VERIFICACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA PARA LA VALORACIÓN E
IDENTIFICACIÓN DE HEDERACÓSIDO C EN JARABE DE HEDERA HELIX
BAJO LINEAMIENTOS USP -1224-1225
INFORME FINAL COMO PARTE DE LOS REQUISITOS
PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO
AUTOR:
VALERY JULIANA VILLORINA LONDOÑO
DIRECTOR:
CRISTIAN GABRIEL BURGOS ESPITIA
CODIRECTOR:
SANTOS VANEGAS PEREZ
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
MONTERÍA-CÓRDOBA
2026
VERIFICACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA PARA LA VALORACIÓN E
IDENTIFICACIÓN DE HEDERACÓSIDO C EN JARABE DE HEDERA HÉLIX
BAJO LINEAMIENTOS USP -1224-1225
INFORME FINAL COMO PARTE DE LOS REQUISITOS
PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO
TIPO DE PROPUESTA: PASANTÍAS
AUTOR:
VALERY JULIANA VILLORINA LONDOÑO
DIRECTOR:
CRISTIAN GABRIEL BURGOS ESPITIA
CODIRECTOR:
SANTOS VANEGAS PEREZ
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTANETO DE QUÍMICA
MONTERÍA-CÓRDOBA
2026
DEDICATORIA
Primeramente, dedico este trabajo de grado a mi Dios y a la Virgen María, quienes me guiaron y me dieron fortaleza durante una de la etapa más difícil de mi vida. A mi padre, Jorge Manuel Villorina Baños, quien desde el cielo me ayudó a seguir adelante; gracias por su crianza, su amor y su lealtad hacia nuestra familia.
A las personas que han sido mi orgullo, mi apoyo y mis compañeros de luchas en esta vida, y a quienes más he querido: Lidis Londoño Agudelo, Bairon Villorina Londoño, Milvia Ailet Londoño Agudelo, Yovadis Londoño Agudelo y Isabel Gertrudis Londoño Agudelo.
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer primeramente a mi familia por acompañarme en esta etapa de mi vida. En segundo lugar, a la Universidad de Córdoba y a los docentes Cristian Burgos Espitian, Antonio Mercado, Jailes Beltrán, Alberto Angulo y José Pinedo, quienes contribuyeron significativamente a mi formación académica y profesional.
Por último, agradezco a mis amigos de la Universidad, quienes estuvieron presentes durante todo este proceso, brindándome su apoyo y compañía. Asimismo, expreso mi gratitud a la empresa (Servicios de Análisis Farmacéutico)- SAF por permitirme prestar mis servicios como profesional en formación y adquirir nuevos conocimientos que fortalecieron mi desarrollo profesional.
INDICE
1.
INTRODUCCÍON ....................................................................................................9
2.
OBJETIVOS ........................................................................................................... 11
2.1
Objetivo general ............................................................................................... 11
2.2
Objetivos específicos ........................................................................................ 11
3.
MARCO TEORICO ................................................................................................ 11
3.1
HEDERA HÉLIX L. (HIEDRA) Y SUS USOS TERAPÉUTICOS .................... 11
3.2
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) ................ 14
3.3
ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC / UPLC) PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE SAPONINAS. ....................................................................... 14
3.4
IMPORTANCIA DE LA ESTANDARIZACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD
EN EXTRACTOS VEGETALES ................................................................................ 15
3.5
PRODUCTO DE DEGRADACIÓN: ................................................................ 15
3.6
LINEALIDAD: ................................................................................................ 15
3.7
PRECISIÓN: .................................................................................................... 15
3.8
EXACTITUD: .................................................................................................. 16
3.9
SELECTIVIDAD O ESPECIFICIDAD: ............................................................ 16 3.10 ROBUSTEZ: .................................................................................................... 17 3.11 PLACEBO: ...................................................................................................... 17
4.
METODOLOGIA ................................................................................................... 17
4.1
IMPLEMENTACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR HPLC ..................... 17
4.2
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS ........................................................ 17
4.3
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOs...................................................... 19
4.3.1.
Equipos y materiales .................................................................................. 19
4.3.2.
Reactivos y soluciones ............................................................................... 20
4.4
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ................................................................ 20
4.5
VERIFICACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ............................................... 21
4.5.1.
Aptitud del sistema .................................................................................... 21
4.5.2.
Selectividad del método ............................................................................. 22
4.5.3.
Linealidad ................................................................................................. 24
4.5.4.
Precisión ................................................................................................... 25
4.5.5.
Exactitud ................................................................................................... 26
4.5.6.
Robustez ................................................................................................... 26
4.5.7.
Estimación de la incertidumbre de medición ............................................... 27
5.
RESULTADO Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS ....................................... 29
5.1
APTITUD DEL SISTEMA ............................................................................... 29
5.2
SELECTIVIDAD ............................................................................................. 32
5.2.1.
Condiciones normales ................................................................................ 32
5.2.2.
Condiciones extremas (placebo) ................................................................. 33
5.2.3.
Condiciones extremas (placebo cargado) .................................................... 35
5.3
LINEALIDAD ................................................................................................. 39
5.3.1.
LINEALIDAD DEL METODO ................................................................. 39
5.4
PRECISIÓN (SISTEMA, METODO Y INTERMEDIA) ................................... 42
5.5
ROBUSTEZ DEL METODO............................................................................ 44
5.6
EXACTITUD DEL METODO ......................................................................... 46
6.
CONCLUSIÓNES .................................................................................................. 54
7.
BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................... 55
ABSTRACT
Hedera helix L. is one of the most popular over-the-counter formulations for effectively relieving respiratory disorders in adults and children. This is because it contains secondary metabolites that are used as active ingredients in the manufacture of various medicinal products. The objective of this study was to verify the analytical methodology for the assay and identification of hederacoside C in commercial Hedera helix syrup by high-performance liquid chromatography (HPLC). For this purpose, a water:methanol mobile phase (38:62) was used with a flow rate of 1.3 mL/min, a C18 column (150 mm x 4.6 mm - 5 µm), and a UV-Vis detector (L-7400) at a wavelength of 205 nm.
Evaluating various parameters (including selectivity, linearity, precision, accuracy, and robustness) according to the requirements of the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidelines and USP chapters <1225> “Validation of Pharmacopoeial Procedures” and <1224> “Transfer of Analytical Procedures,” the method demonstrated adequate linearity (r² ≥ 0.98), precision (%RSD ≤ 2%), and accuracy (98–102%). No interferences from the matrix or degradation products were observed. Therefore, it was concluded that the method is reliable and suitable for use in quality control of the finished product.
RESUMEN
Hedera hélix L. es una de las formulaciones de venta libre más populares para aliviar eficazmente trastornos respiratorios en adultos y niños. Debido a que contienen metabolitos segundarios que se utilizan como principio activo para fabricar diversos productos medicinales. El presente trabajo tuvo como objetivo verificar la metodología analítica para la valoración e identificación de hederacósido C en jarabe comercial de Hedera hélix por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC). Para ello, se utilizó una fase móvil de agua: metanol con una proporción (38:62) con flujo de 1,3 mL/min, la columna empleada (C18, 150mm x 4,6mm -5µm) y un detector UV-Vis (L-7400) a una longitud de onda de 205nm.
Evaluando distintos parámetros (entre ellos selectividad, linealidad, precesión, exactitud y robustez) de acuerdo con los requisitos exigidos por las guías internacionales “Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de los Productos Farmacéuticos para uso humano (ICH)” y los capítulos <1225> “Validación del procedimiento de farmacopeicos” y <1224> “transferencia de procedimientos analíticos” de la USP. El método mostró adecuada linealidad (r2≥0,98), precisión (%RSD≤ 2%) y exactitud (98-102%). No se evidenció la presencia de interferencias originadas por la matriz ni los productos de degradación. Así, se concluyó que el método es confiable y adecuado para su aplicación en el control de calidad del producto terminado.
1. INTRODUCCÍON
Las plantas medicinales representan una fuente importante para el descubrimiento y desarrollo de productos farmacéuticos debido a la presencia de una amplia diversidad de compuestos bioactivos o metabolitos secundarios. Estos metabolitos son sintetizados por las plantas como respuesta a diferentes factores ambientales y cumplen funciones relacionadas con mecanismos de defensa, adaptación y protección frente a agentes externos. Entre los principales grupos de metabolitos con interés farmacológico se encuentran los compuestos fenólicos, flavonoides y saponinas, los cuales han demostrado diversas actividades biológicas de importancia terapéutica.
Dentro de este grupo, las saponinas triterpenoides constituyen una familia de compuestos ampliamente estudiados debido a sus propiedades farmacológicas. En particular, Hedera helix L. (hiedra común) contiene saponinas triterpénicas que han sido utilizadas tradicionalmente en el tratamiento de afecciones respiratorias. Actualmente, los extractos obtenidos de esta especie vegetal son empleados en diferentes formulaciones farmacéuticas destinadas al alivio de enfermedades respiratorias inflamatorias y episodios de tos, debido principalmente a sus propiedades broncodilatadoras, secretolíticas, antibacterianas y espasmolíticas (Shoaib Hussain, 2024).
Hedera helix L. constituye una de las preparaciones fitoterapéuticas de venta libre más utilizadas para el manejo de trastornos respiratorios tanto en adultos como en niños, debido a la presencia de componentes activos característicos como α-hederina y hederacósido C (Aya A. Shokry, 2025). Particularmente, el hederacósido C es considerado uno de los principales marcadores químicos asociados con la calidad de los productos derivados de hojas de hiedra, debido a su relación con la estandarización de extractos vegetales empleados con fines terapéuticos.
Los extractos líquidos y secos obtenidos a partir de hojas de Hedera helix son utilizados en la elaboración de diferentes formas farmacéuticas, incluyendo jarabes, tabletas y pastillas. Generalmente, estos extractos son obtenidos mediante procesos hidroalcohólicos que permiten la extracción de los metabolitos de interés, seguido de procesos de concentración o secado para obtener productos estables. En este contexto, la calidad de la
materia prima vegetal representa un factor crítico para garantizar la obtención de extractos estandarizados a escala industrial. Para hojas de hiedra empleadas como materia prima farmacéutica, se ha establecido que el contenido de hederacósido C debe ser como mínimo del 3,0 %, mientras que los extractos secos destinados a productos medicinales deben contener concentraciones cercanas o superiores al 10,0 %. Por esta razón, la determinación cuantitativa de este metabolito constituye un criterio fundamental para asegurar la calidad y reproducibilidad de los productos derivados de Hedera helix (Shoaib Hussain, 2024). Diversas farmacopeas y estudios científicos han reportado metodologías analíticas basadas en cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) y cromatografía líquida de ultra alta eficiencia (UPLC), acopladas a sistemas de detección UV y espectrometría de masas (MS), para la identificación y cuantificación de hederacósido C de manera individual o en combinación con otras saponinas presentes en extractos vegetales (Mohamed A. Korany, 2024). Sin embargo, antes de implementar estos métodos dentro de un entorno de control de calidad farmacéutico, es necesario demostrar mediante procesos de validación que la metodología analítica proporciona resultados confiables, reproducibles y adecuados para el propósito establecido.
La verificación de métodos analíticos permite evaluar experimentalmente parámetros críticos de desempeño como selectividad, linealidad, precisión, exactitud, robustez y aptitud del sistema, garantizando que el procedimiento cumpla con los requisitos regulatorios nacionales e internacionales. En este sentido, organismos como el Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de los Productos Farmacéuticos para Uso Humano (ICH) y la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) establecen criterios específicos para demostrar la confiabilidad de los métodos utilizados en el análisis de principios activos y productos farmacéuticos.
En este trabajo se realizó la validación de una metodología analítica mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para la valoración e identificación de hederacósido C en un producto terminado tipo jarabe de Hedera helix. El estudio tuvo como finalidad establecer un método confiable para su aplicación en el control de calidad del medicamento, asegurando el cumplimiento de los criterios establecidos por las guías ICH y los capítulos generales USP <1225> “Validación de procedimientos farmacopeicos” y USP
<1224> “Transferencia de procedimientos analíticos”. De acuerdo con estos lineamientos, se evaluaron los parámetros de aptitud del sistema, selectividad, linealidad, precisión, exactitud y robustez, con el propósito de confirmar la idoneidad del método cromatográfico propuesto para la cuantificación del compuesto activo.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
• Verificar la metodología analítica para la valoración e identificación de
hederacósido C en jarabe comercial de Hedera hélix mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), evaluando los parámetros de desempeño analítico de acuerdo con los lineamientos establecidos en la norma compendial USP 1224 – 1225.
2.2 Objetivos específicos
• Estandarizar la técnica de análisis por cromatografía liquida de alta eficiencia
(HPLC) para para la valoración e identificación de hederacósido C en jarabe comercial de Hedera hélix.
• Evaluar los parámetros de calidad analítica del método (Linealidad, precisión,
exactitud, robustez e incertidumbre).
3. MARCO TEORICO
3.1 HEDERA HÉLIX L. (HIEDRA) Y SUS USOS TERAPÉUTICOS
Hedera helix L., miembro de la familia Araliaceae. Es una planta rastrera y trepadora, caracterizada por tener sus ramas flexibles posee unas raicillas que se aferran al suelo y árboles. Sus hojas lobuladas, alternas, son brillantes, correosas y llegan a poseer de 3 a 5 lóbulos en sus ramas infértiles. (33-40) Sus flores son de color amarillo o verde. Al madurar, el fruto pasa de un color violeta – azulado y se agrupan en pedúnculos de forma regular y al mismo nivel. El fruto de esta planta son unas bayas de color oscuro violeta - azulado, las cuales tienen en su interior de 3 a 5 semillas envueltas en una sustancia jugosa.
Figura 1. Hojas de Hederá hélix L. (Hiedra Común) Hedera helix L. está clasificada como una planta convencional utilizada como producto medicinal para la cura y prevención de inflamaciones e infecciones del tracto respiratorio superior debido a sus efectos secretolíticos y broncolíticos (Aya A. Shokry R. A.-S., 2022). Estudios fitoquímicos sobre H. hélix han revelado que la planta contiene diferentes grupos secundarios de metabolitos, principalmente saponinas triterpenas como hederacósido C, E, F, α-hederina, hederagenina, flavonoides como kaempferol, quercetina, rutina y kaempferol-3-rutinósido, ácidos fenólicos como el ácido clorogénico, ácido rosmarinico y ácido cafeico. Los cuales se utilizan en el tratamiento de la tos, la bronquitis, la gota, el reumatismo, la diabetes, las enfermedades renales, el tratamiento de heridas y quemaduras. Mientras que H. colchica se utiliza como fármaco broncoesmolítico, secretolítico y antiinflamatorio en la medicina tradicional (İçim Gökkaya a, 2024).
Figura 2: Estructura base de saponina.
Fuente: Chemsketch.
Un estudio de “perfil fitoquímico” de hojas de H. hélix recolectadas en distintas regiones de Europa mostró que el saponósido predominante es hederacoside C, aunque la concentración de flavonoides, ácidos fenólicos y antioxidantes varía considerablemente entre muestras con diferencias atribuibles al sitio geográfico, clima y posiblemente al genotipo (Bezruk, 2020). Los compuestos biológicamente activos responsables del uso médico de H. hélix son las saponinas triterpenas . En particular, α-hederina es una de las saponinas triterpenas que tiene actividad β2-adrenérgica y que proporciona en su mayoría todos los efectos de la hoja de H. helix). Según los requisitos de la Farmacopea Europea, la calidad de la hoja de hiedra está determinada por la hederacósido C. Además, las plantas contienen mezclas fitoquímicas complejas que comprenden una multitud de sustancias diferentes, por lo que suele haber interacción entre componentes. Así, el efecto farmacológico de una planta puede estar causado por la presencia de muchos compuestos activos que también pueden mostrar acción aditiva o sinérgica (Bezruk, 2020).
Sin embargo, una sola planta medicinal podría contener muchos componentes diferentes y cada una de esas sustancias puede tener algún efecto terapéutico, por lo que normalmente se observa la combinación de sus actividades. En consecuencia, la calidad depende de la composición fitoquímica. Por lo que la determinación cualitativa y cuantitativa y la identificación de marcadores fitoquímicos son esenciales para la estandarización de materiales herbales y la caracterización integral de fármacos herbales (Bezruk, 2020).
3.2 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC)
La cromatografía liquida es muy importante porque la mayoría de los compuestos no son lo suficientemente volátiles para analizarse por cromatografía de gas. En HPLC se usa alta presión para forzar el solvente a pasar a través de una columna que contiene unas partículas muy finas que dan alta resolución a las separaciones. El sistema HPLC involucra: 1. Un sistema de entrega de solventes. 2. Una válvula de inyección de la muestra. 3. Una columna que resiste alta presión. 4. Un detector. 5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa un sistema para el control de la temperatura. (Ceballos, 2015)
3.3 ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC / UPLC)
PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SAPONINAS.
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y sus variantes (HPLC-DAD, UPLC- MS/MS) son técnicas establecidas y ampliamente utilizadas para la separación y la identificación de compuestos en matrices complejas como extractos vegetales (Kim, 2014), (Korany, 2024).
Un trabajo relevante describió un método por HPLC-DAD para determinar simultáneamente seis compuestos en extractos de hoja de hiedra incluyendo hederacoside C y α-hederin, validando parámetros como especificidad, linealidad (r² > 0.9999), precisión (RSD < 0.36 %) y exactitud. Adicionalmente, estudios más recientes han empleado UPLC-ESI–MS/MS para identificar con mayor sensibilidad y rapidez saponinas en H. hélix, lo que mejora la detección y cuantificación, incluso en concentraciones bajas (Mohamed A. Korany, 2024). Estos métodos ofrecen una base técnica sólida para la estandarización y control de calidad de extractos, garantizando que los niveles de compuestos activos cumplan con los requisitos para su uso farmacéutico.
3.4 IMPORTANCIA DE LA ESTANDARIZACIÓN Y CONTROL DE
CALIDAD EN EXTRACTOS VEGETALES
Dado que la composición química de las plantas puede variar por múltiples factores origen geográfico, condiciones ambientales, época de recolección, método de extracción, es fundamental estandarizar los extractos mediante marcadores químicos precisos. En el caso de H. hélix, hederacoside C es considerado el marcador de referencia más confiable (Bezruk,
2020).
La identificación precisa mediante métodos cromatográficos validados (HPLC / UPLC) resulta esencial para garantizar la identidad, potencia y pureza del producto final y con ello, su seguridad y eficacia terapéutica (Kim, 2014).
Además, la estandarización permite comparar lotes, evaluar materia prima, asegurar reproducibilidad entre desarrollos farmacéuticos y cumplir con regulaciones y mejores prácticas de calidad.
3.5 PRODUCTO DE DEGRADACIÓN:
Posibles compuestos que se pueden formar a partir de la molécula original del activo por reacciones químicas (USP-NF <1225> América, 2026).
3.6 LINEALIDAD:
Es la capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sean directamente, o por medio de una transformación matemática bien definida, a la concentración de analito en muestras dentro de un intervalo dado. La linealidad se refiere a la relación entre la concentración y la medida de valoración (USP-NF <1225> América,
2026).
3.7 PRECISIÓN:
Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. La
precisión de un método analítico generalmente se expresa como la desviación estándar relativa (coeficiente de variación) de una serie de mediciones. La precisión puede ser una medida del grado de repetibilidad del método analítico bajo condiciones operativas normales. La repetibilidad se refiere al uso del procedimiento analítico dentro de un laboratorio en un periodo corto en el que un mismo analista hace uso de un mismo equipo. La precisión puede ser considerada a tres niveles: (precisión bajo las mismas condiciones operativas durante un corto periodo de tiempo. Precisión intermedia (dentro de las variaciones- días diferentes, analistas diferentes o equipos diferentes) y reproducibilidad (precisión entre laboratorios) (USP-NF <1225> América, 2026).
3.8 EXACTITUD:
El grado de concordancia de los resultados del ensayo con el valor real o la proximidad al valor real de los resultados obtenidos por el procedimiento. Es la proximidad entre los resultados obtenidos y el valor verdadero.
Nota: Se establece normalmente en muestras del material a analizar que han sido preparadas con exactitud cuantitativa. La exactitud debe establecerse a través del intervalo especificado del procedimiento analítico. Se acepta por lo general el uso de un placebo que contenga cantidades agregadas o concentraciones conocidas de una sustancia de referencia (USP-NF <1225> América, 2026).
3.9 SELECTIVIDAD O ESPECIFICIDAD:
Los documentos del “Consejo Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos de los Productos Farmacéuticos para uso humano” (ICH) definen especificidad como la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, tales como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. Propiedad del método de producir una señal medible debida solo a la presencia del analito, libre de interferencia de otros componentes, en la matriz de la muestra (USP-NF <1225> América, 2026).
3.10 ROBUSTEZ:
Corresponde a los estudios que indican el grado de confiabilidad de la técnica o ensayo ante cambios de variables comunes Ejemplo: ligeras diferencias operativas, de equipos, analistas, laboratorios, Columnas (USP-NF <1225> América, 2026).
3.11 PLACEBO:
Mezcla homogénea de los excipientes de un producto sin el (los) principio(s) activo(s) con las mismas proporciones declaradas en la formulación de este (USP-NF <1225> América,
2026).
4. METODOLOGIA
4.1 IMPLEMENTACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO POR HPLC
La metodología analítica para la valoración e identificación de hederacósido C en jarabe comercial de Hedera hélix fue implementada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), siguiendo los lineamientos establecidos para la transferencia y verificación de procedimientos analíticos descritos en la USP -1224. El procedimiento cromatográfico se aplicó con el propósito de confirmar la capacidad del método para identificar y cuantificar selectivamente el hederacósido C presente en una matriz farmacéutica tipo jarabe, evaluando los parámetros de desempeño requeridos para demostrar su confiabilidad analítica.
4.2 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
La implementación del método analítico para la valoración e identificación de hederacósido C en jarabe comercial de Hedera helix se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC), empleando condiciones cromatográficas previamente establecidas en el procedimiento analítico de referencia. La verificación de estas condiciones permitió confirmar la capacidad del método para separar, identificar y cuantificar el analito de interés dentro de una matriz farmacéutica compleja.
La separación cromatográfica se llevó a cabo utilizando una columna de fase estacionaria C18 (150 mm × 4,6 mm; tamaño de partícula 5 µm), seleccionada debido a su capacidad de retención y separación de compuestos de naturaleza triterpénica como el hederacósido C. La detección del compuesto se realizó mediante detector UV-Vis a una longitud de onda de 205 nm, correspondiente a una región adecuada para el seguimiento cromatográfico del analito. El análisis se desarrolló bajo modo isocrático utilizando como fase móvil una mezcla de agua grado HPLC grado HPLC en proporción 38:62 (v/v). Las condiciones operacionales establecidas fueron un flujo de fase móvil de 1,3 mL/min y temperatura de columna controlada a 35 °C, con el propósito de favorecer la reproducibilidad del tiempo de retención, la estabilidad de la señal cromatográfica y una adecuada resolución del pico correspondiente al hederacósido C.
El tiempo total de corrida cromatográfica fue de 12 minutos, permitiendo la identificación del analito mediante la comparación del tiempo de retención obtenido en las muestras frente al estándar certificado de hederacósido C. La valoración cuantitativa se realizó mediante la relación entre la respuesta cromatográfica del analito y las soluciones de referencia preparadas bajo las mismas condiciones analíticas.
La idoneidad de las condiciones cromatográficas implementadas fue verificada mediante la evaluación de parámetros como tiempo de retención, área del pico, repetibilidad de las inyecciones, estabilidad de la respuesta instrumental y ausencia de interferencias provenientes de la matriz del jarabe, asegurando la confiabilidad del método para su aplicación en el control de calidad del producto terminado.
Figura 3. Equipo HPLC Merck Hitachi D-7000, Código: HPLCL-021-SAF
4.3 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Para la verificación de la metodología analítica se emplearon equipos, materiales y reactivos adecuados para el análisis cromatográfico por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), garantizando las condiciones requeridas para la preparación de muestras, estándares y evaluación de los parámetros analíticos del método.
4.3.1. Equipos y materiales
El análisis cromatográfico se realizó empleando un sistema de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) equipado con una columna de fase reversa C18 (150 mm × 4,6 mm; tamaño de partícula 5 µm, Phenomenex). Para la preparación y tratamiento de muestras se utilizaron los siguientes equipos y materiales: • Sistema de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). • Columna cromatográfica C18 (150 mm × 4,6 mm; 5 µm, Phenomenex). • Baño de ultrasonido.
• Balanza analítica.
• Balanza semimicroanalítica.
• Sistema de filtración al vacío.
• Bomba de vacío.
• Filtros de membrana de nylon de 0,45 µm. • Centrífuga.
• Baño María.
• Cabina de extracción.
• Cámara de revelado.
• Material volumétrico certificado: o Matraces aforados de 10 y 25 mL. o Probetas de 100 mL.
o Pipetas graduadas de 10 mL.
• Erlenmeyer con cuello esmerilado. • Varillas para sistema de reflujo. • Espátulas y material auxiliar de laboratorio.
4.3.2. Reactivos y soluciones
Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico o cromatográfico según los requerimientos del ensayo. Para la preparación de la fase móvil, estándares y muestras se emplearon los siguientes reactivos:
• Agua grado HPLC.
• Metanol grado HPLC.
• Estándar certificado de hederacósido C (lote: 1001061, Sigma-Aldrich). • Extracto de Hedera helix.
• Muestras comerciales de jarabe a base de Hedera helix.
• Placebo de formulación.
• Ácido clorhídrico (HCl).
• Hidróxido de sodio (NaOH).
• Peróxido de hidrógeno (H₂O₂) al 30 %.
Los reactivos ácido clorhídrico, hidróxido de sodio y peróxido de hidrógeno fueron utilizados para los estudios de degradación forzada durante la evaluación de la selectividad/especificidad del método analítico.
4.4 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
Las soluciones requeridas para la implementación y verificación del método analítico fueron preparadas siguiendo las condiciones establecidas en el protocolo “Verificación del método de análisis de valoración por HPLC de hederacoside c en el producto terminado jarabe de Hedera helix” (DCC-PTF-255) para la valoración de hederacósido C en jarabe de Hedera helix mediante HPLC propuesto en la empresa de servicios de análisis farmacéuticos - SAF. Inicialmente, se preparó la fase móvil empleando una mezcla de agua grado HPLC y metanol en proporción 38:62 (v/v), la cual fue homogenizada y acondicionada antes de su utilización en el sistema cromatográfico.
Para la preparación de la solución estándar, se utilizó hederacósido C como sustancia de referencia certificada, realizando las diluciones correspondientes hasta obtener la concentración de trabajo establecida en el método analítico. Esta solución fue utilizada para evaluar la respuesta cromatográfica, aptitud del sistema y construcción de curvas de calibración.
La solución muestra fue preparada a partir del producto terminado tipo jarabe de Hedera helix, realizando el proceso de dilución correspondiente con el diluyente establecido, garantizando una concentración adecuada del analito dentro del intervalo de trabajo del método.
Adicionalmente, se prepararon soluciones placebo constituidas por los excipientes presentes en la formulación sin la incorporación del principio activo, con el propósito de evaluar la selectividad del método y determinar posibles interferencias asociadas a la matriz del producto.
Previo al análisis cromatográfico, todas las soluciones fueron filtradas empleando membranas de nylon de 0,45 µm para eliminar partículas suspendidas y asegurar una adecuada separación cromatográfica durante la determinación de hederacósido C por HPLC.
4.5 VERIFICACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO
La verificación del método HPLC se realizó mediante la evaluación experimental de los parámetros críticos de desempeño analítico establecidos en el protocolo “Verificación del método de análisis de valoración por HPLC de hederacósido C en el producto terminado jarabe de Hedera helix” (DCC-PTF-255) y de acuerdo con los lineamientos USP aplicables.
4.5.1. Aptitud del sistema
La aptitud del sistema cromatográfico fue evaluada con el propósito de verificar el adecuado funcionamiento del equipo HPLC y demostrar que las condiciones analíticas establecidas permiten obtener una respuesta confiable y reproducible para la identificación y valoración de hederacósido C.
Se evaluó inicialmente la aptitud del sistema cromatográfico mediante inyecciones repetidas del estándar de hederacósido C, verificando la estabilidad instrumental y reproducibilidad de la respuesta analítica. La solución estándar fue inyectada repetidamente en el sistema HPLC bajo las condiciones cromatográficas establecidas, evaluando la reproducibilidad de la respuesta instrumental mediante parámetros como tiempo de retención, área del pico cromatográfico y desviación estándar relativa (%RSD) de las inyecciones.
Para la evaluación de este parámetro se preparó una solución estándar de referencia de hederacósido C a una concentración final de 120 µg/mL. Inicialmente, se pesaron exactamente 2,4 mg del estándar de hederacósido C y se transfirieron a un matraz aforado de
10 mL. Posteriormente, se adicionaron aproximadamente 3 mL de diluyente y la solución fue
sometida a ultrasonido para favorecer la completa disolución del analito. Finalmente, se llevó a volumen con el mismo diluyente y se homogenizó.
A partir de esta solución inicial, se tomó una alícuota de 5 mL, la cual fue transferida a un matraz aforado de 10 mL y completada hasta volumen final con diluyente. Previo al análisis cromatográfico, la solución obtenida fue filtrada mediante una membrana de nylon de 0,45 µm.
4.5.2. Selectividad del método
La selectividad del método analítico fue evaluada para demostrar la capacidad del procedimiento cromatográfico de identificar y valorar específicamente el hederacósido C en presencia de otros componentes presentes en la formulación farmacéutica, tales como excipientes, impurezas y posibles productos de degradación. Este parámetro permitió verificar que la señal cromatográfica obtenida corresponde únicamente al analito de interés, sin interferencias en su tiempo de retención.
Para establecer la selectividad del método HPLC se realizaron análisis bajo condiciones normales y condiciones extremas mediante estudios de degradación forzada, permitiendo evaluar el comportamiento del hederacósido C frente a diferentes factores de estrés químico y físico.
Condiciones normales La selectividad bajo condiciones normales fue determinada mediante la comparación de los perfiles cromatográficos obtenidos para la solución estándar de hederacósido C, muestra de jarabe de Hedera helix y solución placebo correspondiente a los excipientes de la formulación.
La solución estándar de hederacósido C fue preparada a una concentración de 120 µg/mL e inyectada por duplicado en el sistema cromatográfico. De igual manera, se evaluó la solución placebo preparada mediante la transferencia de 4,3 g de placebo a un matraz aforado de 25
mL, adicionando aproximadamente 15 mL de diluyente, seguido de agitación durante un minuto y ajuste hasta volumen final.
Posteriormente, la solución fue homogenizada, centrifugada durante 10 minutos y filtrada a través de una membrana de 0,45 µm antes del análisis por HPLC. Los cromatogramas obtenidos fueron comparados con el propósito de verificar la ausencia de señales provenientes de la matriz que pudieran interferir con el tiempo de retención correspondiente al hederacósido C.
Condiciones extremas (degradación forzada) La selectividad bajo condiciones extremas fue evaluada mediante estudios de degradación forzada utilizando muestras de placebo cargadas con Hedera helix, con el objetivo de determinar la capacidad del método para identificar el hederacósido C en presencia de posibles productos de degradación.
Para los estudios de hidrólisis ácida, hidrólisis básica y oxidación, se pesaron aproximadamente 4,3 g de placebo cargado con Hedera helix y se transfirieron a matraces Erlenmeyer. Posteriormente, se adicionó 1 mL del agente degradante correspondiente: ácido clorhídrico (HCl 0,1 N), hidróxido de sodio (NaOH 0,1 N) o peróxido de hidrógeno (H₂O₂ al 30 %), junto con 15 mL de diluyente. Para la evaluación de degradación térmica se adicionó únicamente el diluyente.
Las muestras sometidas a hidrólisis ácida, básica, oxidativa y térmica fueron mantenidas bajo reflujo durante un periodo mínimo de tres horas. Finalizado este tiempo, las soluciones fueron enfriadas a temperatura ambiente, transferidas a matraces aforados de 25 mL y llevadas a volumen con diluyente.
Cada preparación fue homogenizada durante un minuto, centrifugada durante 10 minutos y posteriormente filtrada empleando membranas de 0,45 µm antes de la inyección cromatográfica.
Para la evaluación de fotólisis, la muestra fue preparada con diluyente y expuesta a radiación ultravioleta (UV) a 365 nm durante un tiempo mínimo de tres horas. Posteriormente, se realizó el mismo procedimiento de centrifugación y filtración descrito anteriormente.
Finalmente, las soluciones obtenidas fueron analizadas mediante HPLC a una concentración equivalente de 120 µg/mL de hederacósido C, comparando los perfiles cromatográficos con el estándar de referencia para confirmar la ausencia de interferencias y la capacidad indicadora de estabilidad del método.
4.5.3. Linealidad
La linealidad fue evaluada mediante soluciones de hederacósido C preparadas a diferentes niveles de concentración, estableciendo la relación entre concentración del analito y respuesta cromatográfica mediante regresión lineal.
Para la evaluación de este parámetro se estableció un intervalo de trabajo comprendido entre el 80 % y el 120 % respecto a la concentración nominal del método (120 µg/mL). Se prepararon soluciones estándar de hederacósido C en cinco niveles de concentración correspondientes al 80 %, 90 %, 100 %, 110 % y 120 %, realizando tres preparaciones independientes para cada nivel con el fin de evaluar la consistencia de la respuesta analítica. Las soluciones estándar fueron preparadas mediante pesada exacta de la sustancia de referencia de hederacósido C y posterior transferencia a matraces aforados de 10 mL. Inicialmente, el estándar fue disuelto con aproximadamente 3 mL de diluyente y sometido a ultrasonido durante 15 minutos (10 RPM) para garantizar la completa solubilización del analito. Posteriormente, las soluciones fueron llevadas a volumen final con el mismo diluyente y homogenizadas.
A partir de las soluciones preparadas se realizaron las diluciones correspondientes hasta obtener concentraciones finales equivalentes a 96, 108, 120, 132 y 144 µg/mL de hederacósido C. Cada nivel de concentración fue analizado mediante HPLC bajo las condiciones cromatográficas establecidas.
La curva de calibración fue construida relacionando la concentración del analito frente al área cromatográfica obtenida. La linealidad fue determinada mediante análisis de regresión lineal, evaluando parámetros estadísticos como la ecuación de la recta, pendiente, intercepto y coeficiente de correlación (r²), con el propósito de confirmar la proporcionalidad de la respuesta analítica dentro del intervalo evaluado.
4.5.4. Precisión
La precisión fue determinada mediante estudios de repetibilidad del sistema, repetibilidad del método y precisión intermedia, expresando la variabilidad de los resultados mediante la desviación estándar relativa (%RSD).
Repetibilidad instrumental La precisión del sistema cromatográfico fue evaluada mediante el análisis consecutivo de seis inyecciones de una solución estándar de hederacósido C preparada a la concentración nominal del método (120 µg/mL).
Las respuestas cromatográficas obtenidas fueron comparadas mediante el área del pico correspondiente al hederacósido C, determinando la variabilidad instrumental expresada como porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD).
Repetibilidad La repetibilidad del método fue determinada mediante la preparación independiente de seis muestras del producto terminado tipo jarabe de Hedera hélix a la concentración nominal establecida del método (120 µg/mL de hederacósido C).
Cada preparación fue analizada bajo las mismas condiciones cromatográficas por un mismo analista, evaluando la capacidad del procedimiento para generar resultados reproducibles durante las etapas de preparación de muestra e inyección cromatográfica. El procedimiento fue repetido por un segundo analista durante el mismo día y bajo las mismas condiciones experimentales, con el propósito de comparar la variabilidad asociada al proceso analítico.
Precisión intermedia (reproducibilidad) La precisión intermedia fue evaluada considerando posibles variaciones asociadas al análisis rutinario del método, mediante la participación de dos analistas diferentes y la ejecución del procedimiento en días diferentes.
Para cada evaluación se prepararon soluciones estándar y soluciones muestra de hederacósido C a una concentración de 120 µg/mL. Las preparaciones fueron realizadas por duplicado y cada solución fue inyectada por triplicado en el sistema cromatográfico.
4.5.5. Exactitud
La exactitud del método fue evaluada mediante estudios de recuperación utilizando muestras enriquecidas con concentraciones conocidas de hederacósido C, verificando la proximidad entre los valores obtenidos y los valores esperados. El método se considera exacto cuando los porcentajes de recuperación obtenidos se encuentran dentro del intervalo establecido para el método y la variabilidad entre las determinaciones presenta una desviación estándar relativa (%RSD) dentro del límite aceptado (≤ 2 %).
El parámetro se realizó mediante la preparación de muestras enriquecidas con cantidades conocidas del estándar de referencia de hederacósido C, evaluando tres niveles de concentración dentro del intervalo de trabajo del método: nivel bajo (80 %), nivel nominal (100 %) y nivel alto (120 %), equivalentes a concentraciones finales de 96 µg/mL, 120 µg/mL y 144 µg/mL, respectivamente.
Para cada nivel de concentración se prepararon tres muestras independientes, obteniéndose un total de nueve determinaciones. Las soluciones preparadas fueron procesadas siguiendo el procedimiento analítico establecido y posteriormente analizadas mediante HPLC bajo las condiciones cromatográficas definidas para el método.
La cuantificación del hederacósido C recuperado se realizó mediante comparación de la respuesta cromatográfica obtenida frente a una solución estándar de referencia preparada a la concentración nominal de trabajo (120 µg/mL).
4.5.6. Robustez
La robustez se determinó evaluando el efecto de pequeñas modificaciones controladas en las condiciones cromatográficas sobre la respuesta del método, con el fin de establecer su confiabilidad frente a variaciones normales de operación.
Para la evaluación de este parámetro se prepararon soluciones estándar de hederacósido C y soluciones muestra de jarabe de Hedera hélix bajo las condiciones establecidas en el procedimiento analítico. Posteriormente, dichas soluciones fueron analizadas modificando
individualmente algunos parámetros cromatográficos considerados críticos para el desempeño del método.
Las variaciones evaluadas correspondieron a cambios controlados en el flujo de la fase móvil (1,2 mL/min), temperatura de la columna (30 °C), volumen de inyección (18 µL) y cambio de equipo cromatográfico, con el fin de determinar la influencia de estas modificaciones sobre la respuesta analítica del hederacósido C.
Los resultados obtenidos bajo cada condición modificada fueron comparados con las condiciones iniciales del método, evaluando posibles cambios en parámetros cromatográficos como tiempo de retención, área del pico, respuesta analítica y concentración determinada del analito. La robustez fue establecida mediante el análisis de la variabilidad de los resultados expresada como desviación estándar relativa (%RSD), verificando que las modificaciones realizadas no afectaran significativamente la identificación y valoración del hederacósido C mediante HPLC.
4.5.7. Estimación de la incertidumbre de medición
La incertidumbre asociada a la determinación de hederacósido C mediante HPLC fue estimada considerando las principales fuentes de variabilidad presentes durante el procedimiento analítico, siguiendo un enfoque basado en la combinación de componentes individuales de incertidumbre.
Inicialmente, se identificaron las fuentes que pueden afectar el resultado final de cuantificación del analito, incluyendo la preparación de soluciones estándar y muestras, pesada del estándar de referencia, material volumétrico empleado, pureza del estándar certificado, precisión del método y recuperación obtenida durante la evaluación de exactitud (Figura 4).
Cada componente de incertidumbre fue expresado como incertidumbre estándar relativa (uᵣ) y posteriormente combinado mediante la siguiente ecuación:
𝑢𝑐= √𝑢1
2 + 𝑢2
2 + 𝑢3
2 + ⋯+ 𝑢𝑛2
Donde:
• uc = incertidumbre estándar combinada.
• u1, u2, un = contribuciones individuales de incertidumbre asociadas al método analítico.
La incertidumbre expandida (U) fue calculada aplicando un factor de cobertura (k=2), correspondiente aproximadamente a un nivel de confianza del 95 %: 𝑈= 𝑘× 𝑢𝑐
El resultado final de la valoración del hederacósido C fue expresado como: 𝑅𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑑𝑜± 𝑈
permitiendo establecer el intervalo dentro del cual se encuentra el valor verdadero del analito con el nivel de confianza establecido.
Figura 4. Diagrama de causa-efecto
5. RESULTADO Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
5.1 APTITUD DEL SISTEMA
La Figura 5 presenta los cromatogramas representativos obtenidos durante la evaluación de la aptitud del sistema para el estándar certificado de hederacósido C. Los perfiles cromatográficos evidenciaron una señal definida, simétrica y reproducible correspondiente al analito de interés, con un tiempo de retención de 6,413 minutos, ubicado dentro del intervalo especificado para el método (5–8 minutos). Este comportamiento confirma que las condiciones cromatográficas implementadas permiten una adecuada retención e identificación del hederacósido C, garantizando la selectividad inicial del sistema antes de la evaluación de los demás parámetros analíticos.
La respuesta cromatográfica obtenida presentó un área de pico de 1.272.268 unidades, indicando una adecuada sensibilidad instrumental para la detección del hederacósido C a la concentración de trabajo establecida. La estabilidad de las áreas obtenidas durante las inyecciones consecutivas refleja un desempeño adecuado del sistema de inyección, flujo constante de fase móvil y estabilidad del detector, factores críticos para asegurar la confiabilidad de los análisis cuantitativos mediante HPLC.
El factor de asimetría obtenido para el pico principal fue de 1,106, mientras que durante las inyecciones evaluadas los valores permanecieron dentro del intervalo de 1,10 a 1,19, cumpliendo con el criterio de aceptación establecido (≤2,0). Estos resultados indican una adecuada interacción entre el hederacósido C y la fase estacionaria C18, sin evidenciar fenómenos importantes de adsorción secundaria, sobrecarga de columna o distorsión del pico cromatográfico. Una adecuada simetría del pico resulta fundamental para garantizar una correcta integración del área y, por tanto, una cuantificación confiable del analito. Asimismo, los valores de eficiencia cromatográfica expresados como número de platos teóricos fueron superiores a 2000, indicando un adecuado desempeño de la columna cromatográfica y una correcta separación del hederacósido C bajo las condiciones establecidas. Este comportamiento demuestra que la fase estacionaria C18 proporcionó una interacción
apropiada con el analito, permitiendo obtener picos definidos y reproducibles.
(a) (b) Figura 5. (a), (b) cromatogramas para el estudio de la aptitud del sistema
Los resultados de las seis inyecciones consecutivas del estándar de referencia se resumen en la Tabla 2. El porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) obtenido para el área cromatográfica fue de 0,811 %, valor considerablemente inferior al criterio máximo establecido (≤2,0 %). Este bajo nivel de variabilidad demuestra una alta repetibilidad instrumental y confirma que las variaciones asociadas al sistema cromatográfico no representan una fuente significativa de error durante la valoración del hederacósido C. Adicionalmente, la consistencia observada en los tiempos de retención demuestra la estabilidad de las condiciones cromatográficas durante la secuencia analítica, especialmente en aspectos relacionados con la composición de la fase móvil, flujo, temperatura de columna y equilibrio del sistema cromatográfico. La reproducibilidad del tiempo de retención es un criterio fundamental para asegurar la correcta identificación del compuesto durante el análisis de muestras comerciales de jarabe de Hedera helix.
Los factores de asimetría obtenidos presentaron valores cercanos a la unidad, comprendidos entre 1,08 y 1,14, cumpliendo con el criterio de aceptación establecido para el método (factor de asimetría ≤ 2,0). Estos resultados evidencian una adecuada forma del pico cromatográfico y permiten una integración reproducible de la señal analítica del hederacósido C. De igual manera, los valores de platos teóricos obtenidos fueron superiores a 2000 (tabla 1) en todas las inyecciones, indicando una adecuada eficiencia de la columna cromatográfica y
estabilidad del proceso de separación. La consistencia observada en estos parámetros confirma que el sistema HPLC mantuvo un desempeño adecuado durante toda la secuencia de análisis.
tabla 1. Parámetros de aptitud del sistema obtenidos para la solución estándar de Hederacósido C (120,0 µg/mL).
Número de inyecciones Concentración Hederacósido C (µg/mL) Área Hederacósido C Promedio Desv.
Std
RSD
(%)
Factor de asimetría Relación señal/ruido Platos teóricos Resolución
1
120,0
1272268
1,1061
N.A.
2008
0,0000
2
120,0
1270732
1,1312
N.A.
2026
0,0000
3
120,0
1277675
1264642,5
10261
0,811
1,0872
N.A.
2001
0,0000
4
120,0
1248498
1,0839
N.A.
2067
0,0000
5
120,0
1253449
1,1447
N.A.
2009
0,0000
6
120,0
1264333
1,1830
N.A.
2045
0,0000
tabla 2. Resultados de la aptitud del sistema Parámetro Resultado Criterio de aceptación Concentración estándar 120,0 µg/mL — Promedio de área
1 264 642,5
— Desviación estándar
10 261
—
RSD (%)
0,811
≤ 2,0 % Factor de asimetría 1,08 – 1,18 ≤ 2,0 Platos teóricos
2001 – 2067
— Resolución
0,0000
—
El análisis cromatográfico se realizó mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en fase reversa, empleando una columna Ultisil C18 (150 mm × 4,6 mm; 5 µm) como fase estacionaria. La separación se llevó a cabo utilizando como fase móvil de agua: metanol (38: 62) a un flujo de 1,3 mL/min. La detección se realizó a 250 nm, con una temperatura de columna de 35 °C y un volumen de inyección de 20 µL. Bajo estas condiciones cromatográficas se evaluó la aptitud del sistema mediante seis inyecciones consecutivas de una solución estándar de Hederacósido C a una concentración de 120,0 µg/mL.
Los resultados obtenidos para la aptitud del sistema se presentan en la Tabla 1). Donde se observa el RSD del área de las seis inyecciones del estándar fue de 0,811%, por debajo del límite máximo permitido de 2%, demostrando una adecuada repetibilidad del sistema. De la misma manera, los factores de asimetría obtenidos (entre 1,10 y 1,19) se encuentran dentro del valor permitido (≤2,0). Seguidos de los tiempos de retención fueron consistentes y dentro
del rango especificado de 5 a 8 minutos. En conjunto, estos parámetros confirman que el sistema cromatográfico es apto para continuar con la validación del método, garantizando estabilidad, precisión y funcionamiento adecuado del equipo durante el análisis de hederacoside.
5.2 SELECTIVIDAD
5.2.1. Condiciones normales
La evaluación de la selectividad bajo condiciones normales se realizó mediante la comparación de los perfiles cromatográficos obtenidos para el placebo sin principio activo (Figura 6) y el placebo cargado con hederacósido C (Figura 7), con el propósito de determinar posibles interferencias generadas por los componentes de la matriz del jarabe durante la identificación del analito. En el cromatograma correspondiente al placebo (Figura 6) no se evidenció la presencia de señales cromatográficas en la región correspondiente al tiempo de retención del hederacósido C (5–8 minutos). Este resultado demuestra que los excipientes presentes en la formulación no generan picos interferentes ni respuestas analíticas que puedan afectar la identificación o integración del pico correspondiente al compuesto de interés. Por otra parte, el cromatograma del placebo cargado con hederacósido C (Figura 7) presentó un pico definido con un tiempo de retención de 6,390 minutos y un área cromatográfica de 1.233.474 unidades, comportamiento consistente con los resultados obtenidos para el estándar de referencia durante la evaluación de aptitud del sistema. La coincidencia del tiempo de retención confirma la correcta identificación del analito dentro de la matriz del producto terminado. Adicionalmente, el pico correspondiente al hederacósido C presentó una adecuada separación respecto a las señales provenientes de la matriz, sin observarse coelución o interferencias cercanas que pudieran afectar su cuantificación. Esto demuestra que el método HPLC posee la capacidad de diferenciar específicamente el analito frente a los componentes propios del jarabe de Hedera helix.
Los resultados obtenidos bajo condiciones normales confirman la selectividad del método analítico, garantizando que la respuesta cromatográfica utilizada para la valoración
corresponde exclusivamente al hederacósido C y no a interferencias provenientes de excipientes o componentes de la formulación.
Figura 6. cromatograma del placebo Figura 7. Cromatograma del placebo cargado
5.2.2. Condiciones extremas (placebo)
La evaluación de la selectividad bajo condiciones extremas se realizó mediante la comparación de los cromatogramas obtenidos del placebo sometido a diferentes condiciones de degradación forzada: fotólisis, hidrólisis ácida, hidrólisis básica, oxidación y termólisis (Figura 8), frente al cromatograma del placebo cargado con hederacósido C bajo condiciones normales (Figura 7). Este estudio permitió determinar si los componentes de la matriz o sus posibles productos de degradación generan señales cromatográficas que puedan interferir con la identificación del analito.
Los cromatogramas obtenidos después de someter el placebo a las diferentes condiciones de estrés evidenciaron cambios en el perfil cromatográfico asociados a la degradación o modificación de algunos componentes presentes en la formulación. Sin embargo, en ninguna de las condiciones evaluadas se observaron señales cromatográficas en la ventana correspondiente al tiempo de retención del hederacósido C (5–8 minutos). En las condiciones
de fotólisis (Figura 8a), hidrólisis ácida (Figura 8b), hidrólisis básica (Figura 8c), oxidación (Figura 8d) y termólisis (Figura 8e), los picos generados por los componentes del placebo o sus productos de degradación presentaron tiempos de retención diferentes al analito de interés, demostrando ausencia de coelución o interferencias cromatográficas que puedan afectar la integración y cuantificación del hederacósido C.
Estos resultados indican que los excipientes presentes en la formulación del jarabe, aun después de ser sometidos a condiciones severas de degradación química y física, no producen compuestos que interfieran con la señal característica del hederacósido C. Por lo tanto, el método cromatográfico demuestra una adecuada capacidad indicadora de estabilidad, permitiendo diferenciar el analito frente a posibles productos derivados de la matriz. De acuerdo con los resultados obtenidos bajo condiciones normales y extremas, se confirma la selectividad del método HPLC implementado para la identificación y valoración de hederacósido C en jarabe de Hedera helix, cumpliendo con el propósito establecido para la verificación del procedimiento analítico.
(a) ( b)
(c) (d)
(e)
Figura 8. (a)cromatograma c. extremas fotolisis. (b) cromatograma c. extremas hidrolisis acida. (c) cromatograma c. extremas hidrolisis básica. (d) cromatograma c. extremas oxidación. (e)cromatograma extremas termólisis.
5.2.3. Condiciones extremas (placebo cargado)
La selectividad del método bajo condiciones extremas fue evaluada mediante el análisis de los cromatogramas obtenidos del placebo cargado con Hedera helix sometido a diferentes condiciones de degradación forzada: fotólisis, hidrólisis ácida, hidrólisis básica, oxidación y termólisis (Figura 9). Estos resultados fueron comparados con el perfil cromatográfico obtenido para el placebo cargado bajo condiciones normales (Figura 7), con el propósito de verificar la capacidad del método para identificar el hederacósido C en presencia de posibles productos de degradación generados por estrés químico o físico.
Los cromatogramas obtenidos evidencian modificaciones en el perfil cromatográfico después de aplicar las condiciones de estrés, observándose señales adicionales asociadas posiblemente a cambios en componentes de la matriz o productos derivados de los procesos de degradación. Sin embargo, en todos los tratamientos evaluados se conservó la señal característica correspondiente al hederacósido C dentro del intervalo de retención establecido para el método (5–8 minutos), sin presencia de picos superpuestos que afectaran su identificación. En los tratamientos de fotólisis (Figura 9a), hidrólisis ácida (Figura 9b), hidrólisis básica (Figura 9c), oxidación (Figura 9d) y termólisis (Figura 9e), el pico correspondiente al hederacósido C presentó una separación adecuada respecto a las señales generadas por otros componentes presentes en la muestra. Este comportamiento demuestra que los posibles productos formados durante la degradación no presentan coelución con el analito de interés.
La conservación del tiempo de retención del hederacósido C después de los diferentes tratamientos confirma que el método cromatográfico mantiene su capacidad de identificación
específica aun cuando la muestra es sometida a condiciones que pueden favorecer procesos de degradación. Este resultado es en métodos destinados al control de calidad de productos farmacéuticos de origen vegetal, debido a la complejidad química de matrices como los extractos de Hedera helix.
(a) (b)
(c) (d)
(e) Figura 9. (a)cromatograma c. extremas fotolisis. (b)cromatograma c. extremas hidrolisis acida. (c) cromatograma c. extremas hidrolisis básica. (d) cromatograma c. extremas oxidación. (e)cromatograma extremas termólisis.
La Tabla 3 presenta los resultados obtenidos durante la evaluación de la selectividad del método bajo condiciones de degradación forzada del placebo cargado con hederacósido C. La condición normal presentó áreas cromatográficas de 1.233.474 y 1.183.486, con un promedio de 1.208.480, valor considerado como referencia para evaluar el comportamiento del analito después de ser sometido a los diferentes tratamientos de estrés. En condiciones de hidrólisis ácida (HCl 0,1 N), se obtuvieron áreas de 696.282 y 694.740, con un promedio de 695.511, correspondiente al 57,55 % de la respuesta inicial del analito. La disminución observada en el área cromatográfica evidencia una reducción de la señal del hederacósido C bajo condiciones ácidas, indicando susceptibilidad del compuesto frente a este tipo de degradación. Sin embargo, el pico del analito permaneció identificado dentro del intervalo de retención establecido, sin presentar interferencias asociadas a posibles productos generados durante el tratamiento. Para las condiciones de hidrólisis básica (NaOH 0,1 N) y
oxidación (H₂O₂ 30 %), se observaron áreas promedio de 792.916 y 781.043, equivalentes al 65,61 % y 64,63 % de la respuesta inicial, respectivamente. Estos resultados muestran una disminución parcial de la respuesta cromatográfica del hederacósido C, lo cual indica que el analito puede presentar cambios estructurales bajo condiciones alcalinas y oxidativas. No obstante, la señal cromatográfica correspondiente al compuesto de interés se mantuvo diferenciada respecto a las posibles señales provenientes de productos de degradación. Durante la exposición térmica mediante reflujo, el área promedio obtenida fue de 669.806, correspondiente al 55,43 % de la respuesta inicial, evidenciando una reducción importante del área del pico bajo condiciones de estrés térmico. Por otro lado, el tratamiento por fotólisis presentó un área promedio de 918.348, equivalente al 75,99 % de la respuesta inicial, indicando una menor afectación del analito frente a la exposición UV en comparación con los demás tratamientos evaluados. A pesar de la disminución observada en la respuesta cromatográfica bajo las diferentes condiciones de degradación, el pico correspondiente al hederacósido C permaneció claramente identificado y separado de otras señales presentes en los cromatogramas. Esto demuestra que los posibles productos generados durante los procesos de hidrólisis, oxidación, termólisis y fotólisis no presentan coelución con el analito. Los resultados obtenidos confirman que el método HPLC presenta adecuada selectividad, permitiendo la identificación específica del hederacósido C en presencia de la matriz del producto y posibles compuestos de degradación. Por lo tanto, el método cumple con los criterios establecidos para continuar con la verificación analítica aplicada a la valoración de hederacósido C en jarabe de Hedera helix.
Tabla 3. Resultados para la selectividad a condiciones extremas del placebo cargado. Condiciones de degradación Tiempo de exposición Concentración Área 1 Área 2 X̄ %Recuperación Hidrólisis ácida (HCl 0,1 N) del placebo cargado > 3 horas
120 µg/mL
696282
694740
695511
57,55 %
Hidrólisis básica (NaOH 0,1 N) del placebo cargado > 3 horas
120 µg/mL
813963
771869
792916
65,61 %
Oxidación (H₂O₂ 3 %) del placebo cargado > 3 horas
120 µg/mL
844069
718018
781043
64,63 %
Tratamiento térmico del placebo cargado
120 µg/mL
120 µg/mL
699070
634052
666906
55,43 %
Tratamiento UV del placebo cargado
120 µg/mL
120 µg/mL
794673
639447
717060
59,64 %
5.3 LINEALIDAD
5.3.1. LINEALIDAD DEL METODO
La linealidad del método para la determinación de hederacósido C se evaluó en un intervalo comprendido entre el 80 y el 120 % de la concentración de trabajo, correspondiente a concentraciones entre 97,92 y 145,83 µg/mL (tabla 4). El análisis de regresión lineal realizado con un nivel de confianza del 95 % permitió obtener la siguiente ecuación: y = 16805x − 678365 donde y corresponde a la respuesta cromatográfica (área) y x a la concentración de hederacósido C.
El valor del pendiente obtenido fue de 16805, indicando que la respuesta analítica aumenta proporcionalmente con la concentración del analito. Por su parte, el intercepto fue de −678365, valor que representa la respuesta teórica del sistema cuando la concentración es igual a cero.
El análisis estadístico mostró un coeficiente de determinación (r²) de 0,9961, lo que indica que el 99,61 % de la variabilidad observada en la respuesta cromatográfica es explicada por el modelo lineal. Asimismo, el coeficiente de correlación (r) fue de 0,9980, valor cercano a la unidad que evidencia una fuerte correlación positiva entre la concentración y la respuesta instrumental.
De acuerdo con los criterios de aceptación establecidos en la USP <1225> para procedimientos cuantitativos, los valores obtenidos de r y r² demuestran una adecuada linealidad dentro del intervalo evaluado. En consecuencia, se concluye que el método presenta una relación lineal significativa entre la concentración de hederacósido C y la respuesta cromatográfica, siendo apto para su aplicación en la cuantificación del analito en jarabe comercial de Hedera hélix.
Por lo tanto, el rango validado del método quedó establecido entre 97,92 µg/mL y 145,83 µg/mL, correspondientes al 80 % y 120 % de la concentración nominal de trabajo, respectivamente.
(a) (b)
(c) (d)
(e)
Figura 10. (a)cromatograma nivel 80% (b) cromatograma nivel 90%. (c) cromatograma nivel 100%. (d) cromatograma nivel 110%. (e) cromatograma nivel 120%.
Tabla 4. Resultados linealidad del sistema para el método (muestra). Muestra Nivel (%) Concentración (µg/mL) Áreas/Absorbancias Promedio Desv. Std
RSD (%)
1
80 %
97,924
991075
992972
2391,77
0,241
97,924
992183
97,924
995659
2
90 %
108,962
1114847
1130640
15657,31
1,385
108,962
1130915
108,962
1146158
3
100 %
121,458
1331177
1346072
13225,31
0,983
121,458
1350600
121,458
1356438
4
110 %
133,639
1560610
1567033
6172,48
0,394
133,639
1567569
133,639
1572920
5
120 %
145,831
1785802
1786060
2328,74
0,130
145,831
1783871
145,831
1788507
Tabla 5. Parámetros estadísticos de la linealidad del sistema Parámetro Resultado Criterio de aceptación Coeficiente de correlación (r)
0,9980
≥ 0,99 Coeficiente de determinación (r²) 0,9961 ≥ 0,98
ANALISIS DE LA VARIANZA DE LA LINEALIDAD
NIVEL DE CONFIANZA
95%
Y Intercept:
-678365
Pendiente:
16805
Coeficiente de determinación r2:
0,9961
Coeficiente de correlación r:
0,9980
Figura 11. curva de calibración para la linealidad del método.
y = 16805x - 678365 R² = 0,9961
900000
1400000
1900000
90,000
100,000
110,000
120,000
130,000
140,000
150,000
Areas cormatograficas correspondientes concentracion de hederacóside C
LINEALIDAD DEL METODO
5.4 PRECISIÓN (SISTEMA, METODO Y INTERMEDIA)
La presión del sistema y la presión del método se evalúo con el mismo analista verificando la repetibilidad del sistema cromatográfico y comprobar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos al analizar preparaciones independientes de la muestra bajo condiciones experimentales. A partir de seis inyecciones del estándar de hederacósido C al 100 % de la concentración nominal (120,0 µg/mL de hederacósido C). los resultados (tabla 6 y tabla 7) demuestran la repetibilidad del sistema cromatográfico y del método ya que los valores de RSD≤ 2,0 %, para la precisión del sistema (1,32 %) y la precisión del método (0,95%). La precesión intermedia se llevó a cabo usando en diferentes días y diferentes analistas. Los datos obtenidos (tabla 8 y tabla 11) comprueban la precisión para el método cromatográfico ya que el RSD≤ 2,0 % para el analista 1 y analista 2 no fue mayores al 2%. Tabla 6. Resultados de áreas obtenidas por números de inyección (precisión del sistema).
%
NUMERO DE INYECCIONES
AREAS/ABSORBANCIAS
%C.V ≤ 2,0
100%
1
1455670
1,32
2
1495939
3
1482341
4
1480312
5
1455834
6
1446684
PROMEDIO
1469463
Tabla 7. Resultados de áreas obtenidas por números de inyección (precisión del método).
REPETIBILIDAD DEL METODO
CONCENTRACIÓN
AREAS/ABSORBANCIAS
PROMEDIO
DESVSTD RSD
100%
1498336
1478022
13980,68 0,95
100%
1461401
100%
1468970
100%
1486602
100%
1489120
100%
1463700
tabla 8. Resultados de la precisión intermedia día 1
ANALISTA 1 DÍA 1
AREA/ABSORBANCIAS STD
PROMEDIO
RSD
AREA/ABSORBANCIAS
MUESTRA
PROMEDIO
RSD
1
1247749
1223784
1,53
1278982
1254851
1,37
1202166
1239921
1221438
1245649
2
1239634
1242040
0,55
1233001
1237205
0,44
1235092
1233669
1251395
1244946
tabla 9. Resultados de recuperación analista 1
ANALISTA 1 DIA 1
MUESTRA
% TEORICO
% RECUPERADO
1
10%
10,52%
2
10%
10,44%
Tabla 10 Análisis estadístico analista 1 Parámetro Valor Número de valores
2
Número de valores usados para el cálculo
2
Nivel de confianza
99,5 %
Promedio de valores
10,48 %
Intervalo de confianza (±)
0,00224
Varianza del grupo
0,00000
% Coeficiente de variación (CV)
0,50449
Resultado Aceptado
Tabla 11. Resultados de la precisión intermedia día 2
ANALISTA 2 DÍA 2
ESTANDAR
AREA/ABSORBANCIAS STD
PROMEDIO
RSD
AREA/ABSORBANCIAS
MUESTRA
PROMEDIO
RSD
1
1260139
1240309
1,14
1262418
1261186
0,41
1228578
1254311
1232209
1266828
2
1230396
1220634
0,57
1272711
1277111
0,90
1214876
1265797
1216631
1292824
ANALISTA 2 DIA 2
MUESTRA
% TEORICO
% RECUPERADO
1
10%
10,51%
2
10%
10,57%
Tabla 12 .Análisis estadístico analista 2
NUMERO DE VALORES:
2
NUMERO DE VALORES USADOS PARA EL CACULO:
2
NIVEL DE CONFIANZA:
99,5
PROMEDIO DE VALORES:
10,54%
INTERVALO DE CONFIANZA (+/-):
0,00189
VARIANZA DEL GRUPO:
0,00000
% COEFICIENTE DE VARIACION (%CV):
0,42729
5.5 ROBUSTEZ DEL METODO
Este parámetro se determinó modificando la temperatura de prueba de 35° C a 30 ° C, el flujo de 1,3mL / minuto a 1,2 mL / minuto, el volumen de inyección de 20µL a 18 µL y cambio de equipo cromatógrafo, los datos obtenidos se presentan en la tabla 13 y tabla 14. El método es robusto para los cambios en la temperatura, flujo y cambio de equipo evaluado, garantizando en todos los casos la adecuabilidad del sistema y el cumplimiento de los criterios de aceptación del método.
Analista 1. equipo utilizado
EQUIPO HPLC
HPLC MERCK HITACHI (HPLCL-021-SAF)
COLUMNA HPLC
ULTISIL C18, 150 mm x 4,6 mm x 5um
Analista 2. equipo utilizado
EQUIPO HPLC
HPLC SHIMADZU (HPLCS-020-SAF)
COLUMNA HPLC
ULTISIL C18, 150 mm x 4,6 mm x 5um
Tabla 13. Resultados robustez del método analista 1
ANALISTA 1
ESTANDAR
AREA/ABSORBANCIAS STD
PROMEDIO
RSD ≤ 2%
AREA/ABSORBANCIAS
MUESTRA
PROMEDIO
RSD ≤ 2%
1
1247749
1223784
1,53
1278982
1254851
1,37
1202166
1239921
1221438
1245649
2
1239634
1242040
0,55
1233001
1237205
0,44
1235092
1233669
1251395
1244946
ANALISTA 1
MUESTRA
% TEORICO
% RECUPERADO
1
10%
10,52%
2
10%
10,44%
PROMEDIO
10,48%
DESV STD
0,00037
RSD ≤ 2%
0,357
CALCULO:
mg/100mL:
Am x Wstd x [std] x FD x F x PE % Recuperacion.
mg/100mL obtenido x 100 Astd x Wmta mg/100mL teorico *100
Tabla 14. Resultados robustez del método analista 2
ANALISTA 2
ESTANDAR
AREA/ABSORBANCIAS STD
PROMEDIO
RSD ≤ 2%
AREA/ABSORBANCIAS
MUESTRA
PROMEDIO
RSD ≤ 2%
1
347321
346909
0,17
347278
347693
0,10
346083
347679
347323
348121
2
345344
345022
0,07
344533
343678
0,19
344832
342923
344889
343579
ANALISTA 2
MUESTRA
% TEORICO
% RECUPERADO
% RECUPERADO
1
10%
10,50%
ANALISTA 1
10,48%
2
10%
10,44%
ANALISTA 2
10,47%
PROMEDIO
10,47%
PROMEDIO
10,47%
DESV STD
0,00030
DESV STD
0,00005
RSD ≤ 2%
0,290
RSD ≤ 2%
0,05186
5.6 EXACTITUD DEL METODO
El parámetro de exactitud fue evaluado respecto al estándar de referencia con un mínimo de nueve determinaciones sobre tres niveles de concentración 96µg/mL, 120µg/mL y 144µg/mL de hederacósido C.
Los resultados obtenidos (tabla 15) determinan que la metodología cumple con los criterios de aceptación del protocolo, ya que los porcentajes de recuperación se encuentran dentro del rango establecido de 98% -102% para cada uno de los niveles y la desviación estándar es menos o igual al 2%.
Tabla 15 . resultados para la exactitud del método
CONCENTRACION
AREAS/ABSORBANCIAS
%
RECUPERADO
(98% -102%)
PROMEDIO
PROMEDIO
TOTAL
DESV STD
RSD
80%
988455
101,091
101,016
100,372
0,5764
0,574
996967
101,082
995485
100,874
100%
1227560
100,035
100,482
1238153
100,900
1233324
100,512
120%
1556931
99,622
99,617
1542679
99,522
1507509
99,707
5.5. Evaluación de la incertidumbre
La estimación de la incertidumbre asociada a la valoración de hederacósido C por HPLC permitió identificar y cuantificar las principales fuentes de variabilidad del método analítico. La incertidumbre estándar combinada relativa fue de 2,34 %, mientras que la incertidumbre expandida fue de 4,68 %, empleando un factor de cobertura k = 2, equivalente aproximadamente a un nivel de confianza del 95 %.
Para la concentración nominal de trabajo de 120,0 µg/mL, la incertidumbre expandida correspondió a ±5,62 µg/mL, por lo que el resultado puede expresarse como 120,0 ± 5,62 µg/mL. Este intervalo representa el rango dentro del cual se espera encontrar el valor verdadero del analito bajo las condiciones establecidas del método. La Figura 15 presenta la contribución relativa estimada de las principales fuentes de incertidumbre involucradas en la valoración de hederacósido C mediante HPLC. Las fuentes consideradas incluyen aquellas asociadas al desempeño analítico del método, preparación de t exp (-100) x √n
DESVSTD
DESVSTD:
0,5764
t tab+/- 2,3060
PROMEDIO:
100,372
CALCULOS
t exp (100,371-100) x √9
0,5764
RESULTADO
t exp:
1,934
LA EXACTITUD DEL METODO DEBE ESTAR ENTRE EL RANGO DEL 98 Y 102%, LO QUE DEMUESTRA QUE EL METODO ES EXACTO EN
TODO RANGO DE CONCENTRACIONES
soluciones, equipos utilizados y materiales de referencia empleados durante el proceso de cuantificación.
La mayor contribución estuvo asociada con la precisión del método (45 %) equivalente a un aporte aproximado de 1,05 % dentro de la incertidumbre estándar combinada, relacionada principalmente con la variabilidad experimental generada durante la preparación independiente de muestras, repetibilidad de las inyecciones, respuesta cromatográfica e integración del área del pico. Esta contribución representa principalmente una incertidumbre tipo A, obtenida a partir del análisis estadístico de mediciones repetidas durante la verificación del método.
La exactitud del método (25 %; 0,59 % sobre la incertidumbre combinada) representó la segunda fuente de mayor contribución, asociada con la recuperación del hederacósido C en la matriz del jarabe de Hedera helix. Esta variabilidad puede estar influenciada por la interacción del analito con los componentes de la formulación, procesos de dilución, extracción y preparación de muestra.
La preparación de soluciones aportó aproximadamente un 15 % de la contribución total, equivalente a 0,35 % dentro de la incertidumbre combinada, debido a las etapas sucesivas de transferencia, aforo y dilución necesarias para obtener las concentraciones de trabajo. las contribuciones relacionadas con el material volumétrico (8 %), pesada del estándar (5 %) y pureza del estándar certificado (2 %) presentaron menor influencia sobre la incertidumbre global, con aportes aproximados de 0,19 %, 0,12 % y 0,05 %, respectivamente. La baja contribución de estos factores demuestra la importancia del uso de equipos calibrados, material volumétrico adecuado y sustancias de referencia certificadas para disminuir fuentes sistemáticas de variabilidad.
Figura 15. Contribución de fuentes de incertidumbre
Los resultados obtenidos para los tres niveles de concentración evaluados muestran que la incertidumbre absoluta aumenta proporcionalmente con la concentración del analito, pasando de ±4,49 µg/mL en el nivel bajo (96 µg/mL) hasta ±6,74 µg/mL en el nivel alto (144 µg/mL). Este comportamiento es esperado debido a que la incertidumbre fue expresada como una contribución relativa del proceso analítico.
La incertidumbre expandida relativa estimada fue de ±4,68 % (k=2) para los tres niveles evaluados, indicando que el método mantiene un comportamiento proporcional dentro del intervalo de trabajo establecido. Este resultado es consistente con el desempeño observado durante la evaluación de linealidad, precisión y exactitud, donde se evidenció una adecuada relación entre concentración y respuesta cromatográfica.
La evaluación global de incertidumbre demuestra que las principales fuentes de variabilidad corresponden al procedimiento analítico y no al desempeño instrumental, lo cual concuerda con los resultados obtenidos en la aptitud del sistema, donde el %RSD del área cromatográfica fue inferior al criterio establecido. En consecuencia, el método HPLC implementado proporciona resultados confiables para la valoración de hederacósido C en jarabe de Hedera helix dentro del intervalo analítico evaluado.
Tabla 16. Incertidumbre expandida estimada para los niveles de concentración evaluados de hederacósido C.
Nivel evaluado Concentració n (µg/mL) Incertidumbre relativa expandida (%) k=2 Incertidumbre expandida (µg/mL) Expresión del resultado Bajo (80
%)
96
±4,68 ±4,49 96,0 ± 4,49 µg/mL Medio
(100 %)
120
±4,68 ±5,62 120,0 ± 5,62 µg/mL Alto
(120 %)
144
±4,68 ±6,74 144,0 ± 6,74 µg/mL
5.6. Verificación del método analítico frente a los criterios establecidos por USP 1224-
1225
La Tabla 17 presenta el resumen comparativo entre los criterios establecidos para los parámetros de desempeño analítico según los lineamientos de USP 1224-1225 y los resultados obtenidos durante la verificación del método HPLC para la identificación y valoración de hederacósido C en jarabe de Hedera helix. Los resultados obtenidos evidencian el cumplimiento de los criterios de aceptación establecidos, demostrando que el procedimiento analítico implementado presenta características adecuadas de confiabilidad, reproducibilidad y capacidad cuantitativa.
En relación con la aptitud del sistema, se obtuvo un porcentaje de desviación estándar relativa para el área cromatográfica de 0,811 %, valor inferior al criterio máximo permitido (%RSD ≤2,0 %). Adicionalmente, los factores de asimetría obtenidos estuvieron entre 1,08 y 1,14, cumpliendo con el criterio establecido (≤2,0), y los platos teóricos fueron superiores a 2000, confirmando un adecuado desempeño cromatográfico, estabilidad instrumental y eficiencia en la separación del hederacósido C.
La evaluación de selectividad demostró ausencia de interferencias provenientes del placebo, matriz del producto y posibles productos de degradación generados bajo condiciones de estrés. En todos los casos evaluados, el pico correspondiente al hederacósido C permaneció identificado dentro del intervalo de retención establecido (5–8 minutos), con un tiempo de retención aproximado de 6,39 minutos, sin evidencia de coelución. Estos resultados cumplen
con el criterio establecido por USP <1225> para demostrar la capacidad del método de medir específicamente el analito de interés.
Para la linealidad, el método fue evaluado dentro del intervalo comprendido entre 80 y 120 % de la concentración nominal, correspondiente a concentraciones entre 96 y 144 µg/mL de hederacósido C. La respuesta cromatográfica presentó un comportamiento proporcional dentro del rango evaluado, cumpliendo con el criterio establecido para la aplicación cuantitativa del procedimiento analítico.
Los estudios de precisión confirmaron la reproducibilidad del método bajo las condiciones evaluadas. La precisión instrumental presentó un %RSD de 1,32 %, cumpliendo ampliamente el criterio establecido (≤2,0 %), demostrando baja variabilidad entre inyecciones consecutivas y estabilidad de la respuesta cromatográfica durante el análisis. La exactitud del método fue confirmada mediante estudios de recuperación realizados en tres niveles de concentración: bajo (96 µg/mL), medio (120 µg/mL) y alto (144 µg/mL), cubriendo el intervalo analítico establecido. Los resultados obtenidos cumplieron con el criterio de aceptación definido para recuperación y variabilidad del método (%RSD ≤2 %), evidenciando una adecuada concordancia entre la concentración adicionada y la concentración determinada experimentalmente.
La robustez del procedimiento fue comprobada mediante modificaciones controladas en las condiciones cromatográficas, incluyendo variación del flujo de fase móvil (1,2 mL/min), temperatura de columna (30 °C), volumen de inyección (18 µL) y cambio de equipo cromatográfico. La ausencia de cambios relevantes en la respuesta analítica confirma que el método mantiene un desempeño adecuado frente a pequeñas variaciones operacionales. Adicionalmente, la evaluación de incertidumbre permitió complementar la verificación del desempeño analítico, obteniéndose una incertidumbre estándar combinada relativa de 2,34 % y una incertidumbre expandida de ±4,68 % (k=2; 95 % de confianza). Para la concentración nominal evaluada (120,0 µg/mL), el resultado corresponde a 120,0 ± 5,62 µg/mL, estableciendo un intervalo confiable asociado al resultado de medición. De acuerdo con la comparación presentada en la Tabla 13, todos los parámetros evaluados cumplen los criterios establecidos, confirmando que el método HPLC implementado es adecuado para su propósito analítico y puede ser empleado de manera confiable para la
identificación y valoración rutinaria de hederacósido C en productos terminados tipo jarabe de Hedera helix.
Tabla 17. Cumplimiento de los parámetros de desempeño del método analítico según USP
1224-1225.
Parámetro evaluado Referencia
USP
Criterio de aceptación establecido Resultado obtenido Cumplimiento Aptitud del sistema
USP
<1224>/<1225> %RSD de áreas ≤ 2,0 %. Factor de asimetría ≤ 2,0. Platos teóricos adecuados para la separación %RSD área = 0,811 %.
Factor de asimetría = 1,08– 1,14. Platos teóricos >2000 Cumple Selectividad / especificidad
USP <1225>
Ausencia de interferencias de matriz, excipientes o productos de degradación en el tiempo de retención del analito No se observaron interferencias en la ventana de retención del hederacósido C (5–8 min). El analito permaneció separado bajo condiciones normales y degradación forzada Cumple Linealidad
USP <1225>
Respuesta proporcional entre concentración del analito y señal cromatográfica dentro del intervalo evaluado.
Coeficiente de determinación adecuado (r² ≥ 0,99) Curva evaluada entre 80–120 % de concentración nominal (96–144 µg/mL). r² =
(0,9961,)
Cumple Precisión del sistema
USP <1225>
Evaluación de repetibilidad mediante inyecciones consecutivas.
%RSD ≤ 2,0 %
Seis inyecciones consecutivas del estándar con %RSD =
1,32 %
Cumple Precisión del método (repetibilidad)
USP <1225>
Baja dispersión entre preparaciones independientes. %RSD ≤
2,0 %
Seis preparaciones independientes evaluadas.
%RSD = 0,95%
Cumple Precisión intermedia
USP <1225>
Resultados reproducibles entre diferentes analistas/días. %RSD ≤ 2,0–3,0 % según protocolo Evaluación entre analistas y días diferentes. %RSD =
(0,43%)
Cumple Exactitud
USP <1225>
Recuperación adecuada del analito en niveles bajo, medio y alto (80,
100 y 120 %). %RSD
recuperación ≤2 % Evaluada a 96, 120 y 144 µg/mL. Recuperación promedio = (0,57%) Cumple Robustez
USP <1225>
El método no debe verse afectado significativamente por pequeñas variaciones Evaluada mediante cambios de flujo (1,2 mL/min), temperatura (30 °C), volumen de inyección (18 µL) y equipo HPLC Cumple
deliberadas de las condiciones analíticas Incertidumbre de medición Enfoque complementario metrológico Determinar intervalo de confianza asociado al resultado analítico Incertidumbre expandida relativa = ±4,68 % (k=2, 95
%).
Cumple
6. CONCLUSIÓNES
• Se verificó satisfactoriamente la metodología analítica para la valoración e
identificación de Hederacósido C en jarabe comercial de Hedera helix mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), demostrando que el método es adecuado para su aplicación en el análisis del producto y cumple con los lineamientos establecidos en las guías USP <1224> y USP <1225>.
• Se logró estandarizar la técnica cromatográfica para la identificación y
cuantificación de Hederacósido C, estableciendo condiciones analíticas que permitieron obtener una adecuada separación cromatográfica, tiempos de retención consistentes y respuestas reproducibles, garantizando la confiabilidad de los resultados obtenidos.
• La evaluación de los parámetros de calidad analítica demostró que el método
presenta linealidad, precisión, exactitud, robustez e incertidumbre adecuadas para su propósito analítico. Los resultados obtenidos cumplieron con los criterios de aceptación establecidos, confirmando que el método es confiable para la valoración e identificación de Hederacósido C en jarabe comercial de Hedera hélix.
7. BIBLIOGRAFÍA
Aya A. Shokry, D. W. (2025). In-depth molecular assessment of Hedera helix's L. α – Hederin & Hederacoside C as a gastroprotective & a possible safe Omeprazole phytoalternative in ethanol-induced gastric ulcer mice model.
International Immunopharmacology, 2-15.
Aya A. Shokry, R. A.-S. (2022). Anti-arthritic activity of the flavonoids fraction of ivy leaves (Hedera helix L.) standardized extract in adjuvant induced arthritis model in rats in relation to its metabolite profile using LC/MS. Biomedicine & Pharmacotherapy, 1-
9.
Aya A. Shokry, R. A.-S. (2022). Bioactive phenolics fraction of Hedera helix L. (Common Ivy Leaf) standardized extract ameliorates LPS-induced acute lung injury in the mouse model through the inhibition of proinflammatory cytokines and oxidative stress. Heliyon, 2-12.
Bezruk, I. (2020). Phytogeographical profiling of ivy leaf (Hedera helix L.). Industrial Crops and Products, 12.
Ceballos, E. L. ( 2015). QUIMICA ANALITICA III. En E. L. Ceballos, QUIMICA
ANALITICA III.
İçim Gökkaya a, N. Y. (2024). Evaluation of Hedera species as herbal medicine raw materials. Natural Product Research, 9.
Kim, S. &. (2014). Determination of saponins and flavonoids in ivy leaf extracts using HPLC-DAD. Phytochemical Analysis, 6.
Korany, E.-G. A. (2024). Determination of hederacoside C using validated HPLC and UPLC method. Phytochemical Analysis, 9.
Maya Alejandra Parga, N. A. (2022). Validación de método cromatográfico por HPLC de la valoración e identificación 1-(1β,16α)-21-(acetiloxi)-11-hydroxi-2´-metill-5´Hpregna-1,4-dieno[17,16-d]. Artículo original producto de la investigación, 2-21. Mohamed A. Korany, R. M. (2024). A synergistic chemometric combination for whiteness and greenness assessed HPLC-DAD assay of aqueous extracts of ivy and thyme and potassium sorbate in a syrup formula. Microchemical Journal, 2-12.
PASTOR, J. J. (2016). DETERMINACIÓN DEL EFECTO ANTIBACTERIANO IN . peru: https://repositorio.ucsm.edu.pe/server/api/core/bitstreams/fdb900e5-0f6f-4927a45b-c5b4aff9dc25/content.
Rodica Tatia, I. T. (2023). In vitro antiproliferative activity of triterpenoid saponins from leaves of Hedera helix L. grown in Romania. South African Journal of Botany, 7-7. Shoaib Hussain, H. A. (2024). Enviro-economic sustainability of ivy leaf powder extraction process based on Phyto-geographic variation of hederacoside C in Hedera helix L. leaves: A lab scale study. Sustainable Chemistry and Pharmacy, 17. USP-NF <1225> América, F. d. (2026). General Chapter, <1225> Validación de procedimientos farmacopeicos.
Obtenido de
USP-NF:
https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-E2C6F9E8-EA71-4B72-A7BA- 76ABD5E72964_4_es-ES
Cita: Villorina Londoño, Valery Juliana (2026), Verificación de un método analítico por cromatografía líquida de alta eficiencia para la valoración e identificación de hederacósido c en jarabe de hedera helix bajo lineamientos USP -1224-1225, Universidad de Córdoba, p. N. https://repositorio.unicordoba.edu.co/handle/ucordoba/11539