificación de levaduras, microorganismos levaduriformes y relacionados aislados a partir de muestras clínicas humanas. El sistema de identificación se basa en la degradación de sustratos específicos por parte de los microorganismos detectados por sistemas indicadores (Remel, 2019).

MALDI-TOF: Es una técnica basada en la espectrometría de masas de determinación estructural que permite estudiar la distribución de las moléculas de una muestra en función de su masa. La introducción de la ionización suave permitió el análisis de biomoléculas de gran tamaño utilizando un láser como fuente de ionización y una matriz orgánica. Las siglas de MALDI-TOF MS significan “Espectrometría de masas con ionización-desorción asistida por matriz con tiempo de vuelo”. Es actualmente utilizada para la identificación de microorganismos al permitir el análisis de macromoléculas (proteínas ribosómicas) entre los 2.000 Da y los 20.000 Da, constituyendo el espectro de un microorganismo considerado como una huella peptídica, propia

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de cada especie microbiana. Este perfil espectral es comparado mediante un programa informático con una base de datos de espectros construida a partir de cepas de referencia, permitiendo la identificación del microorganismo (Maldonado et al., 2018). Es una técnica de alto rendimiento, bajo coste de reactivos, rapidez de resultados (minutos) y fácil de usar (Marina Oviaño García et al., 2019). En particular, la identificación de levaduras se lleva a cabo posterior a un proceso de extracción con ácido fórmico directo o a un proceso de extracción total de proteínas con etanol absoluto, ácido fórmico al 70% y acetonitrilo, utilizando como matriz un compuesto orgánico de bajo peso (HCCA ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico). Uno de los sistemas más utilizados para la identificación, MALDI Biotyper ® (Bruker) presenta una sensibilidad del 98,7% para las especies prevalentes de Candida y del 96,7% para las especies menos frecuentes (Teke et al., 2021). Identificación molecular: Basada en la amplificación por PCR y secuenciación convencional de regiones genómicas, ha demostrado ser una alternativa robusta a la identificación convencional de levaduras y de vital importancia para establecer relaciones filogenéticas. Se logra a través de la secuenciación de las regiones de espaciadores transcritos internos (ITS) del ribosoma nuclear o el análisis de la región D1/D2 del rRNA 26s (Posteraro et al., 2015). La longitud promedio de la región ITS es de 550 pares de bases (pb) en los hongos, aunque varía entre géneros y especies (Nilsson et al., 2015). Sin embargo, es una metodología que requiere una infraestructura, equipos especializados y personal altamente capacitado (Zuluaga et al., 2018).

3.2 Antecedentes

El perfil epidemiológico de Candida ha cambiado con el tiempo entre regiones y países, con variación en la distribución de especies implicadas en colonización e infección (candidiasis y candidemia) por área geográfica, factores epidemiológicos locales, condiciones clínicas del paciente y exposición previa a tratamientos antibióticos (Ahmed et al., 2018; Pappas et al., 2018).

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Cortés et al., (2011), reportaron en Colombia a C. albicans como la especie predominante (38% - 70%). Sin embargo, como indicó Colombo et al., (2006), en los últimos años la etiología de la colonización e infección por Candida ha estado representada por la presencia de otras especies no albicans, que constituyen entre el 35% y 55% de los aislamientos clínicos. Con respecto a la distribución de especies de Candida en colonización, en un estudio retrospectivo en Vietnam, Truong Sinh et al., (2017) reportaron a C. tropicalis (45,7%) como la especie más aislada de diversos sitios anatómicos de pacientes en UCI, seguido por C. albicans (42,6%), encontrada principalmente de boca y heces y por C. parapsilosis, de boca y tráquea (7,53%). En España, León et al., (2009) en el Estudio de Prevalencia de Candidiasis (EPCAN) realizado en pacientes no neutropénicos críticamente enfermos de diferentes centros hospitalarios españoles determinaron que el 52,2% de los pacientes se encontraban colonizados, siendo monofocal en el 43% y multifocal en el 56% de los casos con C. albicans como la especie más prevalente en colonización (72,1%), seguida por N. glabratus (9,1%) y C. tropicalis (4,2%). Sin embargo, en un 13% de los aislamientos no se logró la identificación de la especie de Candida, lo que refleja la importancia del uso de métodos de identificación precisos. En Chile, Alburquenque et al., (2013) realizaron un estudio de vigilancia de especies de Candida aisladas de diversos sitios anatómicos en pacientes hospitalizados y ambulatorios, encontrando mayor aislamiento en las muestras respiratorias, incluyendo lavados broncoalveolares y aspirado traqueal y, en muestras de orina, siendo la especie más frecuentemente aislada C. albicans (84,8%), tanto en pacientes hospitalizados como ambulatorios, seguida por N. glabratus (7,6%), C. tropicalis (2,7%), C. parapsilosis (2,2%), C. kefyr (0,9%) y otras como M. guilliermondi, P. kudriavzevii, C. intermedia y C. lusitaniae (1,8%).

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En Colombia, pocos estudios se han realizado respecto a las especies implicadas en procesos de colonización dado que los existentes a la fecha describen la distribución de especies causando infección invasiva; Méndez-Fandiño et al., (2017) realizaron un estudio retrospectivo de casos y controles con el fin de evaluar la influencia de la colonización de vía aérea por Candida spp. en pacientes con EPOC en una UCI en Colombia, encontrando en mayor proporción aislamientos de C. albicans (75-76%), seguido de P. kudriavzevii, N. glabratus y C. tropicalis, sin encontrar diferencias significativas entre los pacientes control y con EPOC respecto a la distribución de especies de Candida spp.

Respecto al estudio de factores de riesgo asociados con la colonización e infección invasiva por Candida. Singla et al., (2012) encontró asociación estadísticamente significativa entre el uso de antibióticos de amplio espectro y el aumento en la colonización por Candida debido a la alteración en el microbioma intestinal, así como el uso de catéter urinario. Por otra parte, Logan et al., (2020) refieren que la administración de una terapia antifúngica temprana profiláctica o empírica puede resultar contraproducente al seleccionar las especies resistentes, transformando el patrón de distribución de especies colonizantes de Candida, principalmente por especies no albicans como C. parapsilosis, P. kudriavzevii y N. glabratus. Es así como en Estados Unidos, se han reportado aislamientos de N. glabratus resistentes a equinocandinas asociados con la exposición previa a estos medicamentos y a una estancia de hospitalización prolongada. En China, Xia et al., (2022) realizaron un estudio prospectivo reportando a C. albicans como la especie predominante en la colonización en un 55% de los casos y encontrando asociación entre factores de riesgo como intervenciones invasivas, cáncer e infecciones bacterianas y fúngicas concurrentes. En Alemania, un estudio prospectivo realizado por Gloeckner & Abel, (2010) reportó colonización en el 43% de los pacientes del servicio de UCI, con una distribución de especies de

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C. albicans (69%), N. glabratus (35%) y C. tropicalis (8%) evidenciando un índice de

colonización (IC) más alto en mujeres con respecto a los hombres, un aumento en la colonización por especies no albicans conforme la edad aumenta y una mayor tasa de colonización en pacientes con estancia prolongada en el hospital.

En Colombia, los estudios realizados de factores asociados con procesos infecciosos y de colonización por Candida son limitados. Un estudio respecto a la epidemiología de candidemia en Latinoamérica realizado por Nucci et al., (2013) reportó que aproximadamente del 37 al 45% de los pacientes con candidemia estaban hospitalizados en UCI, con cáncer como factor de riesgo predominante. Cortés et al., (2014) en un estudio prospectivo en hospitales de Bogotá no encontraron asociación entre las características de los pacientes con la distribución de especies y la mortalidad. Por su parte Orozco y colaboradores en un estudio en UCI neonatal determinaron un 38% de colonización en neonatos con predominio de C. albicans (superior al 60%), identificando la estancia en el servicio como un factor de riesgo para la colonización (Orozco et al., 2009). Por otra parte, Escandón y colaboradores documentaron brotes de C. auris, reportando un 41% de colonización de pacientes, trabajadores de la salud y el ambiente (Escandón et al., 2019). C. auris es considerada una especie de levadura de vigilancia en Colombia dado su potencial de transmisión nosocomial y el reporte de casos a nivel global de resistencia a múltiples antifúngicos como el fluconazol, la anfotericina B y en menor proporción a las equinocandinas, consideradas los antifúngicos de elección para la candidemia (Escandón et al., 2022; Friedman & Schwartz, 2019).

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3.3 Metodología

3.3.1 Diseño del estudio

Estudio observacional, analítico de corte transversal (Hernández & Velasco-Mondragón,

2000).

Para el desarrollo del trabajo de grado, las muestras clínicas fueron proporcionadas por el macroproyecto “Desarrollo de una estrategia de medicina personalizada para el manejo preventivo, diagnóstico y tratamiento de candidiasis en Unidades de Cuidados Intensivos de adultos en el área metropolitana de Bucaramanga” código 86269 de la convocatoria 897-2021 para proyectos de CTEI, dentro del cual se enmarca el presente estudio. Las muestras fueron tomadas de los participantes que firmaron el consentimiento informado del macroproyecto (Ver Apéndice A) autorizando previamente el uso de las muestras para estudios relacionados de Candida spp. y determinación de factores asociados a la colonización. Se determinó la colonización por Candida spp. en pacientes adultos que ingresaron al servicio de UCI del Hospital Universitario de Santander durante un período de reclutamiento de 8 meses y que cumplían con los criterios de selección establecidos.

3.3.2 Población y muestra

La población del estudio corresponde a pacientes mayores de 18 años, de ambos sexos que ingresaron a los servicios de UCI del Hospital Universitario de Santander. Para la muestra del estudio se incluyeron de manera secuencial a los pacientes que cumplieron con los criterios de selección en un marco de tiempo de 8 meses y que firmaron el consentimiento informado estipulado para el macroproyecto.

La estimación del tamaño de muestra se realizó a partir de factores asociados a la colonización por Candida spp. previamente reportados en la literatura. Se consideraron factores

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como: la edad, el sexo, y la presencia de coinfección bacteriana, presentando el tamaño de muestra estimado para identificar asociación con estos factores. La estimación fue realizada con el software Epidat 4.2 (Tabla 1).

Tabla 1 Estimación del tamaño de muestra del estudio Variable %Casos Expuestos %Controles expuestos OR Referencia n estimado Sexo (masculino)

70,69

2,948

(Xia et al., 2022)

114

Edad>65 años

60,34

16,67

7,605

Infección bacteriana concurrente

72,41

46,67

2,999

112

Para la selección de la muestra se utilizó la técnica de muestreo no probabilístico por conveniencia, donde los participantes fueron seleccionados por la disponibilidad y voluntad de participar, teniendo en cuenta los criterios de selección.

3.3.3 Criterios de selección

3.3.3.1 Criterios de inclusión:

Pacientes de ambos sexos, mayores de 18 años que ingresen al servicio de UCI del Hospital Universitario de Santander.

3.3.3.2 Criterios de exclusión:

Pacientes con diagnóstico de infección por Candida spp. comprobada o con sospecha un mes antes del ingreso al servicio de UCI.

Pacientes que hayan recibido tratamiento antifúngico un mes previo al ingreso a UCI. Mujeres embarazadas.

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Pacientes con neutropenia severa.

3.3.4 Variables de estudio

Para la caracterización de los pacientes y la determinación de factores asociados, se analizaron las variables sociodemográficas y clínicas a partir de los datos clínicos de los participantes debidamente anonimizados y proporcionados por el Hospital Universitario de Santander, así como variables relacionadas a las muestras y con los aislamientos de la levadura, todas estas corresponden a las variables independientes. Se describen en el apéndice B: Tabla de operacionalización de variables. La variable dependiente corresponde a la colonización por Candida spp., definida como el crecimiento de la levadura en agar Sabouraud al 2% (SDA) dentro de los 5 días de incubación, en alguna de las muestras no estériles (Hisopado de piel en zona axilar, inguinal, orina, frotis faríngeo y/o aspirado traqueal) colectadas para el estudio.

3.3.5 Instrumento de recolección de datos

Los datos de los registros clínicos debidamente anonimizados de los participantes del estudio fueron consignados en un instrumento digital diseñado (Ver apéndice C), asignando un código consecutivo a cada participante y teniendo en cuenta la definición operativa de cada variable. La información se tomó de las historias clínicas con fecha de la toma de muestra (entre las 48 y 72 horas de ingreso al servicio de UCI).

Por otra parte, las variables microbiológicas relacionadas con la colonización por Candida spp. y la identificación de los aislamientos fueron registradas en otro formato digital en línea (Ver apéndice D), consignando en código consecutivo a cada participante.

3.3.6 Caracterización de los participantes del estudio

Se caracterizaron en términos sociodemográficos y clínicos los pacientes adultos que ingresaron al servicio de UCI, previo cumplimiento de los criterios de selección para participar en

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el estudio y teniendo en cuenta las variables definidas (Apéndice B). Los datos de los registros clínicos debidamente anonimizados de los participantes que se analizaron fueron proporcionados por el Hospital Universitario de Santander a la investigadora principal del macroproyecto al cual se encuentra anidado el presente trabajo de maestría. Los registros clínicos analizados corresponden a la última actualización de la historia clínica de la fecha de toma de muestra y fueron proporcionados en formato PDF. Se realizó extracción manual de las variables, registrando la información de cada una en el instrumento de recolección diseñado (Apéndice C) y se realizó verificación por tres personas para identificar errores de digitación. Posteriormente, se realizó la codificación de las variables y, una vez validada, se exportó al paquete estadístico STATA versión 14.0 para los respectivos análisis.

3.3.7 Procesamiento de muestras clínicas

Para la determinación de la colonización por Candida en la muestra de estudio, se procesaron muestras de vigilancia tales como orina por sonda o por micción espontánea, hisopado de piel en zona de axila y zona inguinal, frotis faríngeo para los pacientes no intubados y aspirado traqueal para los pacientes intubados. Las muestras fueron sembradas en agar Sabouraud al 2% (SDA – Merck) con adición de cloranfenicol (50 mg/L) (SDAC 2%) preparado según las especificaciones del fabricante (Apéndice E) (Merck Millipore, n.d.). Se realizó siembra por agotamiento en estría (Figura 1) para las muestras de frotis faríngeo, aspirado traqueal e hisopado de piel en zona de axila e ingle y, siembra por rejilla de 10 µL de muestra de orina (Figura 1). Se incubaron los cultivos a 37ºC por 5 días, revisando diariamente el crecimiento.

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Figura 1 Técnicas de siembra empleadas para el procesamiento de muestras clínicas

Las muestras fueron recolectadas bajo el desarrollo del macroproyecto siguiendo los protocolos de bioseguridad institucionales después de las 48 a 72 horas de ingreso al servicio de UCI por el personal del HUS a los participantes que firmaron el consentimiento informado. 3.3.8 Determinación de la colonización por Candida spp.

La determinación de la colonización se realizó en las muestras de vigilancia descritas anteriormente tomadas en las 48 a 72 horas de ingreso al servicio de UCI, con el fin de estimar la frecuencia y el tipo de colonización (monofocal o multifocal). Se definió la colonización por Candida spp. como la presencia de la levadura en muestras control de vigilancia o muestras no estériles (orina, aspirados traqueales, hisopado de piel, faringe). Se realizó lectura diaria de los cultivos primarios en SDAC 2% y cualquier crecimiento compatible con levaduras sugestivas de Candida spp. fue considerado como resultado positivo de colonización. Los cultivos negativos se incubaron hasta el quinto día antes de descartarlos. Una vez se obtuvo crecimiento de levaduras en el medio primario SDAC al 2%, se evaluó la presencia de colonización mixta utilizando el medio cromogénico CHROMagar™ Candida,

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preparado según las especificaciones del fabricante (Apéndice F) (CHROMagar, n.d.) para distinguir el crecimiento de diferentes especies mediante dos técnicas: Para los cultivos primarios con menos de 10 UFC, se realizó pase directo de cada colonia inoculando por estría directamente en el medio, numerando cada colonia para diferenciarlas entre ellas.

Para los cultivos primarios con más de 10 UFC, se utilizó la técnica de réplica en placa utilizando el sello replicador (Figura 2). Se realizó a partir de la placa primaria de SDAC 2% en CHROMagar ™ Candida utilizando cuadrados de tela de terciopelo estéril fijada con el anillo de aluminio al sello, se presionó suavemente la placa primaria de SDAC sobre la tela estéril (Figura 3), se retiró la placa original y se colocó en contacto la placa de CHROMagar ™ Candida con la tela que contiene la réplica del cultivo. Se incubó por 37°C a 24-48 horas antes de la lectura. Figura 2 Sello replicador, placa primaria de SDAC con crecimiento (izquierda) y CHROMagar ™ Candida (derecha).

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Figura 3 Impronta del cultivo primario utilizando sello replicador

La colonización mixta se definió como el crecimiento presuntivo de más de una especie diferente de Candida spp. en la muestra, teniendo en cuenta la coloración diferencial de las colonias en el medio cromogénico.

Las colonias de diferente color que se obtuvieron en el CHROMagar ™ Candida, fueron numeradas y posteriormente aisladas en SDAC 2% por estría a partir de una colonia para obtener cultivo axénico y proceder con la identificación y criopreservación. Se incubaron a 30°C por 48 horas para el montaje de RapID y extracción de proteínas con etanol absoluto, ácido fórmico al 70% y acetonitrilo para la identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF. Los aislamientos de levaduras fueron codificados con el código del paciente, seguido del tipo de muestra, siendo 1 orina, 2 axila, 3 ingle, 4 faringe y 5 aspirado traqueal y finalizando con el número de aislamiento (-1,-2,-3 etc.)

Por otra parte, se estimó el índice de colonización según Pittet (Pittet et al., 1994) y el Candida Score (León et al., 2006) en los pacientes del estudio con estancia de 7 días en el servicio

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de UCI a quiénes se les realizó la toma de muestras de seguimiento de los mismos sitios anatómicos de la toma inicial.

3.3.9 Criopreservación de los aislamientos

Para estudios posteriores, se realizó criopreservación por duplicado de cada aislamiento de levadura utilizando crioviales de 2 mL tomando inóculo considerable de la levadura en cultivo axénico y suspendiéndolo en 500 uL de caldo Sabouraud y 500 uL de glicerol al 30%. Se congelaron a -80ºC en cajas de criopreservación.

Adicionalmente, los aislamientos se conservaron en refrigeración de 2-8ºC en un eppendorf de 1.5 mL tomando inóculo considerable de la levadura en cultivo axénico y suspendiéndolo en 500 uL de agua destilada estéril.

3.3.10 Identificación de los aislamientos de Candida spp.

3.3.10.1 Identificación por bioquímica y pruebas complementarias.

3.3.10.1.1 Identificación por RapID Yeast Plus. A partir del cultivo puro de la levadura

en SDAC al 2%, con 48 horas de incubación a 30°C se realizó el montaje del panel RapID Yeast Plus (Remel) para la identificación bioquímica de los aislamientos, siguiendo el procedimiento establecido por el fabricante (Apéndice G) (ThermoFisher Scientific, 2004). Posterior a las cuatro horas de incubación de los paneles inoculados, se procedió a realizar la lectura de la prueba, obteniendo un microcódigo ingresado a la base de datos ERIC (http://www.remel.com/eric/) para obtener la identificación del aislamiento. Se aceptó un porcentaje de probabilidad de identificación de los aislamientos igual o superior al 95%. Se realizó control de calidad de cada lote nuevo realizando montaje de la cepa de referencia C. albicans ATCC 14053.

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3.3.10.1.2 Crecimiento en CHROMagar Candida. Se realizó registro en el formato de

resultados (Apéndice D) del color obtenido de las colonias en CHROMagarTM Candida (Apéndice F) con 24 a 48 horas de crecimiento a 37ºC durante el proceso de determinación de colonización mixta descrito en el apartado 3.3.8. Se realizó control de calidad de esterilidad y crecimiento con la preparación de cada lote de medio de cultivo. El control de calidad de crecimiento fue realizado utilizado las cepas de referencia de C. albicans ATCC 14053, I. orientalis ATCC 6258, C. tropicalis ATCC 66029 y C. glabrata ATCC 15126.

3.3.10.1.3 Agar tabaco. Para diferenciar presuntivamente entre las especies del complejo

C. albicans: C. albicans y C. dubliniensis, los aislamientos identificados como C. dubliniensis por la técnica de MALDI-TOF con puntaje superior a 1,70, se realizó siembra por estría y spot en agar tabaco, preparado según Kumar y colaboradores (Girish Kumar & Menon, 2005) (Apéndice H). Se incubó a 30ºC por 72h a 5 días. Se revisó el color y la apariencia de las colonias (blanco o amarillo, cremosas o con bordes festoneados) y se realizó montaje entre lámina y laminilla con azul de lactofenol, tomando inóculo raspando un poco del medio de cultivo y observando en objetivo de 40x para evidenciar la formación de clamidoconidias. Se determinó como resultado positivo la presencia de clamidoconidias con crecimiento de colonias de color amarillo, bordes festoneados y, resultado negativo la ausencia de clamidoconidias y crecimiento de colonias de color blanco y cremosas (Apéndice H). Se realizó control de la productividad del medio utilizando las cepas de referencia de C. albicans ATCC 14053 y C. dubliniensis NCPF 3949 (apéndice H: Figura 9 y 10).

3.3.10.2 Identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF. La identificación

por espectrometría de masas MALDI-TOF se realizó a partir de aislamientos puros de levaduras en SDA al 2% con cloranfenicol, incubados a 24-48 horas a 30ºC. Para la identificación, se realizó

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extracción total de proteínas según el protocolo estipulado en el manual MBT Compass (Bruker) (Apéndice I) (Bruker Daltonik, 2019). Para la medición, se depositó 1 µL del extracto proteico, se dejó secar y se añadió 1 µL de la matriz HCCA (Ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico- Bruker Daltonic) en concentración 10 mg/mL, en una placa reutilizable de acero pulido de 96 pocillos (MSP 96 target polished Steel BC – Bruker Daltonik) acoplada a un adaptador para medir en el equipo ultrafleXtreme (Bruker Daltonik). Se realizó la medición por duplicado para cada aislamiento y el montaje del calibrador BTS (Bacterial Test Standard – Bruker Daltonik) (Apéndice J) como control de calidad y validación de la corrida. Se realizó captura manual de espectros utilizando el software flexControl – ultraflex TOF/TOF empleando el método MBT-lev, capturando los espectros en modo linear positivo, en un rango de masas que comprendía de 2.320 a 20.000 Da y realizando sumatoria de espectros e identificación por el método automático utilizando el software Maldi Biotyper® Compass RUO V. 4.1.100.

Para la identificación de los espectros capturados manualmente, se ingresaron al software Maldi Biotyper® Compass Explorer versión 4.1.100 para ser comparados con la librería de referencia BDAL (Bruker Daltonik), que contiene 11.897 MSPs (Perfiles de espectros de masas). Los puntajes de identificación iguales o superiores a 2.0 indicaron identificación a nivel de especie, puntajes entre 1.70 a 1.99 indicaron identificación a nivel de género y puntajes inferiores a 1.70 no se identificaron.

Aquellos aislamientos que no fueron posible identificar por MALDI-TOF o que se identificaron a nivel de género (puntajes de 1.70 a 1.99) se les realizó identificación molecular por secuenciación de región ITS.

Por otra parte, se realizó análisis filogenético de los espectros de masas de los aislamientos de Candida spp. incluyendo aquellos obtenidos manualmente con una puntuación de identificación

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mayor a 2,0, realizando el análisis de componentes principales (PCA) para la construcción de un dendrograma en el módulo offline MALDI Biotyper® Compass Explorer V.4.1.100. utilizando el método estándar del software para su creación.

3.3.10.3 Identificación molecular por secuenciación de región ITS. Se realizó

identificación molecular por secuenciación de región ITS a los aislamientos en los que se obtuvo discrepancia en la identificación entre los métodos de identificación RapID Yeast Plus (Remel) y MALDI-TOF, a aquellos aislamientos que no fueron posible identificar por RapID Yeast Plus o por MALDI-TOF o aquellos que presentaron un puntaje de identificación por MALDI-TOF entre 1.70 y 1.99.

3.3.10.3.1 Extracción ADN de levaduras. Para realizar la extracción de ADN, las

levaduras candidatas, procedentes de la criopreservación en agua estéril o glicerol, fueron inoculadas en SDAC 2% e incubadas durante 48 horas a 28ºC. Posteriormente, se inoculó una colonia de la levadura en 600 µL de caldo YPD en eppendorf estériles de 1.5 mL y se colocó en agitación a 28ºC a 180 rpm por toda la noche. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo líquido a 13.000 rpm por 2 minutos y se descartó el sobrenadante. Se añadieron 200 µL de agua estéril tipo 1 y se procedió a la extracción de ADN utilizando el kit MagMaxTM Viral Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems - ThermoFisher Scientific) aplicando el protocolo descrito por el fabricante (Apéndice K) (AppliedBiosystems, 2020).

Se cuantificó por duplicado el ADN de los eluidos en el equipo espectrofotómetro Nanodrop One (Thermo Scientific) utilizando como blanco la solución de eluido sin ADN, se usaron 2 µL del eluido en la columna del equipo.

3.3.10.3.2 Amplificación de región ITS por técnica de PCR. Para la amplificación de la

región ITS, se utilizaron los primers ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) e ITS4 (5′-

p. 40

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) diseñados por Macrogen y las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en 40 µL de volumen total que contiene: Tabla 2 Composición de la reacción de PCR Reactivo (concentración) Concentración final Volumen en µL (1 muestra) Agua grado molecular

15.5

Buffer Taq (10X) (KCl) 1X

MgCL2 (25 mM)

2 mM

3.2

dNTPs (10 mM) 200µM

0.8

ITS1 (10 µM)

1 µM

ITS4 (10 µM)

1 µM

Taq Polimerasa (5 U/µL) (Taq DNA Polymerase recombinant – ThermoFisher)

0.0625 U/µL

0.5

gDNA (100 ng/µL)

20 ng

Volumen final

La PCR fue realizada en el termociclador MiniAmpTM Plus (Applied Biosystems™ - ThermoFisher Scientific) utilizando las siguientes condiciones:

p. 41

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Tabla 3 Condiciones de la PCR Temperatura Tiempo # Ciclos 94ºC

4 minutos

94ºC

30 segundos

58ºC

30 segundos

72ºC

1 minuto

72ºC

4 minutos

4ºC ∞

Para comprobar la obtención de los productos de amplificación, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 0,8% con buffer TAE 1X y adición de HydraGreenTM (HydraGene Co.), usando 1 µL de buffer de carga y 5 µL del producto de PCR, junto con 5 µL de marcador de peso molecular (FastGene DNA Marker Plus – NIPPON Genetics Europe) a 90V por 50 minutos.

3.3.10.3.3 Secuenciación de región ITS. Los productos de PCR obtenidos fueron ajustados

a un rango de concentración de 50 a 100 ng/µL y se enviaron a purificar y secuenciar mediante electroforesis capilar por ambos sentidos (ITS1 forward e ITS4 reverse). Los resultados de secuenciación se recibieron en formato. ab1.

3.3.10.3.4 Análisis de secuencias. Las secuencias Sanger en formato. ab1 fueron editadas

en el programa CodonCode Aligner y posteriormente, en el programa Bioedit se generaron las secuencias consenso a partir de las secuencias forward y reverse. La secuencia consenso se copió en formato FASTA y se realizó identificación comparando las secuencias con la base de datos de referencia de GenBank a través de la herramienta BLAST utilizando la base de datos standard (core_nt) y la base de datos ITS (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), base de datos MycoBank

p. 42

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

(https://www.mycobank.org/Pairwise_alignment) y del Instituto Westerdijk de Biodiversidad fúngica CBS-KNAW (https://wi.knaw.nl/Pairwise_alignment). Se tuvo en cuenta el porcentaje de identidad con límite superior a 98,41% para discriminar entre especies de levadura y de 96,3% para discriminar entre género de levadura ((Vu et al., 2016).

3.3.11 Análisis estadístico

Se utilizó el software STATA versión 14,0 para el procesamiento y análisis univariado, bivariado y multivariado de los datos.

Para el análisis univariado y descriptivo, se caracterizaron a los participantes del estudio y la distribución de los aislamientos de Candida spp. y se determinó la prevalencia puntual de colonización por Candida spp. después de las 48-72 horas de ingreso al servicio de UCI. Para las variables cualitativas categóricas se presentaron con frecuencia absoluta y frecuencia relativa (%) y, para las variables cuantitativas se realizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad de los datos. De acuerdo con esto, se presentaron en términos de media como medida de tendencia central y desviación estándar como medida de dispersión para datos normalizados o, con mediana y rangos intercuartílicos para datos no normalizados.

Para el análisis bivariado, para la determinación de factores asociados se evaluó si las variables independientes sociodemográficas como el sexo, la edad, y el régimen de salud, y las variables clínicas independientes como la escala APACHE, la cirugía reciente, el consumo de antibióticos, la terapia inmunosupresora, el tipo de nutrición, el uso de dispositivos médicos invasivos, el padecimiento de morbilidades como sepsis, infección bacteriana localizada, diabetes, entre otras, se encontraban asociadas con la variable de salida, colonización por Candida spp. Para evaluar la asociación entre la variable dependiente (colonización) y las variables independientes cualitativas se aplicaron la prueba Chi-cuadrado (x2) o test exacto de Fisher y, para las variables

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

independientes cuantitativas se generaron categorías. Adicionalmente, se utilizó la razón de prevalencias con su respectivo intervalo de confianza del 95% y se consideró un valor p ≤ 0,05 como estadísticamente significativo.

Para el análisis multivariado, se realizó un modelo de regresión de Poisson con varianza robusta considerando la prevalencia del evento en estudio y la naturaleza de los datos, donde se incluyeron las variables cuyo valor p en el modelo bivariado fuese menor o igual a 0,2. La evaluación del modelo de regresión se realizó con la prueba de bondad de ajuste presentando el valor p. Se incluyó en el modelo las variables con un valor p ≤ 0,05 y el valor de razón de prevalencia (RP) con su respectivo intervalo de confianza del 95%.

3.4 Aspectos éticos

El presente trabajo de grado cuenta con aprobación del Comité de Ética en Investigación de la Universidad Industrial de Santander (CEINCI) como consta en el acta no. 7 del día 12 de mayo de 2023 (Apéndice L).

El presente proyecto de investigación se enmarcó en la Resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud, por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud. Según esta resolución, este proyecto es considerado de riesgo mínimo por ser un estudio observacional, analítico de corte transversal, vinculado a un macroproyecto del cuál se proporcionarán las muestras y los datos clínicos de los participantes debidamente anonimizados entregados por el Hospital Universitario de Santander para el desarrollo del presente trabajo de investigación. Para lograr el cumplimiento de los objetivos del proyecto no se tuvo contacto directo con los participantes ni se llevaron a cabo ensayos clínicos bajo el desarrollo del presente trabajo de investigación dado que el manejo de los participantes

p. 44

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estuvo a cargo del médico tratante de la institución. Sin embargo, fue necesario la inclusión de muestras clínicas tomadas de los participantes del estudio que corresponde a una fuente primaria, las cuales fueron manipuladas para evaluar la colonización por Candida spp. y, una fuente secundaria referente a la información de los datos clínicos de los participantes para realizar un análisis descriptivo e identificar factores asociados a la colonización. Las muestras clínicas y los datos clínicos debidamente anonimizados de los participantes correspondieron a la recolección realizada en el macroproyecto “Desarrollo de una estrategia de medicina personalizada para el manejo preventivo, diagnóstico y tratamiento de candidiasis en Unidades de Cuidados Intensivos de adultos en el área metropolitana de Bucaramanga” código 86269 de la convocatoria 897-2021 para proyectos de CTEI en salud, medicina personalizada e investigación traslacional, del cual se anida el presente trabajo de investigación para el desarrollo del objetivo específico dos y tres del proyecto macro; y que cuenta con la aprobación del comité de ética de la Universidad Industrial de Santander CEINCI, del Hospital Universitario de Santander y de la Universidad Santo Tomas para el desarrollo de sus actividades. En el presente estudio se garantizaron los principios básicos de bioética a los participantes: beneficencia, no-maleficencia y justicia (National Commission for the Protection of Human Subjects of Biomedical and Behavioral Research, 1979). Tratamiento de datos personales y análisis de datos clínicos: Se cumplió con lo estipulado en la Ley 23 de 1981, la Resolución 13437 de 1991, la Resolución 1995 de 1999 y, la Ley 1751 de 2015, así como la Ley 1581 de 2012 donde se dictan disposiciones generales para el tratamiento de datos personales, el Decreto 1377 de 2013 y la Resolución de Rectoría 1227 de la Universidad industrial de Santander, que tienen por objeto el tratamiento y la protección de datos personales en Colombia. La autorización para el uso y tratamiento de los datos clínicos anonimizados de los participantes fue solicitada al Hospital Universitario de Santander por la investigadora principal

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

del macroproyecto, teniendo en cuenta lo descrito en la resolución 8430, artículo 15, “La seguridad que no se identificará al sujeto y que se mantendrá la confidencialidad de la información relacionada con su privacidad”. La revisión de los datos clínicos de los participantes se realizó respetando el anonimato donde se generó un número de identificación único para su identificación bajo el desarrollo del trabajo de investigación.

De acuerdo con la Resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud, título 4, referente a la bioseguridad de las investigaciones y a la manipulación de microorganismos patógenos o material biológico que pueda contenerlos se contempla:

Instalaciones: El procesamiento de las muestras para el trabajo de investigación se desarrolló en el laboratorio 404 ubicado en el Parque Tecnológico Guatiguará de la Universidad Industrial de Santander, el cual cuenta con las normas técnicas para el trabajo en un laboratorio de Microbiología y con la capacidad para el manejo de microorganismos como levaduras, del grupo de riesgo II en cabina de seguridad biológica clase II.

Manejo y contención de residuos: Se contempló durante la ejecución del proyecto la generación de residuos químicos y biológicos, los cuales fueron procesados según los procedimientos indicados en el Programa de Gestión Integral de Residuos (PGIR) del Sistema de Gestión Ambiental (SGA) de la UIS disponible en: https://uis.edu.co/uis-sistema-gestionambiental-es/ Normas y pólizas de riesgo. Se contó con servicio médico y la ARL vigente durante el desarrollo del proyecto y se cumplieron con las normas de riesgos profesionales y con la normatividad nacional e internacional.

p. 46

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4. Resultados

4.1 Descripción sociodemográfica y clínica de los participantes del estudio

Un total de 114 pacientes fueron incluidos en el estudio, los cuales eran provenientes de los tres servicios de UCI del Hospital Universitario de Santander entre el 31 de agosto del 2023 y el 10 de febrero del 2024. De éstos, el 64,91% (n=74) eran hombres, la mediana de edad fue de 59 años (rango intercuartílico 43-70 años). Respecto al régimen de salud, el 73,68% (n=84) de los participantes se encontraban vinculados al régimen subsidiado y el 14,91% (n=17) se encontraban vinculados a otros regímenes de salud, donde se incluyen extranjeros que no están afiliados al sistema, personas que reciben atención bajo modalidades específicas como urgencias o transitorias o beneficiarios de planes adicionales de salud (como los regímenes especiales o de excepción). El detalle de las características sociodemográficas se presenta en la tabla 4. Tabla 4 Características sociodemográficas de los participantes del estudio Variable n (%) Sexo

Masculino

74 (64,91)

Femenino

40 (35,09)

Edad

19 a 59 años

58 (50,88)

60 o más años

56 (49,12)

Mediana 59 años; RIC 43-70 años Régimen de salud Subsidiado

84 (73,68)

Contributivo

9 (7,89)

Vinculado/ninguno

4 (3,51)

Otro

17 (14,91)

p. 47

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

En cuanto a las características clínicas, los datos aquí presentados fueron tomados entre las 48 a 72 horas de ingreso a la unidad. Así, el choque (19,30%; n=22), el politraumatismo (15,79%; n=18) y la insuficiencia respiratoria (12,28%; n=14) fueron los principales motivos de ingreso a la UCI, representando cerca del 50% de los participantes en el estudio. De los 114 participantes, 58 de ellos registraban en su historia clínica el puntaje APACHE, siendo el puntaje más frecuente de 0-4 que predice una mortalidad del 4% (n=17;29,31%) (Tabla 5).

En lo que respecta al tiempo de estancia en la UCI, la mediana fue de cero días (RIC= 0-0 días), siendo el tiempo mínimo de cero días (78,95%; n= 90) y el máximo 39 días (1,75%; n=2). Clínicamente, el 64,91% (n=74) de los participantes requirieron soporte ventilatorio, el 98,25% (n=112) tenía algún tipo de catéter y el 69,30% (n=79) de los pacientes estaban bajo tratamiento antibiótico, siendo la Piperacilina Tazobactam el antibiótico más frecuente administrado en ellos (n=33; 41,77%). El 32,46% (n=37) de los pacientes presentaban cirugía reciente, siendo la laparotomía la cirugía más practicada (n=8; 21,62%). Con relación a la presencia de morbilidades, el 41,23% (n=47) de los participantes presentaba hipertensión arterial, el 25,44% (n=29) de los participantes tenían infección bacteriana localizada y el 21,93% (n=25) tenían diagnóstico de sepsis (Tabla 5 y Tabla 6).

Tabla 5 Primera parte, características clínicas de los participantes del estudio Variable n (%) Motivo de ingreso a UCI Choque

22 (19,30)

Politraumatismo

18 (15,79)

Insuficiencia respiratoria

14 (12,28)

Sepsis

7 (6,14)

Posoperatorio

6 (5,26)

Hemorragia

5 (4,39)

p. 48

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Falla cardiaca

5 (4,39)

Crisis hipertensiva

4 (3,51)

ACV

4 (3,51)

Infección localizada

3 (2,63)

Falla renal

3 (2,63)

Otras

23 (20,18)

Tiempo de estancia previo ingreso a UCI

0 a 1 día

102 (89,47)

2 o más días

12 (10,53)

Mediana 0 días; RIC 0

APACHE

0-4 Mortalidad 4%

17 (29,31)

5-9 Mortalidad 8%

9 (15,52)

10-14 Mortalidad 15%

9 (15,52)

15-19 Mortalidad 25%

7 (12,07)

20-24 Mortalidad 40%

3 (5,17)

25-29 Mortalidad 55%

3 (5,17)

30-34 Mortalidad 75%

4 (6,90)

Más 34 Mortalidad 85%

6 (10,34)

Total pacientes con APACHE

58 (100)

Cirugía reciente

37 (32,46%)

Tipo de cirugía

Laparotomía

8 (21,62)

Trombectomía

6 (16,22)

Toracotomía

5 (13,51)

Angioplastia

2 (5,41)

Craneotomía

2 (5,41)

Desbridamiento

2 (5,41)

Drenaje

2 (5,41)

Otras cirugías

10 (27,03)

Tabla 6 Segunda parte, características clínicas de los participantes del estudio Variable n (%) Medicamentos Consumo de antibióticos

79 (69,30)

Piperacilina tazobactam

33 (41,77)

Meropenem

14 (17,72)

Ampicilina sulbactam

13 (16,46)

Ceftriaxona

11 (13,92)

p. 49

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Otros

8 (10,12)

Cantidad de antibióticos consumidos

1 antibiótico

41 (51,90)

2 antibiótico

24 (30,37)

3 antibiótico

11 (13,92)

4 antibiótico

1 (1,26)

5 antibiótico

1 (1,26)

6 antibiótico

1 (1,26)

Consumo de antifúngico posingreso

6 (5,26)

Uso Propofol

4 (3,51)

Terapia inmunosupresora

3 (2,63)

Consumo de corticoides

23 (20,18)

Beclometasona

7 (6,14)

Prednisolona

6 (5,26)

Metilprednisolona

5 (4,39)

Dexametasona

5 (4,39)

Hidrocortisona

3 (2,65)

Prednisona

3 (2,63)

Tipo de nutrición Nutrición parenteral

63 (55,26)

Nutrición enteral por sonda

33 (28,95)

Nutrición enteral oral

9 (7,89)

Dispositivos médicos invasivos Uso de catéter

112 (98,25)

CVC

75 (65,79)

CVP

37 (32,46)

Mahurkar

3 (2,63)

Otro

1 (0,88)

Uso de sonda vesical

99 (86,84)

Soporte ventilatorio

74 (64,91)

Intubación traqueal

60 (52,63)

Traqueostomía

5 (4,39)

Hemodiálisis

7 (6,14)

Diálisis peritoneal

2 (1,75)

Morbilidades Hipertensión arterial

47 (41,23)

Infección bacteriana localizada

29 (25,44)

Sepsis

25 (21,93)

Diabetes

24 (21,05)

Falla renal

18 (15,79)

Obesidad

9 (7,89)

p. 50

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

4.2 Determinación de la colonización por Candida spp. en pacientes en Unidad de Cuidados

intensivos.

Todos los 114 pacientes de UCI fueron considerados para el análisis de la colonización; de estos, el 73,68% (n=84) fueron positivos para colonización por Candida a las 48 o 72 horas después del ingreso al servicio de UCI. De los 84 pacientes colonizados, 51,19% (n=43) presentaron colonización monofocal, es decir, las levaduras crecieron en un único sitio anatómico de los cuatro evaluados; el restante 48,81% (n=41) presentaron colonización multifocal, con mayor frecuencia en dos sitios anatómicos, equivalente al 32,14% (n=27) (Tabla 7). Adicionalmente, el medio CHROMagarTM Candida permitió determinar un 36,90% (n=31) de colonización mixta en los pacientes colonizados, es decir, se detectaron dos especies diferentes en el 70,96% de los pacientes con colonización mixta (n=22) en una misma muestra (Figura 4) y tres especies diferentes en el 29,03% de los pacientes con colonización mixta en una misma muestra (n=9) (Figura 5), en tanto que el 63,09% de los pacientes presentaron colonización por una única especie de Candida (Figura 6).

Cáncer

8 (7,02)

Cirrosis hepática

6 (5,26)

Desnutrición

5 (4,39)

p. 51

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Tabla 7 Colonización y tipo de colonización por Candida spp. en los participantes del estudio Variable n (%) Colonización

84 (73,68)

No colonización

30 (26,32)

Tipo de colonización

Monofocal

43 (51,19)

Multifocal

41 (48,81)

# de sitios colonizados

43 (51,19)

27 (32,14)

13 (15,47)

1 (1,19)

Colonización mixta

31 (36,90)

Colonización única

53 (63,09)

Figura 4 Colonización mixta por dos especies diferentes de Candida spp. usando el sello replicador

Nota. Lado izquierdo SDAC al 2%, lado derecho CHROMagarTM Candida

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Figura 5 Colonización mixta por tres especies diferentes de Candida spp. usando el sello replicador

Nota. Lado izquierdo SDAC al 2%, lado derecho CHROMagarTM Candida Figura 6 Colonización por única especie de Candida spp. usando el sello replicador

Nota. Lado izquierdo SDAC al 2%, lado derecho CHROMagarTM Candida Respecto a la colonización por sitio anatómico (Tabla 8), en total se estudiaron 433 muestras clínicas en la población de estudio equivalentes a 99 muestras de orina (22,86%), 114 hisopados de axila (26,32%), 113 hisopados de ingle (26,09%), 51 frotis faríngeos (11,77%) y 56 aspirados traqueales (12,93%). Del total de muestras estudiadas para colonización, se aislaron especies de Candida en el 32,56% de las muestras (n=141). De los sitios anatómicos estudiados, la zona inguinal y axilar fueron los más colonizados con un 34,04% (n=48) y 20,56% (n=29) de

p. 53

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

colonización respectivamente, en tanto que la muestra de orina representó el sitio anatómico con menor colonización 9,21% (n=13).

Tabla 8 Colonización por Candida spp. según el sitio anatómico.

Sitio anatómico Hombres Mujeres n (%) Respecto al total de la muestra (% colonización) Ingle

31 (34,83)

17 (32,69)

48 (34,04)

42,47% (48/113) Axila

17 (19,10)

12 (23,07)

29 (20,56)

25,43% (29/114) Tráquea

22 (24,71)

5 (9,61)

27 (19,14)

48,21% (27/56) Faringe

12 (13,48)

12 (23,07)

24 (17,02)

47,05% (24/51) Orina

7 (7,86)

6 (11,53)

13 (9,21)

13,13% (13/99) Total

89 (63,12)

52 (36,87)

141 (100)

32,56% (141/433)

En relación con el índice de colonización (IC) (Tabla 9), este fue estimado en los pacientes con siete días de estancia en UCI, teniendo en cuenta su interpretación clínica (Tabla 9). Así, de los 114 pacientes estudiados al ingreso al servicio a 60 de ellos que continuaban en la UCI se les realizó seguimiento de colonización a los siete días de ingreso, de los cuales el 78,33% (n=47) se encontraban colonizados por Candida spp. Sin embargo, la incidencia acumulada de colonización por Candida spp. a los siete días de estancia en UCI fue del 42,85% (n=6/14), es decir, se detectaron seis casos nuevos de colonización durante la estancia en UCI respecto a catorce pacientes en riesgo al inicio del estudio y que se les realizó toma de muestra a los sietes días de estancia.

Las razones por las cuáles se realizó muestreo solamente a 60 pacientes a los siete días de estancia y no a la totalidad de los participantes se debe a la salida de los pacientes de la UCI, fallecimiento antes de los siete días o, por disentimiento para realizar la segunda toma de muestra.

p. 54

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Teniendo en cuenta la significancia clínica del índice de colonización (IC) según Pittet, los pacientes fueron divididos en dos grupos: aquellos con índice de colonización menor a 0,5 y aquellos con índice de colonización mayor o igual a 0,5. Como se observa en la Tabla 9, el 61,70% de los pacientes colonizados a los siete días de estancia en UCI presentan un índice de colonización igual o superior a 0,5, haciendo referencia a una colonización por Candida spp. en la mitad o más de las cuatro muestras clínicas tomadas, en tanto que el 38,29% de los pacientes presentan un índice de colonización inferior a 0,5, indicando que solamente se encontraban colonizados en un sitio anatómico de los cuatro muestreados (Pittet et al., 1994). Por otra parte, respecto a los pacientes con colonización incidente (n=6), solo uno de ellos presentó colonización multifocal en axila y tráquea.

Tabla 9 Estimación del índice de colonización en pacientes con siete días de estancia en UCI Índice de colonización (IC) n (%) IC ≥ 0,5

29 (61,70)

IC ˂ 0,5

18 (38,29)

Total

47 (100)

4.3 Distribución de especies de Candida colonizante

Se determinó la distribución de especies de Candida en general y por sitio anatómico en la población de estudio (Tabla 10). De 141 muestras positivas para colonización, se obtuvieron 183 aislamientos de Candida spp., equivalentes al 93,37% del total de aislamientos de levaduras (Tabla 11), que fueron identificados por RapID Yeast Plus y espectrometría de masas MALDI-TOF. Del total de aislamientos recuperados de levaduras, en siete casos no fue posible la identificación utilizando estos métodos, de manera que se realizó el envío de los amplificados para realizar

p. 55

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

secuenciación de región ITS para su identificación definitiva, así mismo, respecto a la distribución general de especies, C. albicans fue la especie más prevalente en la población de estudio, representando el 43,7% de los aislamientos (n=80). Por otra parte, se obtuvo un 56,3% de aislamientos de especies de Candida no albicans, siendo C. parapsilosis la especie más frecuente de este grupo representando el 17,5% (n=32) de los aislamientos, seguido de C. tropicalis con el 16,9% (n=31) y N. glabratus con el 11,5% (n=21) del total de aislamientos. Es de destacar la presencia de especies crípticas de Candida en los aislamientos recuperados, identificados por espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación de región ITS, tales como C. orthopsilosis y C. metapsilosis pertenecientes al complejo C.parapsilosis que representaron el 3,8% del total de aislamientos y C. dubliniensis perteneciente al complejo C. albicans que equivale al 3,3% del total de aislamientos, en estos últimos se complementó la identificación con la prueba de agar tabaco, siendo los seis aislamientos positivos para la prueba, con presencia de colonias amarillas con bordes festoneados y producción de clamidoconidias (Apéndice H: Figura 9 y 10).

Tabla 10 Distribución de Candida spp. en general y por sitio anatómico

Orina Axila Ingle Faringe Tráquea Total (n) Total (%) C.albicans

43,7

C.parapsilosis

17,5

C.tropicalis

16,9

N.glabratus

11,5

P.kudriavzevii

2,2

C.orthopsilosis

2,2

C. metapsilosis

1,6

C.dubliniensis

3,3

C.auris

0,5

C. duobushaemulonii

0,5

p. 56

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Total (n)

183

100,0

Total (%)

9,29

18,58 36,07

17,49

18,58

100,00

Respecto a la cantidad de levaduras encontradas por sitio anatómico (Tabla 10), se evidenció que en la zona inguinal se recuperó el mayor número de aislamientos de Candida, equivalente al 36,07% (n=66), y que la orina fue el sitio anatómico donde se recuperó la menor cantidad de levaduras, equivalente al 9,29% (n=17) de los aislamientos. Así mismo, en la distribución de especies por sitio anatómico, se destacó el predominio de C. parapsilosis en axila correspondiendo al 44,11% (n=15) de los aislamientos en este tipo de muestra y de C. tropicalis en muestra de orina, representando el 41,17% (n=7) de las levaduras recuperadas en esta muestra. Además, en la zona inguinal, faringe y tráquea se observó predominio de C. albicans que representó al 43,93%, 50% y 52,94% de los aislamientos en estos sitios anatómicos estudiados, respectivamente (Tabla 10).

Por otra parte, se aislaron e identificaron otras levaduras diferentes a Candida spp. que representaron el 6,63% (n=13) del total de aislamientos (n=196), tales como Diutina mesoruga, Lodderomyces elongisporus, Trichosporon asahii, Kazachstania telluris group, Kodamaea ohmeri y Saccharomyces spp. discriminados por sitio anatómico en la Tabla 11.

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Tabla 11 Distribución de levaduras general y por sitio anatómico

Orina Axila Ingle Faringe Tráquea Total (n) Total (%) Candida spp.

183

93,37

D. mesorugosa

1,53

L. elongisporus

1,02

T. asahii

2,04

K. telluris group

0,51

K. ohmeri

1,02

Saccharomyces spp.

0,51

Total otras levaduras

6,63

Total levaduras

196

100,00

Respecto al análisis filogenético, se construyó un dendrograma utilizando componentes principales (PCA) que incluyó 25 aislamientos de Candida spp. los cuáles presentaban un puntaje de identificación de MALDI TOF mayor o igual a 2,0. Los aislamientos se distribuyeron en tres clados agrupados según la especie, como se evidencia en la Figura 7. El grupo verde corresponde a aislamientos de C. albicans formando un clúster relativamente homogéneo con distancias cortas entre ellos, indicando una alta similitud entre los espectros de estos aislamientos. El grupo rojo corresponde a dos aislamientos de N. glabratus, un aislamiento de P. kudriavzevii y cinco aislamientos de C. parapsilosis y es el grupo con mayor variabilidad interna entre los aislamientos y, el grupo azul corresponde a aislamientos de C. tropicalis, formando un clúster separado con variabilidad entre los aislamientos.

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Figura 7 Dendrograma construido en MBT Compass Explorer utilizando componentes principales (PCA).

Respecto al uso de tres métodos de identificación para la determinación de especies de Candida, en la tabla 12 se presenta los porcentajes de concordancia entre ellos. A la totalidad de los aislamientos de levaduras (n=196) se les realizó identificación por RapID Yeast Plus y MALDI-TOF, sin embargo, se obtuvo un 82,1% de concordancia de identificación entre estos dos métodos, presentándose discrepancia en 35 aislamientos principalmente por la dificultad en la identificación de especies crípticas de Candida o especies emergentes por parte del método bioquímico. Por otra parte, solamente se identificaron 65 aislamientos por secuenciación de región ITS dado que este método únicamente fue utilizado en aquellos aislamientos que no se identificaron por bioquímica o MALDI-TOF, con discrepancias o puntaje menor a 2.0 en MALDI- TOF. Se obtuvo un 84,61% de concordancia entre MALDI-TOF y la secuenciación de región ITS

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debido a aislamientos que no se identificaron por espectrometría de masas, aquellos correspondientes a D. mesorugosa y cuatro aislamientos de Candida. En relación con la concordancia entre RapID y la secuenciación de región ITS el porcentaje de concordancia fue del 58,46%, por discrepancias en la identificación de especies como K. ohmeri, D. mesorugosa, L. elongisporus y especies crípticas de Candida.

Tabla 12 Concordancia de aislamientos identificados por RapID, MALDI-TOF y secuenciación ITS

Concordancia entre RapID y MALDI-TOF Concordancia entre MALDI-TOF e ITS Concordancia entre RapID e ITS n (%) n (%) n (%) Aislamientos concordantes

161 (82,1)

55 (84,61)

38 (58,46)

Aislamientos procesados

196

4.4 Asociación de los factores sociodemográficos y clínicos con la colonización por Candida spp. en los participantes del estudio

4.4.1 Análisis bivariado

Se realizó un análisis bivariado para identificar los factores sociodemográficos y clínicos asociados a la colonización por Candida spp. en los participantes del estudio. Respecto a las variables sociodemográficas edad, sexo biológico y el régimen de seguridad social, no se encontró asociación estadísticamente significativa. Teniendo en cuenta que la variable régimen de seguridad social presentó un valor p=0,050, se analizó la medida de asociación razón de prevalencia (RP) para identificar si en alguna de las categorías de la variable se presentaba

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asociación; no obstante, los valores de RP, así como su intervalo de confianza del 95% (IC 95%) no evidenciaron la consistencia en la fuerza de asociación (Tabla 13). Tabla 13 Análisis bivariado de variables sociodemográficos entre pacientes no colonizados y colonizados. Variable No colonizados n=30 Colonizados n=84 RP(IC95%) Valor p n (%) n (%) Sexo

0,815

Femenino

10 (25)

30 (75)

Masculino

20 (27,03)

54(72,97)

0,97(0,77-1,22)

Edad (años) 19-59 años

19(32,76)

39(67,24)

0,112

60 y más

11(19,64)

45(80,36)

1,1(0,95-1,49)

Régimen de salud Subsidiado

18 (21,43)

66 (78,57)

0,050* Contributivo

4 (44,44)

5 (55,56)

0,70 (0,39-1,28)

Vinculado/Ninguno

3 (75)

1 (25)

0,31 (0,058-1,74)

Otro

5 (29,41)

12 (70,59)

0,89 (0,64-1,24)

Por otra parte, respecto a las variables clínicas, aquellas que mostraron una asociación estadísticamente significativa fueron la cirugía reciente, la presencia de sepsis y la infección bacteriana localizada (Tabla 14). La cirugía reciente se asoció significativamente con una menor probabilidad de colonización por Candida spp. (RP:0,69, IC 95% 0,51-0,93, p=0,004) mientras que la presencia de sepsis se asoció con una mayor probabilidad de colonización por Candida spp. (RP:1,34, IC 95% 1,11-1,61, p=0,020), al igual que tener infección bacteriana localizada (RP:1,31, IC 95% 1,08-1,58, p=0,028).

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Tabla 14 Análisis bivariado de variables clínicas entre pacientes no colonizados y colonizados Variable No colonizados n=30

Colonizados n=84 RP(IC95%) Valor p n (%) n (%) Tiempo de estancia previo ingreso a UCI

0 a 1 día

28 (27,45)

74 (72,55)

0,729

2 o más días

2 (16,67)

10 (83,33)

1,14 (0,86-1,51)

APACHE

Menor a 24

10 (23,81)

32 (76,19)

Mayor o igual a 24

4 (25)

12 (75)

0,98 (0,70-1,36)

Cirugía reciente

16 (43,24)

21 (56,76)

0,69 (0,51 - 0,93)

0,004* Medicamentos Consumo de antibióticos

17 (21,52)

62 (78,48)

1,24 (0,94 - 1,65)

0,081

Consumo de antifúngico pos-ingreso

0 (0)

6 (100)

0,338

Uso Propofol

1 (25)

3 (75)

1,01 (0,57 - 1,81)

Terapia inmunosupresora

2 (66,67)

1 (33,33)

0,44 (0,08-2,21)

0,169

Consumo corticoides

5 (21,74)

18 (78,26)

1,07 (0,84-1,38)

0,792

Tipo de nutrición Nutrición parenteral

14 (22,22)

49 (77,78)

1,13 (0,90- 1,42)

0,27

Nutrición enteral sonda

6 (18,18)

27 (81,82)

1,16 (0,93-1,44)

0,208

Nutrición enteral oral

4 (44,44)

5 (55,56)

0,73 (0,40-1,33)

0,24

Dispositivos médicos invasivos Uso de catéter

30 (26,79)

82 (73,21)

Cantidad de catéteres

1 (33,33)

2 (66,67)

28 (26,42)

78 (73,58)

1,10 (0,49-2,47)

1 (20)

4 (80)

1,2 (0,48-2,98)

Uso CVC

19 (25,33)

56 (74,67)

1,04 (0,82-1,31)

0,741

Uso CVP

10 (27,03)

27 (72,97)

0,98 (0,77 - 1,24)

0,905

Uso Mahurkar

2 (66,67)

1 (33,33)

0,44 (0,89-2,21)

0,169

Uso sonda vesical

26 (26,26)

73 (73,74)

1,00 (0,72-1,39)

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Tabla 14 Continuación, análisis bivariado de variables clínicas entre pacientes no colonizados y colonizados Variable No colonizados n=30

Colonizados n=84 RP(IC95%) Valor p n (%) n (%) Soporte ventilatorio

20 (27,03)

54 (72,97)

0,97 (0,77-1,22)

0,815

Intubación traqueal

18 (30)

42 (70)

0,9 (0,72-1,11)

0,346

Traqueostomía

2 (40)

3 (60)

0,80 (0,39-1,66)

0,606

Hemodiálisis

1 (14,29)

6 (85,71)

1,17 (0,85-1,62)

0,674

Diálisis peritoneal

0 (0)

2 (100)

Morbilidades Sepsis

2 (8)

23 (92,0)

1,34 (1,11-1,61)

0,020* Infección bacteriana localizada

3 (10,34)

26 (89,66)

1,31 (1,08-1,58)

0,028* Cáncer

2 (25)

6 (75)

1,01 (0,67-1,54)

Diabetes

3 (12,50)

21 (87,50)

1,25 (1,02 - 1,53)

0,117

Hipertensión arterial

11 (23,40)

36 (76,60)

1,06 (0,85 - 1,33)

0,554

Cirrosis hepática

1 (16,67)

5 (83,33)

1,13 (0,78 - 1,65)

Desnutrición

0 (0)

5 (100)

0,323

Falla renal

3 (16,67)

15 (83,33)

1,15 (0,91-1,47)

0,393

Obesidad

1 (11,11)

8 (88,89)

1,22 (0,94-1,59)

0,441

4.4.2 Análisis multivariado

Posterior al análisis bivariado, se realizó un análisis multivariado para determinar los factores independientes asociados a la colonización por Candida. Para este modelo, se incluyeron la edad, el régimen de salud, la cirugía reciente, el consumo de antibióticos, la terapia inmunosupresora, el uso de catéter Mahurkar, la presencia de sepsis, la infección bacteriana localizada y la diabetes por tener valor p menor a 0,2, y se analizaron mediante un modelo de regresión de Poisson con varianza robusta. Luego de evaluar diferentes modelos de regresión, las variables cirugía previa y la sepsis se mantuvieron en el modelo. De esta manera, el antecedente

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de cirugía se comportó como un factor que disminuye el riesgo de colonización por Candida (RP: 0,69, IC 95% 0,51-0,92, p= 0,012) mientras que la sepsis se comportó como un factor que aumenta el riesgo de colonización por Candida (RP: 1,36, IC 95% 1,15-1,62, p= <0,001) en el modelo final propuesto (Tabla 15).

Tabla 15 Modelo de regresión propuesto Colonización Razón de prevalencia (RP) IC 95% Valor p Cirugía reciente

0,69

0,51-0,92

0,012* Sepsis

1,36

1,15-1,62

<0,001*

El modelo descrito previamente se evaluó con la prueba de bondad de ajuste y se obtuvo un valor p=1,000. Lo anterior indica que el modelo ajustó bien los datos.

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5. Discusión de resultados

La candidiasis invasora es una de las infecciones fúngicas que afecta con mayor frecuencia a pacientes de UCI, puede ser de origen endógeno o exógeno, su progresión es bastante rápida, se ha asociado con alta morbilidad y mortalidad cercana al 40% (Cortes et al., 2020), y con factores de riesgo determinantes para su presentación. La colonización por Candida ha sido asociada como un factor de riesgo para el desarrollo de la infección junto con alteraciones intrínsecas del sistema inmune, el uso de dispositivos invasivos y procesos quirúrgicos que facilitan el paso de estas levaduras a otros tejidos (Caggiano et al., 2011; Logan et al., 2020). En el presente trabajo de grado se determinó la colonización por Candida spp. y las especies colonizantes en pacientes adultos no neutropénicos que ingresaron a los tres servicios de UCI polivalente del Hospital Universitario de Santander, así mismo, se revisaron los características clínicas y sociodemográficas de los pacientes que pudieran estar relacionadas con dicha colonización.

La necesidad de realizar vigilancia de colonización en los pacientes críticamente enfermos se soporta en el aumento de enfermedad fúngica invasiva (IFD) a nivel mundial principalmente en grupos poblacionales en riesgo como los pacientes en UCI. Por lo anterior, la OMS publicó en el 2022 la lista de patógenos fúngicos prioritarios categorizando a seis especies de Candida dentro tres grupos: crítico, alto y mediana prioridad, como un llamado a desarrollar estrategias encaminadas a la prevención de infección por estos patógenos (World Health Organization, 2022). Con respecto a los resultados obtenidos de la prevalencia puntual de colonización en la población de estudio, se evidenció un alto porcentaje de colonización por Candida spp. (73,68%; n=84) que refleja el estado previo con el cual ingresan los pacientes al servicio de UCI, es decir

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que puede tratarse de una colonización que los pacientes han adquirido de otro servicio, ambiente hospitalario o de la comunidad. Teniendo en cuenta estudios previos relacionados en pacientes críticos, la prevalencia de colonización es variable de acuerdo con el tipo de UCI (quirúrgica, médica o polivalente), el tipo de muestra evaluada (sitios de inserción de heridas, hisopado rectal, materia fecal, hisopados piel, aspirado traqueal, orina, entre otros,) y el período de toma de muestra (al ingreso o después de un tiempo de estancia en la UCI).

Los hallazgos obtenidos en el presente trabajo reflejan una alta prevalencia de colonización al ingreso a la UCI (73,68%; n=84), comparando con otros estudios previos, como el estudio multicéntrico realizado por Nascimento y colaboradores en dos hospitales en Portugal donde encontraron prevalencia de colonización al ingreso del 27,3%. Sin embargo, las muestras analizadas correspondían únicamente a hisopados de axila e ingle bilateral y, por otro lado, en una revisión sistemática y metaanálisis de colonización por Candida como predictor de candidiasis invasiva en pacientes no neutropénicos en UCI donde se incluyeron 9825 pacientes de 10 estudios se reportó un 40% de colonización (Nascimento et al., 2024; Alenazy et al., 2021). Por otra parte, otros estudios relacionados establecieron una mayor prevalencia de colonización que concuerdan con nuestro estudio, como el estudio de Caggiano y colaboradores en Italia (Caggiano et al., 2011) en pacientes críticos de neurocirugía, con una prevalencia de colonización al ingreso del 70,6%, o el estudio realizado por Jacobs y colaboradores en Estados Unidos donde reportaron un 67% de colonización al ingreso (Jacobs et al., 2015). Sin embargo, en Colombia no existen estudios similares de colonización con los cuales se puedan contrastar los resultados obtenidos, dado que los estudios desarrollados a la fecha se han enfocado en pacientes con candidemia y candidiasis invasiva, de manera que el desarrollo del trabajo de grado permitió obtener los primeros resultados de colonización por Candida spp. en pacientes críticos en nuestro medio.

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Adicional a la prevalencia alta de colonización, si bien se obtuvo predominio de colonización monofocal (51,19%; n=43), se detectó un porcentaje considerable de colonización multifocal (48,81%; n=41), observando que algunos pacientes presentaron la misma especie de Candida en los diferentes sitios anatómicos colonizados, lo que podría indicar la presencia de la misma cepa en diferentes localizaciones del paciente. Sin embargo, aunque la identificación fenotípica y por espectrometría de masas sugiera que los aislamientos corresponden a la misma especie, sería fundamental evaluar la clonalidad de estos aislamientos a través de estudios de tipificación molecular, con el fin de evaluar el grado de similitud genética entre las cepas aisladas y poder discriminar si se trata de una colonización multifocal clonal o por cepas diferentes (Li et al., 2016). Adicionalmente, los análisis de los perfiles espectrales del MALDI-TOF mediante la creación de dendrogramas utilizando PCA podría ayudar a visualizar similitudes y diferencias entre estos, pudiendo aportar información indirectamente sobre la relación entre cepas (Parra- Giraldo et al., 2018; Rodríguez et al., 2023). La colonización multifocal se ha descrito como un factor de riesgo independiente de infección por Candida en pacientes no neutropénicos en UCI, indicando que este tipo de colonización suele ser el primer estadio para la mayoría de los casos de Candidemia y Candidiasis Invasiva tal como se informa en el estudio EPCAN, donde el 56% de los pacientes presentaban colonización multifocal (León et al., 2006). A pesar de lo anterior, no fue posible determinar este factor de riesgo en la presente investigación dado que aún no se tiene acceso a datos de seguimiento que permitan evaluar si se desarrolló Candidiasis invasiva o Candidemia.

El uso del CHROMagar™ Candida permitió la detección de colonización mixta en las muestras estudiadas y la identificación presuntiva de las especies implicadas con mayor frecuencia en cuadros clínicos. Sin embargo, su implementación en estudios de colonización por Candida

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utilizando el sello replicador no se ha descrito hasta la fecha, aunque se ha reportado la implementación del agar cromogénico en la detección de Candidemia mixta que representa del 2% al 9% de este tipo de infecciones (Yang et al., 2014). El uso del CHROMagar™ Candida contribuye con la separación y purificación de los aislamientos y es importante para realizar una diferenciación inicial que aporta a la identificación definitiva de las levaduras del género Candida. Sin embargo, se recalca en la necesidad de utilizar un método definitivo de identificación como MALDI-TOF que permita la identificación a nivel de especie, teniendo en cuenta que especies miembros de complejos y especies crípticas pueden presentar el mismo color de la colonia en este medio.

En cuanto a la colonización por tipo de muestra se evidenció que los hisopados de piel en zona inguinal y axilar fueron los sitios anatómicos más colonizados (34,04%; n=48 y 20,56%; n=29, respectivamente) lo cual tiene relación con el comportamiento de Candida como levadura comensal colonizando tempranamente sitios como la piel, cavidad oral, tracto gastrointestinal y genitourinario y, las condiciones físicas proporcionadas por estos sitios donde la fricción constante y la humedad favorece el crecimiento y permanencia de la levadura, además que el uso de antibióticos o inmunosupresores en la población de estudio puede causar un desequilibrio en la microbiota de la piel, llevando al sobrecrecimiento de Candida spp. (Kühbacher et al., 2017). Sin embargo, en este estudio el consumo de antibióticos y la terapia inmunosupresora no mostraron asociación estadísticamente significativa que aumentara la probabilidad de colonización por Candida (Consumo de antibióticos RP:1,24; IC 95% 0,94-1,65; p=0,081 y terapia inmunosupresora RP:0,44; IC 95% 0,08-2,21; p=0,169).

Adicionalmente, la frecuencia de colonización que encontramos en el presente estudio de un 34,04% para la zona inguinal y 20,56% para la zona axilar, es similar al estudio de Nascimento

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y colaboradores, donde reportaron un 27.3% de colonización realizando muestreo de hisopado bilateral combinado en zona axilar e inguinal, enfatizando en la importancia de hacer muestreo de vigilancia en la piel (Nascimento et al., 2024), teniendo en cuenta que este sitio anatómico puede representar un reservorio para patógenos potenciales y facilitar la transmisión horizontal en el entorno hospitalario (Colombo et al., 2017). Estos hallazgos representan un posible riesgo dado que al perturbar la integridad de la barrera y/o la respuesta inmune del hospedante, el hongo puede migrar a través del epitelio y acceder a nichos anatómicos profundos para causar una infección (Lopes & Lionakis, 2022).

Una de las razones adicionales para hacer seguimiento de colonización en piel fue la importancia de la vigilancia de C. auris, la cual ha sido descrita como colonizante de piel de axila e ingle y como una levadura multirresistente, no obstante, en este estudio solo se encontró un aislamiento en piel de ingle cuya identificación fue confirmada por secuenciación de región ITS y en los análisis de susceptibilidad antifúngica (Gil Guiza, 2024) únicamente presentó resistencia a anfotericina B según los puntos de corte clínicos de la CDC.

Ahora bien, respecto a la colonización en vías urinarias que representó la más baja de nuestro estudio (9,21%) contrasta con los resultados obtenidos en un estudio de colonización en orina en pacientes admitidos a UCI en la India, donde se obtuvo una colonización del 57,5% en la población estudiada evidenciando el uso de sonda urinaria como un factor de riesgo para la colonización por Candida (Singla et al., 2012). Sin embargo, en nuestro estudio el uso de sonda vesical no fue estadísticamente significativo (RP:1,00; IC 95% 0,72-1,39; p=1) para determinar que esté asociada con una mayor probabilidad de colonización por Candida y, por otro lado, se desconocen las razones que expliquen la alta prevalencia de colonización en orina en el estudio de Singla y colaboradores, asumiendo que se aplicaron los protocolos correctos de antisepsia previo

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a la toma de muestra de orina por sonda. A pesar de lo anterior, nuestros resultados de distribución de especies aisladas en orina concuerdan con lo reportado en el estudio de Singla, siendo C. tropicalis la especie más frecuentemente aislada representando el 41,17% de los aislamientos en nuestro caso, respecto al 57,3% de los aislamientos obtenidos en su estudio, seguido de C. albicans (35,29% vs 29,33%), N. glabratus (17,64% vs 2,5%) y C. parapsilosis (5,88% vs 10,66%). C. tropicalis es considerada la primera o segunda especie más frecuentemente aislada en orina dentro del grupo de Candida no albicans (Álvarez-Lerma et al., 2003;Motoa et al., 2017), con capacidad de formar biopelículas en dispositivos médicos como las sondas urinarias (Negri et al., 2011) y clasificada en el grupo de alta prioridad por la OMS por su alta mortalidad en adultos al causar candidiasis invasiva, que oscila entre el 55 al 60% (World Health Organization, 2022). Por otra parte, en relación con el índice de colonización, se obtuvo una alta proporción de pacientes con índice igual o superior a 0,5 (61,70%; n=29) 7 días después del ingreso a UCI, lo cual puede sugerir un mayor riesgo en este grupo de pacientes de desarrollar candidiasis invasiva pues los estudios han reflejado que la colonización por Candida spp. precede a una infección fúngica invasiva y el riesgo se relaciona directamente con el índice de colonización (Eggimann et al., 2014). Sin embargo, es importante recalcar que en nuestro estudio se estimó el índice de colonización crudo dado que no se pudo determinar que correspondieran a aislamientos con idéntico patrón genético, como sugiere Pittet (Eggimann et al., 2014; Pittet et al., 1994). Tampoco fue posible estimar el índice de colonización corregido (ICC) pues no se realizaron cultivos semicuantitativos para poder estimar una colonización pesada por Candida spp. A pesar de lo anterior, Pittet sugiere en su estudio la utilidad de estimar el índice teniendo en cuenta el crecimiento de diferentes especies de Candida a pesar de no considerar el nivel genético, dado que de igual forma se está aportando a la carga fúngica que puede llevar al desarrollo de una infección

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en el paciente crítico (Eggimann et al., 2014). Por otro lado, no fue posible estimar el Candida Score en el presente estudio dado que su estimación está indicada en pacientes con estancia en UCI de al menos siete días y, en nuestro estudio solamente se obtuvo acceso a los registros clínicos del día de la toma de muestra basal (48-72 horas de ingreso a UCI), de manera que no se pudo conocer la presencia de factores de riesgo prolongados como la administración de nutrición parenteral, cirugía mayor y la presencia de sepsis severa, necesarios para determinarlo (León et al., 2006).

En cuanto a la distribución de especies colonizando a los pacientes críticos, en nuestro estudio C. albicans correspondió a la especie más prevalente (43,7%; n=80), lo cual es consistente con lo reportado en estudios relacionados, como el estudio EPCAN donde representó el 72,1% de los aislamientos (León et al., 2009), en Austria donde se reportó una prevalencia del 58% de los aislamientos en muestras de vigilancia (Kautzky et al., 2015), y en Colombia en un estudio sobre la epidemiología de aislamientos de Candida provenientes de UCI, donde C. albicans correspondió al 48,3% de los aislamientos (Motoa et al., 2017). Según la OMS, C. albicans forma parte del grupo crítico de patógenos prioritarios por su distribución a nivel global, alta mortalidad asociada al producir Candidiasis Invasiva, que oscila entre el 20 y el 50% y aumento en la resistencia a los azoles (World Health Organization, 2022). A pesar de lo anterior, nuestro estudio reflejó una alta prevalencia de especies de Candida no albicans (56,3%; n=103) como se han venido reportando también en estudios relacionados con un 51,7%, y un 64,8% de prevalencia (Motoa et al., 2017; Liew et al., 2015) respectivamente, e incluso sobrepasando la prevalencia de C. albicans hallando un predominio de especies no albicans con un 88% de prevalencia (Ahmed et al., 2018). Esta tendencia del cambio en la epidemiología y aumento de especies no albicans en los últimos años se ha fundamentado en factores de riesgo asociados a la colonización como el uso

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de dispositivos médicos, la nutrición parenteral y la exposición previa a antifúngicos como los azoles, aumentando la prevalencia de especies como C. parapsilosis y Pichia kudriavzevii (Riera et al., 2022). Sin embargo, en el presente estudio no fue posible comprobar esta asociación. Adicionalmente, la distribución de especies reportada en nuestro estudio es similar a lo encontrado en la epidemiología de Candidiasis Invasiva en Sur América y Colombia, donde C. albicans es la especie más prevalente, mientras que la especie más prevalente dentro del grupo no albicans es C. parapsilosis, seguido de C. tropicalis y una baja proporción de C. glabrata (Berrio et al., 2017; Riera et al., 2022).

Se destaca también el predominio de especies de C. parapsilosis colonizando la zona axilar (44,11%; n=15), teniendo en cuenta que es considerada un colonizador frecuente de la piel y de los ambientes hospitalarios (da Silva et al., 2021) asociada a infecciones intrahospitalarias posiblemente provenientes de las manos de los trabajadores sanitarios y de las superficies del entorno hospitalario y con capacidad de formar biopelículas en dispositivos médicos siendo una de las causas principales de infecciones asociadas a catéter (Riera et al., 2022) y categorizado en el grupo de prioridad alta de la OMS, debido al aumento en la resistencia antifúngica principalmente en aquellos aislamientos asociados a formación de biopelículas en dispositivos como líneas centrales, implantes y prótesis (World Health Organization, 2022). Además de las especies de Candida, se logró aislar e identificar otras levaduras en baja proporción (6,63%; n=13), tales como Diutina mesoruga, Lodderomyces elongisporus, Trichosporon asahii, Kazachstania telluris group, Kodamaea ohmeri y Saccharomyces spp., las cuales son consideradas patógenos emergentes en población crítica. En particular, D. mesorugosa, (antes C. rugosa) fue posible identificarla en nuestro estudio por secuenciación de región ITS y se han reportado casos de fungemia en pacientes inmunocomprometidos causada por esta levadura,

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con sensibilidad reducida a la anfotericina B y al fluconazol (Kumar et al., 2022). Asimismo, L. elongisporus que fue identificado correctamente por espectrometría de masas MALDI-TOF, aunque fenotípicamente similar al complejo C. parapsilosis, se ha relacionado con fungemias en ambientes hospitalarios, asociado a dispositivos intravasculares, por su capacidad de formar biopelículas y por su alta persistencia en el entorno hospitalario (Wang & Xu, 2023); levaduras como T. asahii y K. ohmeri han sido reportadas en infecciones graves, incluidas fungemias y casos de mortalidad elevada en pacientes inmunocomprometidos y con dispositivos invasivos. Estos patógenos no Candida suelen presentan patrones de resistencia antifúngica que pueden complicar el manejo terapéutico, lo que resalta la importancia de identificarlas correctamente, dado que, por ejemplo, Trichosporon es intrínsecamente resistente a los equinocandinas, mientras que Kodamaea ohmeri ha mostrado variabilidad en su respuesta a antifúngicos (Benelli et al., 2022; Wang & Xu, 2023).

Con relación a la determinación de características sociodemográficas asociadas a la colonización, en este estudio no se evidenció asociación estadísticamente significativa de ninguna de las características estudiadas como el sexo biológico y la edad incluidas en la hipótesis planteada inicialmente, de manera que no se encuentran asociadas a una mayor o menor probabilidad de colonización por Candida spp. en la población de estudio. Contrario a estos resultados, un estudio en China comparando características clínicas y epidemiológicas de pacientes críticos colonizados respecto a los no colonizados encontraron diferencias significativas en la edad (p= ˂0,001) y el sexo (p=0,005) entre ambos grupos de pacientes, aumentando la probabilidad de colonización por Candida spp. en pacientes con mayores a 65 años y de sexo biológico masculino (Xia et al., 2022). Asimismo, otro estudio reportó diferencias estadísticamente significativas por edad entre los pacientes no colonizados y colonizados por Candida spp. a nivel oral, sugiriendo

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que, por cada década, aumentaba la probabilidad de colonizarse por Candida spp. en un 30% (OR:1,03; IC 95% 1,02–1,04; p=0,001), sin embargo, el sexo biológico no mostró diferencias significativas (Malani et al., 2011). A pesar de lo anterior, otros estudios coinciden con nuestros hallazgos, no encontrando asociación estadísticamente significativa de estas características con la colonización por Candida (Caggiano et al., 2011; Nascimento et al., 2024; Schulte et al., 2015). Respecto a las características clínicas estudiadas en los pacientes críticos de nuestro estudio, en los análisis bivariados la infección bacteriana localizada (RP:1,31, IC 95% 1,08-1,58, p=0,028), la presencia de sepsis (RP:1,34, IC 95% 1,11-1,61, p=0,020) y la cirugía reciente (RP:0,69, IC 95% 0,51-0,93, p=0,004) mostraron una asociación estadísticamente significativa, estas dos últimas se mantuvieron en el modelo propuesto de regresión logística como factores asociados a la colonización comportándose la cirugía como un factor que disminuye el riesgo de colonización por Candida (RP: 0,69, IC 95% 0,51-0,92, p= 0,012) mientras que la sepsis se comportó como un factor que aumenta el riesgo de colonización por Candida (RP: 1,36, IC 95% 1,15-1,62, p= <0,001). Específicamente, es interesante el comportamiento de la cirugía en nuestro estudio como un factor estadísticamente asociado a una menor probabilidad de colonización, contrario al reporte de estudios relacionados donde se ha encontrado como un factor de riesgo, es decir, aumentando la probabilidad de colonización por Candida spp. y asociado al desarrollo de candidiasis invasiva, incluso formando parte de herramientas clínicas de predicción como el Candida Score, siendo un factor independiente asociado a la infección por Candida spp. según el estudio EPCAN (OR: 2,04; IC 1,27 - 3,30; p=0,003) o la regla predictiva propuesta por Ostrosky- Zeichner et al. basado en dos estudios retrospectivos multicéntricos, donde la cirugía es un criterio menor dentro del modelo predictivo de candidiasis invasiva (Delaloye & Calandra, 2014; León et al., 2009; Ostrosky-Zeichner et al., 2007). Principalmente, la práctica de cirugías abdominales es

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la que se ha asociado con mayor riesgo de desarrollar candidiasis invasiva, como reportó Agyald- Öhman en su estudio realizado a 59 pacientes de la UCI, encontrando que un índice de colonización mayor a 0,8 y la práctica de cirugía gastro-abdominal se asoció con el desarrollo de candidiasis invasiva (Agvald-Öhman et al., 2008). Lo anterior, se explica por la alteración de la integridad física de la piel y membranas mucosas que puede resultar en contaminación del peritoneo por la microbiota intestinal, donde se encuentra Candida como colonizador, que sumado a factores adicionales del paciente crítico puede llevar al desarrollo de candidiasis invasiva a nivel abdominal como peritonitis recurrentes y abscesos intra-abdominales (Eggimann 2014). Sin embargo, en nuestro estudio no pudimos realizar el análisis por tipo de cirugía, pues el número de unidades de observación por tipo era muy pequeño para estimar su comportamiento en la colonización por Candida spp., lo que hubiese podido brindarnos una mayor claridad respecto a la asociación que evidenciamos. A pesar de lo anterior, se podría explicar posiblemente el comportamiento de la cirugía como un factor que disminuye el riesgo de colonización por Candida por las medidas más estrictas de higiene durante el período perioperatorio, que puede incluir un manejo más riguroso de las prácticas de asepsia y desinfección, como los baños pre-quirúrgicos con clorhexidina, una administración más controlada y dirigida de antibióticos, reduciendo el riesgo de disbiosis o por los cuidados posoperatorios de los pacientes, donde se brinda un monitoreo más controlado para la prevención de infecciones, limitando la colonización. En relación con la presencia de sepsis que se encontró en nuestro estudio el cual aumenta la probabilidad de colonización por Candida spp., guarda relación con lo reportado en Turquía por Ayhan et al. 2019, en un estudio en pacientes críticos no neutropénicos donde la sepsis se comportó como un factor de riesgo independiente para la colonización por Candida (OR: 2,37; IC 95% 1,15- 4,85; p=0,018) y para la infección (OR: 7,89; IC 95% 3,54-17,57; p=<0.001) (Ayhan et al., 2019)

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y en otros estudios donde se ha descrito como factor de riesgo asociado a la infección tales como el estudio observacional EPCAN (OR: 8,29; IC 95% 5,07-13,6: p=<0.001) (León et al., 2009), y el meta-análisis y revisión sistemática que realizó Alenazy et al. 2021 en 9825 pacientes críticos no neutropénicos, evidenciando que los pacientes con sepsis y colonizados con Candida spp. tienen mayor probabilidad de desarrollar candidiasis invasiva (OR 3,32; 95% CI 1.68–6.58) (Alenazy et al., 2021). Por otro lado, la infección bacteriana localizada se encontró estadísticamente asociada con una mayor probabilidad de colonización por Candida spp. en el análisis bivariado (RP:1,31, IC 95% 1,08-1,58, p=0,028) y se relaciona con lo planteado en la hipótesis de investigación, coincidiendo con el estudio de Xia et al. 2022 donde las infecciones concurrentes bacterianas presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes colonizados y no colonizados (p=0,004)(Xia et al., 2022) y con el estudio de Schulte et al. 2015 donde determinaron factores de riesgo asociados a la colonización por Candida y a la cocolonización con bacterias multirresistentes (MDRO) , encontrando que los pacientes con histórico de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), tenían mayor probabilidad de presentar co-colonización con Candida spp. (OR: 5,51; IC 95% 1,89-16,04) (Schulte et al., 2015). Teniendo en cuenta lo anterior, hay que tener presente que las infecciones bacterianas localizadas, que pueden conducir a sepsis, incrementan la necesidad de antibióticos de amplio espectro, que causan una presión selectiva en la microbiota y promueven un entorno favorable para la colonización por Candida spp. (Guinan et al., 2019). No obstante, en el presente estudio no se encontró asociación estadísticamente significativa entre el consumo de antibióticos y la colonización por Candida spp. Finalmente, en el presente trabajo de investigación se generaron los primeros datos a nivel de Santander sobre la colonización por Candida en pacientes adultos al ingreso a UCI, determinando la prevalencia y la incidencia de colonización a los 7 días de estancia, así como la

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distribución de especies colonizantes con la aplicación de tres métodos de identificación, que permitieron determinar las especies de levaduras no solamente del género Candida sino también pertenecientes a otros géneros considerados patógenos emergentes en los pacientes críticos, así como la determinación de factores estadísticamente asociados con una mayor o menor probabilidad de colonización por Candida spp. en la población de estudio. No obstante, el estudio presenta limitaciones derivadas del diseño metodológico por corresponder a un estudio observacional, donde es posible la presentación de sesgos de selección teniendo en cuenta la heterogeneidad de la población de estudio, dado que los pacientes críticos pueden diferir en cuanto a la gravedad de su estado de salud, comorbilidades, entre otros factores, sesgos de información derivado de la fuente secundaria correspondiente a las historias clínicas para el acceso a variables clínicas y sociodemográficas de interés para el estudio teniendo en cuenta que estos registros son realizados por diferente personal de salud pudiéndose presentar registros clínicos incompletos y, que no es posible determinar relación causal entre los factores de riesgo determinados y la colonización por Candida debido al tipo de estudio que se desarrolló. Finalmente, hay que tener presente que la estimación del tamaño de muestra para el presente estudio se calculó a partir de variables sociodemográficas y clínicas que mostraron asociación estadísticamente significativa con la colonización por Candida en estudios previos. Sin embargo, para variables con p marginal se podría incrementar el poder estadístico ampliando el tamaño de la muestra para determinar si estas variables tienen relevancia clínica en la colonización por Candida, y por lo tanto implicaciones importantes para el desarrollo de estrategias de prevención en la UCI.

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6. Conclusiones

Se evidenció una alta prevalencia de colonización al ingreso a la Unidad de Cuidados Intensivos en la población de estudio correspondiente al 73,68% y una incidencia acumulada de colonización a los siete días de estancia del 42,85%, con un índice de colonización superior a 0,5 en el 61,70% de los pacientes, hallazgos que sugieren la importancia de la vigilancia y monitoreo continuo de pacientes en riesgo para prevenir el desarrollo de infección por Candida spp. La especie más prevalente encontrada fue Candida albicans representando el 43,7% de los aislamientos y predominando en la ingle, faringe y tráquea. Sin embargo, se resalta la presencia mayoritaria de especies no albicans que representaron el 56,3%, con predominio de Candida parapsilosis, destacando la necesidad de implementar métodos de identificación precisos debido a factores de virulencia y patrones de susceptibilidad diferenciales de las especies. Se encontraron como factores asociados a la colonización por Candida spp. la presencia de infección bacteriana localizada, sepsis y la cirugía reciente. La infección bacteriana y la presencia de sepsis se asociaron con mayor probabilidad de colonización por Candida spp. mientras que la cirugía reciente se asoció con una menor probabilidad de colonización; los dos últimos, conservando esta significancia en el análisis multivariado. Los hallazgos de este estudio abren la posibilidad de llevar a cabo futuras investigaciones en nuestra población orientadas a evaluar el impacto de la colonización en el desarrollo de infección invasiva en pacientes críticos y con base en ello, implementar protocolos de evaluación de riesgo y programas dentro del control de infecciones que minimicen la prevalencia de colonización en los pacientes críticos.

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7. Recomendaciones

Realizar seguimiento a los pacientes durante su estancia en UCI para evaluar la colonización durante la estancia en el servicio y el desarrollo de infección invasiva por Candida con el fin de determinar el riesgo asociado a la colonización y la utilidad clínica del índice de colonización en el desarrollo de candidiasis invasiva en el contexto local. La realización de cultivos semicuantitativos para determinar colonización pesada en la población de estudio y estimar el índice de colonización corregido y su utilidad clínica. Establecer la distribución de especies de Candida causando infección invasiva en pacientes críticos junto con la determinación de los perfiles de susceptibilidad y comparar con la distribución de especies y perfil de susceptibilidad de Candida implicada en colonización. Realizar estudios de colonización en el personal de salud y muestreos en el ambiente hospitalario acompañado de la determinación de genotipos circulantes de especies de Candida con el fin de evaluar el riesgo de transmisión horizontal por esta levadura en los servicios de UCI.

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p. 94

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

Apéndices Apéndice A.

Consentimiento informado del macroproyecto

p. 95

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p. 96

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p. 97

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Apéndice B Tabla de operacionalización de variables Variable Definición conceptual Definición operativa Naturaleza Escala de medición Valores que asume la variable I.

Variables sociodemográficas Sexo Características biológicas y fisiológicas que definen al hombre y a la mujer Información registrada en la historia clínica del paciente como sexo biológico para caracterizar a la población de estudio Cualitativa, dicotómica Nominal Femenino = 0 Masculino =1 Edad Tiempo que ha vivido una persona contando desde su nacimiento Años cumplidos según la fecha de nacimiento registrada en la historia clínica, certificado en el documento de identidad para caracterizar a la población de estudio Cuantitativa, discreta Razón Cualquier número entero Régimen de salud Conjunto de normas que rigen la vinculación de los individuos y las familias al Sistema General de Seguridad Social en Salud Información registrada en la historia clínica del paciente como régimen de salud Cualitativa, politómica Nominal Subsidiado =0 Vinculado/ninguno =1 Contributivo=2 Otro =3

II. Variables Clínicas

p. 100

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

100

Motivo de ingreso a UCI Proceso patológico o afección que tras el estudio pertinente y según criterio facultativo, se considera la causa principal o motivo del ingreso Información registrada en la historia clínica el día de toma de muestra como motivo de ingreso al servicio de Unidad de Cuidados Intensivos Cualitativa, politómica Nominal Posoperatorio=0 Insuficiencia respiratoria=1 Choque=2 Politraumatismo=3 Crisis hipertensiva =4 Sepsis =5 Hemorragia = 6 Falla cardíaca =7 Infección localizada =8 Accidente Cerebrovascular=9 Falla Renal=10 Otras=11 Tiempo de estancia hospitalaria antes de admisión a

UCI

Tiempo en el que un paciente utilizó un servicio hospitalario.

Tiempo en días en el que el paciente permaneció en un servicio hospitalario ( urgencias, hospitalización) previo al ingreso al servicio de UCI, según revisión de historia clínica Cuantitativa, continua Razón Cualquier número real

APACHE II

Acute Physiology And Chronic Health Evaluation II, Sistema de clasificación de severidad o gravedad de enfermedad, aplicado dentro Puntuación obtenida a partir del registro en la historia clínica del día de toma de muestra Cualitativa, politómica Nominal 0-4 Mortalidad 4%=1 5-9 Mortalidad 8% =2 10-14 Mortalidad 15%=3 15-19 Mortalidad 25%=4

p. 101

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

101

de las 24 horas de admisión del paciente a UCI.

20-24 Mortalidad 40%=5 25-29 Mortalidad 55%=6 30-34 Mortalidad 75%=7 Más 34 Mortalidad 85%=8 Cirugía reciente Procedimiento quirúrgico que implica realizar incisiones o suturar tejidos para tratar enfermedades, lesiones o deformidades.

Paciente que haya tenido cirugías recientes, considerando tres meses previos al ingreso al servicio de UCI, según revisión de historia clínica Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Tipos de cirugía Tipo de procedimiento quirúrgico llevado a cabo en el paciente Tipos de procedimientos quirúrgicos registrados en la historia clínica Cualitativa, politómica Nominal Laparotomía=0 Angioplastia =1 Craneotomía =2 Desbridamiento=3 Drenaje=4 Trombectomía =5 Toracotomía =6 Otras Cirugías Abdominales=7 Otras cirugías =8

Medicamentos

p. 102

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

102

Consumo de antibióticos Fármacos o sustancias químicas utilizados para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas.

Paciente al que su historia clínica refiera la administración de una terapia antibiótica un mes previo al ingreso de UCI.

Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Tipo de Antibiótico administrado Tipo de fármacos o sustancias química utilizado para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas.

Tipo de antibiótico administrado al paciente, especificado en la historia clínica Cualitativa, politómica Nominal Ampicilina Sulbactam =0 Piperacilina Tazobactam=1 Vancomicina=2 Doxiciclina=3 Cefazolina=4

SXT=5

Meropenem=6 Metronidazol=7 Ciprofloxacino=8 Amikacina=9 Penicilina=10 Ceftriaxona=11 Tto TBC=12 Claritromicina=13 Cefepime=14 Linezolid=15 Ampicilina=16 Rifamixina=17 Cefradina=18 Clindamicina=19

p. 103

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

103

Cantidad de antibióticos administrados Número de Fármacos utilizados para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas que es administrado al paciente Número de antibióticos que se le administra al paciente consignado en la historia clínica del día de toma de muestra Cuantitativa, discreta Razón Cualquier número entero Consumo antifúngico posingreso al servicio de UCI Fármacos o sustancias químicas utilizados para el tratamiento o prevención de infecciones fúngicas.

Paciente al que su historia clínica refiera la administración de una terapia antifúngica posterior al ingreso al servicio de UCI Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Antifúngico administrado Tipo de fármaco utilizado para el tratamiento o prevención de infección fúngica Tipo de antifúngico administrado al paciente, especificado en la historia clínica Cualitativa, politómica Nominal Clotrimazol =1 Fluconazol =2 Anfotericina B + fluconazol =3

Administración Propofol Anestésico general intravenoso de corta acción para inducción y mantenimiento de anestesia general en adultos y sedación en pacientes sometidos a respiración asistida artificial en UCI Paciente al que su historia clínica refiera la administración de Propofol Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1

p. 104

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

104

Terapia inmunosupresora Tratamiento que disminuye la actividad del sistema inmune del cuerpo, reduciendo la capacidad de combatir infecciones y otras enfermedades como el cáncer.

Indicado para trasplante y pacientes con enfermedades autoinmunes y alergias.

Terapia con medicamentos inmunosupresor es que se indique e en la historia clínica del paciente el día de la toma de muestra.

Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Consumo de corticoides Medicamentos antiinflamatorios que reducen la actividad del sistema inmune Terapia con medicamentos corticoides que se indique e en la historia clínica del paciente el día de la toma de muestra.

Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Cantidad de corticoides Número de medicamentos antiinflamatorios que reducen la actividad del sistema inmune Número de corticoides que se le administra al paciente consignado en la historia clínica del día de toma de muestra Cuantitativa, discreta Razón Cualquier número entero Tipo de corticoide Tipo de medicamento antiinflamatorio que reduce la actividad del sistema inmune Tipo de corticoides que se le administra al paciente consignado en la historia clínica del día de toma de muestra Cualitativa, politómica Nominal Prednisolona=0 Metilprednisolona=

Hidrocortisona=2 Beclometasona=3 Dexametasona=4

p. 105

CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

105

Prednisona=5

Tipo de nutrición Nutrición total parenteral Alimentación a través de una sonda insertada en una vena mediante la cual los nutrientes ingresan a la sangre directamente.

Paciente al que su historia clínica refiera la administración de nutrición total parenteral Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Nutrición enteral por sonda Alimentación a través de una sonda colocada en el estómago o en el intestino delgado.

Paciente al que su historia clínica refiera la administración de nutrición enteral por sonda Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Nutrición enteral vía oral Medida terapéutica de soporte nutricional a través de la cual se introducen los nutrientes directamente en el tubo digestivo cuando la persona tiene alguna dificultad para ingerirlos con normalidad.

Tipo de nutrición enteral menos invasivo.

Paciente al que su historia clínica refiera la administración de nutrición enteral por vía oral.

Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1

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Dispositivos médicos invasivos Uso de catéter Conductos delgados de plástico flexible que se introducen en una pequeña aguja o catéter endovenoso (un diminuto tubo flexible) que se coloca dentro de una vena para permitir el acceso al sistema venoso.

Paciente al que en su historia clínica se refiera con uso de vía endovenosa al momento de tomar la muestra Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Cantidad de catéter Cantidad de catéteres que tenga el paciente para permitir el acceso al sistema venoso.

Número de catéteres que utiliza el paciente al momento de la toma de muestra, referidos en la historia clínica Cuantitativa, discreta Razón Cualquier número entero Tipo de catéter Dispositivo con forma de tubo insertado en la vena y dirigido hasta una vena de gran tamaño para permitir el acceso al sistema venoso y permitir la administración de terapias intravenosas prolongadas.

Tipo de catéter endovenoso que utiliza el paciente Cualitativa, politómica Nominal

CVC =0

CVP=1

Catéter Mahurkar =2 Otro=3

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Uso de Sonda vesical Dispositivo en la vejiga con forma de tubo flexible de látex, poliuretano o silicona a través de la uretra, permitiendo que la orina drene libremente de la vejiga para la recolección.

Paciente al que en su historia clínica se refiera con uso de sonda urinaria al momento de tomar la muestra Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Soporte ventilatorio

Apoyo ventilatorio mecánico para ayudar o sustituir la respiración espontánea dado que mejora la función ventilatoria y oxigenación por medio de la aplicación de gas con gran contenido de oxígeno y presión positiva.

Paciente al que en su historia clínica se refiera con soporte ventilatorio Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Intubación traqueal

Procedimiento médico en el cual se coloca una sonda en la tráquea a través de la boca o la nariz para permitir la permeabilización y el aislamiento de la vía aérea para administrar oxígeno a alta concentración o Paciente al que en su historia clínica se refiera con intubación traqueal Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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la administración de medicamentos vía traqueal.

Traqueostomía Una traqueostomía es una abertura en frente del cuello que se hace durante un procedimiento de emergencia o una cirugía planeada.

Forma una vía respiratoria para las personas que no pueden respirar por sí mismas, que no pueden respirar bien, o que tienen una obstrucción que afecta su respiración Paciente al que en su historia clínica se refiera con traqueostomía Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Hemodiálisis Terapia de sustitución renal cuya finalidad es suplir parcialmente la función de los riñones, permitiendo disminuir los niveles en sangre de sustancias toxicas cuando están en exceso y que el riñón sano elimina.

Paciente al que en su historia clínica se refiera en procesos de hemodiálisis durante la estancia UCI Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Diálisis peritoneal Tratamiento para la insuficiencia renal que utiliza el revestimiento del abdomen o vientre del paciente para filtrar la sangre dentro del organismo.

Procedimiento practicado en el paciente que se haya descrito en la historia clínica del día de toma de muestra Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Morbilidades Sepsis Síndrome de anormalidades fisiológicas, patológicas y bioquímicas, potencialmente mortal asociadas a una infección.

Paciente al que su historia clínica refiera la presencia de sepsis durante la estancia en UCI.

Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Infección bacteriana localizada Infección causada por bacterias Paciente que curse con enfermedad infecciosa bacteriana al momento de la toma de muestra Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Cáncer Conjunto de enfermedades relacionadas en las que se observa un proceso descontrolado en la división celular.

Paciente al que su historia clínica refiera padecer cáncer Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Tipo de cáncer Tipo de cáncer diagnosticado en los pacientes Tipo de cáncer registrado en la historia clínica Cualitativa, politómica Nominal Mama= 1 anal/rectal = 2 Cuello uterino =3 Cuerdas bucales =4

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Próstata = 5 Intestinal =6 Diabetes Enfermedad crónica prolongada en la cual el cuerpo no puede regular la cantidad de azúcar en la sangre Paciente al que su historia clínica refiera padecer diabetes Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Hipertensión arterial Definida como presión arterial sistólica igual o superior a 140 mmHg o presión arterial diastólica igual o superior a

90 mmHg, es

uno de los factores de riesgo más importantes para las enfermedades cardiovasculares y la enfermedad renal crónica.

Trastorno que padece el paciente, mencionado en la historia clínica del día de toma de muestra Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Cirrosis hepática Etapa tardía de la cicatrización (fibrosis) del hígado como consecuencia de diferentes enfermedades crónicas.

Paciente al que su historia clínica refiera padecer cirrosis hepática Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Desnutrición Estado patológico de distintos grados de seriedad y de distintas manifestaciones clínicas, causado por la asimilación deficiente de alimentos ingeridos por el organismo.

Paciente al que en su historía clínica la valoración por nutrición refiera algún grado de desnutrición Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Falla renal Afección en la cual los riñones dejan de funcionar y no pueden eliminar los desperdicios y el agua adicional de la sangre, o mantener en equilibrio las sustancias químicas del cuerpo.

Paciente al que su historia clínica refiera falla renal Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Obesidad Es una enfermedad crónica que se caracteriza por la acumulación excesiva del tejido adiposo en el cuerpo Paciente al que su historia clínica refiera obesidad Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1

III.

Variables relacionadas con la muestra y colonización por Candida

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Tipo de muestra Muestra de material biológico usadas para pruebas de laboratorio o para uso en investigación.

Tipo de muestra/sitio anatómico cultivado para evaluación de crecimiento de Candida spp.

Cualitativa, politómica Nominal Orina = 1 Hisopado de axila =

Hisopado de ingle =3 Frotis faríngeo = 4 Aspirado traqueal =

Colonización por Candida spp.

Presencia, crecimiento y multiplicación de un microorganismo en un hospedero sin causar una respuesta inmune específica o infección.

Presencia del microorganismo en el hospedero sin causar enfermedad.

Presencia de Candida spp.

en muestras no estériles, obteniendo crecimiento en Agar Saboraud Dextrosa por 24

- 48 horas a 35

± 2ºC Cualitativa, dicotómica Nominal No = 0 Sí = 1 Tipo de colonización Clasificación según el número de sitios colonizados con Candida spp.

Monofocal:

Crecimiento en una única muestra del total de muestras cultivadas Multifocal:

Crecimiento en dos o más muestras del total de muestras cultivadas.

Cualitativa, dicotómica Nominal Monofocal = 0 Multifocal = 1

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Número de sitios cultivados con crecimiento de Candida spp.

Cantidad total de muestras con cultivos positivos para Candida spp.

Cantidad total de muestras con crecimiento de Candida spp. en Agar Saboraud Dextrosa y Agar Chromagar por

24 - 48 horas a

35 ± 2ºC

Cuantitiva, discreta Razón Cualquier número entero Índice de colonización (IC) según Pittet Proporción del número de sitios diferentes a sangre colonizados por Candida spp.

respecto al total de muestras cultivadas, en pacientes con estancia en UCI de 7 días Proporción calculada a partir de los sitios con colonización por Candida spp.

respecto al total de muestras cultivadas en los pacientes con segunda toma de muestra ( 7 días de estancia en

UCI)

Cuantitiva, continua Razón Cualquier número real IV.

Variables microbiológicas Prueba del tubo germinal Es una prueba para la identificación presuntiva del complejo Candida albicans.

Determina la extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces Observación del tubo germinal posterior a incubar por 2 horas a 35°C una colonia de la levadura a estudiar inmersa en suero humano.

Cualitativa, dicotómica Nominal Negativo = 0 Positivo = 1

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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mayor que la célula madre.

Prueba del agar tabaco Prueba para la diferenciación presuntiva de Candida albicans y Candida dubliniensis Observación de la macro morfología y micro morfología de las colonias crecidas en Agar tabaco a las 24-

48 horas con

incubación a 28- 30ºC Cualitativa, dicotómica Nominal Negativo=0 Positivo=1 Color de la colonia en CHROMagar CandidaTM Desarrollo del color característico de las colonias en CHROMagar Candida Identificación presuntiva de ciertas especies de Candida spp.

a partir del color característico de la colonia desarrollado en medio cromogénico.

Cualitativa, politómica Nominal Verde = 0 Morado = 1 Azul = 2 Rosado = 3 Otro = 4 Especie de Candida identificada por Bioquímica Rapid ID Yeast plus Remel Identificación de la levadura en términos de especie aislada a partir de muestras de colonización utilizando un micrométodo cualitativo que emplea sustratos cromogénicos y convencionales para la identificación de levaduras de importancia clínica Identificación a nivel de especie obtenida a partir de la puntuación individual obtenida para el aislamiento y comparado con la base de datos RapID Yeast Plus.

Cualitativa, politómica Nominal Especies de Candida detectadas según el kit No identifica

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Especie de Candida identificada por

MALDI-TOF

Identificación de la levadura en términos de especie aislada a partir de muestras de colonización utilizando un método basado en espectrometría de masas

MALDI-TOF

Identificación obtenida a nivel de especie a partir de la comparación del espectro de la muestra con una base de datos de referencia MBT Compass Library BDAL, con un score mayor o igual a

Cualitativa, politómica Nominal Especies de Candida detectadas según la base de datos del software MBT Compass V.

4.1.100

No identifica Especie de Candida identificada por secuenciacion de

ITS

Identificación de la levadura en términos de especie basada en el análisis de la región ITS.

Resultado de la identificación molecular a partir de la amplificación de la región espaciadora interna del RNA ribosomal ITS 1 e ITS 2, secuenciando y comparando con secuencias de referencia de las bases de datos GenBank y

CBS-KNAW

Cualitativa, politómica Nominal No Aplica = 0; Especies de Candida detectadas según análisis de secuenciación

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice C Instrumento de recolección de datos clínicos y sociodemográficos.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice D Instrumento de recolección de datos microbiológicos

Toma de muestra inicial Total sitios colonizados:

Índice de colonización Pittet:

Total sitios colonizados:

Índice de colonización Pittet:

5. Aspirado traqueal

1. Orina por sonda

3. Hisopado ingle

1. Orina micción espontánea

2. Hisopado axila

3. Hisopado ingle

4. Frotis faringeo

5. Aspirado traqueal

RapID Yeast

MALDI-TOF

(Score) Secuenciación

ITS

2. Hisopado axila

4. Frotis faringeo

Aislamientos Criopres ervado Identificación presuntiva Identificación definitiva Crecimiento en Chromagar (Color) Registro de resultados de Microbiología - Proyecto Candida Código pte.

Fecha de captación Tipos de muestra Fecha de toma Colonización por Candida spp.

Agar tabaco Tubo Germinal

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice E Agar Sabouraud 2%. (SDA-Merck) (SDA 2%) Ingredientes Gramos/litro Peptona especial

D (+) Glucosa

Agar

pH final 5.6 ± 0.2 a 25ºC Tomado de: (Merck Millipore, n.d.)

Disolver 47 gramos de agar Sabouraud al 2% en 1 litro de agua destilada. Adicionar 50 mg de clorafenicol. Calentar para homogenizar la mezcla. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos. Dejar enfriar y servir en placas de Petri estériles. Realizar control de calidad de esterilidad incubando un medio de cultivo a 37ºC por 24 horas y, control de calidad de crecimiento utilizando cepas ATCC.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice F CHROMagarTM Candida Ingredientes Gramos/litro Agar

15,0

Peptona

10,2

Cloranfenicol

0,5

Mezcla cromogénica

22,0

pH final 6.1 ± 0.2 a 25ºC Tomado de: (CHROMagar, n.d.)

Autoclavar el volumen necesario de agua destilada para la preparación del CHROMagarTM Candida, dado que no se puede autoclavar el medio de cultivo. Autoclavar un vaso de precipitado y una bala magnética. Pesar 47,7 gramos por litro de agua destilada estéril y en cabina de seguridad biológica suspender el polvo en el agua destilada estéril y calentar hasta ebullición (100ºC) agitando o removiendo regularmente. No calentar a más de 100ºC. Dejar enfriar y servir el medio en cajas de Petri estériles. Almacenar en la oscuridad.

Realizar control de calidad de esterilidad incubando un medio de cultivo a 37ºC por 24 horas y, control de calidad de crecimiento utilizando cepas ATCC.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice G.

Procedimiento para el montaje del panel RapID Yeast Plus (ThermoFisher Scientific, 2004). A partir de un cultivo puro de la levadura de 48 horas de incubación a 30°C, realizar una suspensión concentrada del microorganismo con palito de madera estéril en el fluido de inoculación del RapID (2 mL) hasta alcanzar una turbidez que oculte por completo las líneas negras de la tarjeta guía de inoculación. Realizar vórtex para homogenizar el inóculo. Nota: Las suspensiones significativamente menos turbias pueden alterar las reacciones de la prueba. Sin embargo, las suspensiones ligeramente más turbias no afectan el desempeño de la prueba.

Despegar la tapa del panel sobre el sitio de inoculación retirando la pestaña “Peel to Inoculate” hacia arriba y hacia la izquierda.

Con ayuda de una pipeta estéril, transferir con cuidado todo el líquido de inoculación hacia la esquina superior derecha del panel. Sellar la pestaña de inoculación. Luego de añadir el líquido de inoculación y manteniendo el panel sobre una superficie nivelada, inclinar el panel hacia atrás alejándose de los pocillos de reacción en un ángulo aproximado de 45° como se muestra a continuación:

Mientras está inclinado el panel hacia atrás, balancear suavemente el panel de lado a lado para distribuir uniformemente el inóculo a lo largos de los carriles, como se muestra a continuación:

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Manteniendo una posición horizontal y nivelada, inclinar lentamente el panel hacia adelante donde se ubican los pocillos de reacción, hasta que el inóculo fluya hacia cada pocillo, los cuáles deben llenarse uniformemente y no presentar burbujas. Dar ligeros golpes para eliminar burbujas.

Colocar el panel en posición nivelada e incubar los paneles inoculados a 30°C por 4 horas. Después de las 4 horas de incubación de los paneles inoculados, proceder a la lectura así: Añadir 1 gota del reactivo RapID Yeast Plus A a los pocillos del 7 (NAGA) al 14 (PCHO). Leer inmediato.

Añadir 1 gota del reactivo RapID Yeast Plus B a los pocillos del 16 (PRO) al 18 (LGY). Esperar 30 segundos para iniciar la lectura. No realizar lectura después de transcurrido 1 minuto. Leer y puntuar los pocillos de prueba de izquierda a derecha con la guía de colores e interpretación para determinar reacciones positivas o negativas (Tabla 16). Anotar las puntuaciones en el formulario de resultados (Figura 8).

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Tabla 16 Interpretación de las pruebas del sistema RapID Yeast Plus:

Figura 8 Formato de registro de resultados del sistema RapID Yeast Plus:

Consultar el microcódigo obtenido en el formulario de resultados en la base de datos ERIC (http://www.remel.com/eric/) para ver la identificación.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice H Agar tabaco (Girish Kumar & Menon, 2005) Ingredientes Gramos/litro Hojas de tabaco secas

Agar- agar

pH final 6 ± 0.2

Pesar 50 gramos de hoja de tabaco secas previamente autoclavados a 121ºC por 15 minutos. Hervir en 1 litro de agua destilada por 30 minutos. Obtener el extracto de las hojas filtrando con gaza y dejar enfriar. Reajustar el volumen del medio a 1 litro y añadir 20 gramos de agar -agar. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos y dispensar en cajas de Petri estériles. Figura 9 Crecimiento en agar tabaco de C. albicans ATCC 14053 (izquierda) y C. dubliniensis NCPF ATCC 3949 (derecha)

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Figura 10 Observación del agar tabaco a 40x con azul de lactofenol: Ausencia de clamidoconidas (izquierda) y presencia de clamidoconidias (derecha)

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice I Extracción total de proteínas y montaje para identificar por MALDI-TOF Rotular los eppendorf de1.5 mL donde se realizará la extracción de cada levadura. Transferir 300 µL de agua destilada estéril a cada eppendorf de 1.5 mL. Utilizando palillos limpios, transferir de 4 a 5 colonias de un cultivo puro al eppendorf con agua destilada y mezclar con el vórtex para suspender la colonia de la levadura. Adicionar 900 µL de etanol al 100% y resuspender con micropipeta. Homogenizar la muestra con ayuda de Vórtex Centrifugar los eppendorf a 13.000 rpm por 2 minutos. Descartar el sobrenadante por gravedad.

Centrifugar los eppendorf a 13.000 rpm por 2 minutos. Descartar el sobrenadante con ayuda de micropipeta (Sin tocar el pellet) Dejar secar al aire a temperatura ambiente por al menos 5 minutos. Adicionar 25 µL de ácido fórmico al 70% directo al pellet y pipetear la solución varias veces hasta que se resuspenda.

Adicionar 30 µL de acetonitrilo al 100%. Mezclar con la pipeta dos o tres veces. Centrifugar los eppendorf a 13.000 rpm por 2 minutos. Transferir 1.0 µL del sobrenadante* a la placa del MALDI por duplicado. Dejar secar a temperatura ambiente Depositar 1.0 µL de BTS en un pocillo de la placa MALDI para calibrar la corrida. Dejar secar a temperatura ambiente Cubrir las muestras extraídas y el BTS con 1.0 µL de matriz HCCA (10 mg/ml). Cambiar la punta de la micropipeta si se toca el pocillo de la placa para evitar contaminación.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Dejar secar Cargar la placa MALDI en el espectrómetro de masas y leer.

* El extracto correspondiente al sobrenadante puede conservarse hasta por 5 días a -20ºC

para realizar el montaje. Para esto, transferir el sobrenadante a eppendorf estériles de 1.5 mL.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice J Preparación y montaje del Bacterial Test Standard (BTS – Bruker Daltonik) El BTS contiene un extracto de alfa DH5 de Escherichia coli que representa un perfil peptídico y de proteínas característico de los espectros de masas al analizarse con los sistemas de MALDI Biotyper (Biotyper & Systems, 2015).

Llevar el BTS a temperatura ambiente durante 5 minutos mínimo antes de reconstituirlo. Agregar 50 µL de solvente orgánico (47,5% H2O; 2,5% Ácido trifluoroacético al 100%; 50% Acetonitrilo) al frasco con el liofilizado del BTS y disolver pipeteando mínimo 20 veces. Incubar la solución de BTS por 5 a 10 minutos a temperatura ambiente y pipetear mínimo 20 veces para mezclarlo.

Centrifugar por 10 segundos a 13000 rpm y a temperatura ambiente. Alícuotar de a 5 µL de BTS en eppendorf de 0.5 mL. Almacenar a -20ºC. Para el montaje del BTS en la placa:

Depositar 1 µL de BTS en un pocillo de la placa y dejar secar. Cubrir con 1 µL de HCCA (10 mg/mL) y dejar secar.

Montar las muestras y medir en el espectrofotómetro de masas.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Apéndice K Protocolo de extracción de ADN utilizando el kit MagMaxTM Viral Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit Tomado de: (Applied Biosystems - ThermoFisher Scientific) (AppliedBiosystems, 2020). Precalentar la placa de calentamiento a 65° antes de iniciar con la extracción. Preparar el volumen de etanol 80% necesario para el número de muestras a procesar (Incluir 1 control negativo y 2 adicionales por error pipeteo. Se requiere 750 µL de etanol 80% por muestra.

Preparar la mezcla de perlas magnéticas ( Binding Bead Mix): Dar vórtex a las perlas magnéticas (Total Nucleic Acid Magnetic Beads) para asegurar que queden homogéneas y preparar la mezcla según el número de muestras a procesar (Incluir 1 control negativo y 2 adicionales por error pipeteo). Por muestra se requiere:

Mezclar por inversión y mantener a temperatura ambiente.

Añadir 5 µL de proteinasa K a cada eppendorf con 200 µL de muestra y al eppendorf de control negativo.

Añadir 200 µL de agua libre de nucleasas tipo I al eppendorf control negativo. Invertir la mezcla de perlas magnéticas (Binding Bead Mix) 5 veces para homogeneizar y añadir 275 µL a cada muestra y control negativo.

Componente Volumen por muestra Binding solution

265 µL

Total Nucleic Acid Magnetic Beads

10 µL

Volumen total

275 µL

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Agitar en vórtex la gradilla con las muestras por 2 minutos a 1.050 rpm. Incubar en la placa a 65°C por 5 minutos.

Agitar en vórtex la gradilla con las muestras por 5 minutos a 1.050 rpm. Colocar las muestras en la gradilla magnética por 10 minutos o hasta que las perlas se recolecten.

Figura 11 Muestras en gradilla magnética para recolección de las perlas magnéticas.

Abrir cuidadosamente los eppendorf colocados en la gradilla magnética y descartar el sobrenadante de cada uno evitando mover las perlas.

Quitar los eppendorf de la gradilla magnética, pasarlos a la gradilla plástica y añadir 500 µL de Buffer de lavado a cada muestra y control negativo. Cerrar los eppendorf y agitar en el vórtex por 1 minuto a 1.050 rpm. Colocar los eppendorf en gradilla magnética por 2 minutos o hasta que las perlas se hayan recolectado.

Abrir cuidadosamente los eppendorf colocados en la gradilla magnética y descartar el sobrenadante de cada uno evitando mover las perlas.

Quitar los eppendorf de la gradilla magnética, pasarlos a la gradilla plástica y añadir 500 µL de etanol 80% a cada muestra y control negativo.

Cerrar los eppendorf y agitar en el vórtex por 1 minuto a 1.050 rpm.

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CARACTERIZACIÓN DE CANDIDA SPP. EN PACIENTES DE UCI

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Colocar los eppendorf en gradilla magnética por 2 minutos o hasta que las perlas se hayan recolectado.

Abrir cuidadosamente los eppendorf colocados en la gradilla magnética y descartar el sobrenadante de cada uno evitando mover las perlas. Quitar los eppendorf de la gradilla magnética, pasarlos a la gradilla plástica y añadir 250 µL de etanol 80% a cada muestra y control negativo. Cerrar los eppendorf y agitar en el vórtex por 1 minuto a 1.050 rpm. Colocar los eppendorf en gradilla magnética por 2 minutos o hasta que las perlas se hayan recolectado.

Abrir cuidadosamente los eppendorf colocados en la gradilla magnética y descartar el sobrenadante de cada uno evitando mover las perlas Secar las perlas de las muestras y control negativo agitando en el vortex con la tapa abierta por 2 minutos a 1.050 rpm.

Añadir 50 µL de solución de elución a cada muestra y control negativo. Agitar en vórtex a 1.050 rpm por 5 minutos.

Incubar los eppendorf en la placa a 65° por 10 minutos. Retirar de la placa de calentamiento y colocar en el vórtex a 1.050 rpm por 5 minutos. Colocar los eppendorf en la gradilla magnética por 3 minutos o hasta que aclare completamente y las perlas se encuentren cerca a los imanes. Manteniendo los eppendorf en la gradilla magnética, destapar con cuidado y transferir el eluido (sobrenadante) a eppendorf estériles de 1.5 o 0.5 mL. Guardar los eluidos a -20°C.

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Apéndice L Aval del Comité de ética en investigación CEINCI.

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Cita: Gutiérrez Galvis, María Carolina (2025), Caracterización de especies de Candida aisladas de pacientes adultos en Unidad de Cuidados Intensivos y sus factores asociados a la colonización, Universidad Industrial de Santander, p. N. https://noesis.uis.edu.co/handle/20.500.14071/45153